재조합 항체 생산용 CHO 배양 배지에서 dipeptide가 미치는 영향

김수민 인하대학교 대학원 2026 국내석사

Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are widely utilized in the production of recombinant biopharmaceuticals due to their suitability for large-scale commercial manufacturing. Because the composition of the culture medium critically influences cell growth and productivity, it is essential to develop medium formulations optimized for specific cell lines. Recently, the development of chemically defined media (CDM), in which all components are clearly specified, has gained increasing importance. CDM provides a consistent culture environment, eliminates the use of animal-derived materials, and thereby minimizes the risk of viral contamination, making it advantageous for quality control and regulatory compliance. In this study, a Design of Experiment (DoE) approach was employed to efficiently optimize the component concentrations of a CDM formulation for CHO-DG44 cells. To accelerate the optimization of numerous medium components, both basal and feed media were divided into five groups according to the physicochemical characteristics of their components, and DoE was conducted on these five grouped factors. For basal medium optimization, a Fractional Factorial Design (FFD) was applied directly without a preceding Plackett–Burman Design (PBD), since the number of factors was significantly reduced through grouping. Subsequently, a Central Composite Design (CCD) was implemented for further optimization, resulting in a 158% increase in Peak Viable Cell Density (PVCD) compared with the initial medium formulation. For feed medium optimization, an FFD was also conducted for the five grouped factors, yielding a 146% improvement in PVCD and a 400% increase in antibody titer compared with batch culture. Collectively, these results demonstrate the successful development of basal and feed media capable of supporting enhanced cell growth and productivity in fed-batch CHO cell cultures. Basal medium for CHO‑DG44 cultivation often contains poorly soluble amino acids such as tyrosine, requiring acidic or additive-assisted dissolution, and cystine, which remains nearly insoluble at neutral pH and can precipitate feed media, reduce cysteine bioavailability, and compromise formulation stability. To address these challenges, a Design of Experiments (DoE) approach was used to develop basal and feed media whereby highly soluble dipeptides replaced or supplemented L‑tyrosine and L‑cystine in this study. Media performance was assessed through viable cell density (VCD), viability, and recombinant protein titer, while critical quality attributes of charge variant distribution and aggregation were monitored to ensure product integrity. In this study, replacement experiments were conducted by gradually increasing the proportion of dipeptides in place of free amino acid forms of tyrosine and cystine in the basal medium. When L-tyrosine was replaced with GY and AY dipeptides, viable cell density (VCD) comparable to or higher than that of the control was observed, indicating that these dipeptides can support early cell growth. This effect is considered to be related to the uptake and utilization characteristics of GY and AY dipeptides. In contrast, replacement of L-cystine with AC and KC dipeptides resulted in similar or lower VCD compared to the control, suggesting limitations in supporting early cell growth. Based on these observations, L-tyrosine dipeptides can be considered effective alternatives in the basal medium, whereas partial replacement of L-cystine is more appropriate than complete substitution. Subsequently, experiments were conducted in the feed medium to replace free amino acids with dipeptide forms or to eliminate problematic amino acids. To address limitations associated with high-concentration fed-batch culture media, the total amount of amino acids supplied through the feed medium during the culture period was calculated and supplemented in advance into the basal medium in the form of dipeptides, while the corresponding amino acids were excluded from the feed medium. The results showed that tyrosine dipeptides supported cell growth, whereas cystine dipeptides contributed to improvements in cell-specific productivity. These findings indicate that differences in dipeptide transport and enzymatic cleavage characteristics can influence cellular responses. Overall, the use of dipeptides represents a feasible approach to mitigating solubility and stability issues in high-concentration fed-batch culture media and provides an effective strategy for improving biopharmaceutical production. Chinese Hamster Ovary (CHO) cell은 대규모 상업적 생산에 적합하여, 현재 재조합 바이오의약품 분야에서 널리 사용되고 있다. 세포 배양에 이용되는 배양 배지의 경우 세포 성장과 생산에 중요한 영향을 미치기 때문에 세포주마다 적합한 배지를 개발하는 것이 필요하다. 최근에는 모든 조성이 정의되어 있는 Chemically Defined Media (CDM) 개발이 중요해지고 있다. CDM 배지는 성분 인자가 명확하기 때문에 일관된 세포 배양 환경 제공이 가능하고, 동물 유래 성분을 사용하지 않아 바이러스 오염 위험이 낮아 품질 관리 및 규제에 적합하다. 본 연구에서는 Design of Experiment (DoE)를 사용하여 효율적으로 CHO-DG44에 대한 CDM 성분 인자 농도 최적화를 진행하였다. 더 빠르게 많은 성분 인자를 최적화하기 위해, Basal media와 feed media 모두 수십 가지의 배지 성분을 각 성분 인자의 특성에 맞게 5개로 그룹화하여 5개의 인자에 대해 DoE를 진행하였다. 먼저 basal media의 경우, 그룹화를 통해 인자 수를 크게 줄였기 때문에 Screening 단계에서 Placket-Burman Design (PBD)를 진행하지 않고, Fractional Factorial Design (FFD)를 진행하였다. 이어서 optimization을 위해 Central Composite Design (CCD)를 진행하여 초기 배지 대비 최종적으로 158% 증가한 Peak Viable Cell Density (PVCD)를 얻어 성공적으로 배지 개발을 진행하였다. Feed media 또한 5개의 인자에 대해 Fractional Factorial Design (FFD)를 진행하였고, batch culture와 비교하여 146% 증가한 PVCD와 400% 증가한 antibody titer를 얻어 fed-batch culture에서 성장 및 생산 지원 가능한 feed media를 개발하였다. CHO-DG44 세포 배양에 사용되는 media에는 잘 녹지 않는 아미노산이 포함 되어 있다. tyrosine은 알칼리성 조건이나 첨가제를 이용해야 용해할 수 있으 며, cystine은 중성 pH에서 거의 녹지 않아 feed 배지에서 침전이 생길 수 있 고, 이에 따라 시스테인의 이용률을 떨어뜨리며 제형 안정성에도 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구에서는 앞서 개발한 basal 배지와 feed 배지에 포함된 L- tyrosine과 cystine을 용해도가 높은 dipeptides로 대체하 거나 보완하였다. 배지 성능은 생존 세포 밀도(VCD), 세포 생존율, 그리고 재 조합 단백질 생산량으로 평가되었으며, product의 quality를 보장하기 위해 charge variant와 aggregation과 같은 critical quality attributes(CQA)도 함 께 모니터링하였다. basal medium에서 free amino acid 형태의 tyrosine과 cystine를 각각의 dipeptides로 비율을 점차 높여 대체 실험을 진행하였다. L-tyrosine을 GY (Glycyl-L-tyrosine)및 AY (Alanyl-L-tyrosine) dipeptides로 대체한 조 건에서는 control과 유사하거나 높은 VCD를 나타내어 초기 세포 성장 지원이 가능함을 확인하였다. 이는 GY 및 AY dipeptides의 빠른 흡수 및 이용 특성과 관련된 것으로 판단된다. 반면 L-cystine을 AC (Alanyl-L-cystine) 및 KC (Lysyl-L-cystine) dipeptides로 대체한 경우에는 흡수 속도가 느려 control 대비 유사하거나 낮은 VCD를 보였으며, 초기 세포 성장 측면에서는 한계를 나 타냈다. 이러한 결과를 종합하면, L-tyrosine dipeptides는 basal medium에 서 효과적인 대체원이 될 수 있는 반면, L-cystine의 경우 완전 대체보다는 부 분 대체 전략이 적합할 것으로 판단된다. 다음으로는 feed medium에서 free amino acid 형태를 dipeptides 형태로 대 체하는 실험을 진행하였고, 다른 하나는 feed medium에서 문제가 되는 아미노 산을 제거하고자 하였다. 이를 위해 배양 기간 동안 첨가되는 feed medium 내 해당 아미노산 농도를 계산하여 dipeptides 형태로 미리 basal medium에 첨가 하고, feed medium에서는 해당 아미노산을 제거하는 조건을 진행하여 고농축 배양 배지에서의 한계를 해결하고자 하였다. 실험 결과 tyrosine dipeptides는 세포 성장률을, cystine dipeptides는 세포 특이적 생산성을 상대적으로 향상시 키는 경향을 보였다. 이는 dipeptides 수송 및 효소적 절단 특성 차이에 따른 결과로, 동일 아미노산 유래 dipeptides라 하더라도 적용 목적에 따라 선택적 사용이 필요함을 시사한다. 전반적으로 본 연구에서는 dipeptides 사용이 high concentration fed-batch 배양 배지에서 발생하는 용해도와 안정성 문제를 해결할 수 있는 발전 가능성 있는 전략임을 보여주며, 효율적인 바이오의약품 생산을 위한 새로운 접근을 제 시하였다.

The roles of Nav1.2 sodium channel in C9orf72 ALS

조윤희 성균관대학교 일반대학 2023 국내석사

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which is well known as Lou Gehrig’s disease, is a severe selective motor neuron death neurodegenerative disease untreatable. One of the related genes is C9orf72 gene, the most common reason of ALS. In the first intron of that gene, GGGGCC expansion induced five types of hexanucleotide repeat. They are reported that can contribute to not only ALS but also frontotemporal dementia (FTD). Because of this, C9orf72 mutation has come up as a severe issue of neurodegenerative diseases. One of the five poly-dipeptides, proline-arginine (PR) poly-dipeptides are reported most toxic and detected lots of C9orf72 ALS patients. In previous study, I reported that PR poly-dipeptides induced selective hyperexcitability to primary motor cortex layer 5 motor neuron via Nav1.2-β1-β4 complex. Here, I described that PR poly-dipeptides made hyperexcitability time dependently only in primary motor cortex layer 5 pyramidal neurons by modulation persistent sodium current and its effects are irreversible. PR20’s long-term effects to cell’s channel function were toxic and even spontaneous firing was observed. Interestingly, chelating Ca2+ could preventedhyperexcitability induced from PR20 and so do increased persistent sodium current. Moreover, control of redox state prevented excess hyperexcitability which kept increased due to PR20 time dependently. Taken together, this study suggests detail effects of PR20 and a clue which leads a mechanism of PR poly-dipeptides with other related cellular toxic factors.

Structure-antioxidant activity study of caffeoyl dipeptides and synthesis and bioactive compounds as antioxidant and tyrosinase inhibitor

곽선영 서울대학교 대학원 2012 국내박사

Various bioactive compounds were modified by peptide conjugation for enhancing their biological activity. In the first part, caffeoyl dipeptide derivatives were prepared to give sufficient stability and synergistically enhanced antioxidant activity. When carnosine (β-alanine-histidine) was conjugated to caffeic acid (CA), they showed good antioxidant activity in both hydrophilic and hydrophobic assay system. In addition, we found that caffeoyl proline-histidine (CA-Pro-His) showed the excellent antioxidant activity amongst a small library of caffeoyl histidine-containing dipeptides (CA-His-Xaa, CA-Xaa-His) and caffeoyl proline dipeptides (CA-Pro-Xaa). NMR study confirmed that CA-Pro-His mostly existed as s-cis conformation. We assumed that proline afforded a structural benefit, and thus, histidine imidazole might stabilize semi-quinone radicals of CA after hydrogen atom abstraction. In addition, CA-Pro-His revealed no cytotoxicity and showed antioxidant activity in cell systems. In the second part, we designed and synthesized bioactive compounds having both antioxidant and tyrosinase inhibition activity. Expecting a synergistic effect, we synthesized a conjugated form of caffeoyl amino acidyl hydroxamic acid (CA-Xaa-NHOH). They acted as both a good antioxidant and tyrosinase inhibitor, in particular, when CA was conjugated with proline or amino acids having aromatic ring like phenylalanine. Various hydroxycinnamic acid derivatives were further conjugated with phenylalanyl hydroxamic acid and prolyl hydroxamic acid (HCA-Phe-NHOH, HCA-Pro-NHOH). When their biological activities were evaluated, CA-Pro-NHOH turned out to be the best antioxidant molecule in both hydrophilic and hydrophobic environments, and also a good tyrosinase inhibitor. In addition, CA-Pro-NHOH showed mild anti-melanogenesis activity in Mel-Ab cells without cytotoxicity. From these studies, we found that amino acid or peptide conjugated antioxidants and tyrosinase inhibitors could be a good starting point for further refinement as well as potentially useful bioactive compounds in the fields of medicine, agriculture, and cosmetic industry.

The roles of sodium channels in the pathogenesis of C9orf72 ALS

이혜윤 성균관대학교 일반대학원 2025 국내석사

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by the progressive degeneration of upper and lower motor neurons, ultimately leading to muscle weakness, paralysis, and death. Among the various genetic mutations associated with ALS, the hexanucleotide repeat expansion in the C9orf72 gene represents the most common genetic cause. This mutation results in the production of toxic dipeptide repeat proteins, including poly-proline-arginine (PR) poly-dipeptides. Previously, it was shown that the PR poly-dipeptides induce motor neuron-specific hyperexcitability in primary motor cortex layer 5 motor neuron of 7-week-old mice by increasing sodium currents conducted by the Nav1.2/β4 sodium channel complex. However, it remains unclear whether this selective hyperexcitability is affected by aging. Here, using electrophysiological studies on cultured cortical motor neurons and acute motor cortex slices of young and adult mice, I showed that PR20-induced hyperexcitability was distinct in young adult mice and cultured motor neurons at comparable stages but not in immature or aged neurons. To identify the mechanisms of age-dependent PR sensitivity, the expression level of Nav1.2 and β4 subunits was examined. Western blotting analysis of the motor cortex from mice at different ages and the cultured motor neurons at different stages revealed that the ratio of Nav1.2 and β4 expression was increased from immature neurons to aged neurons. To verify whether the ratio of Nav1.2 and β4 subunit is important for the PR sensitivity of cortical motor neurons, I tested the different expression levels of β4 subunits. Consistent with previous studies, PR20 increased the channel activity of Nav1.2 coexpressed with β4 at 1:1 molar ratio. As the molar ratio of Nav1.2 and β4 was increased from 1:1 to 1:10, however, the PR20-induced increases in Na+ currents were abolished. Taken together, these studies suggest that aging-linked changes of Nav1.2 and β4 expression level is a key driver of PR sensitivity in cortical motor neurons, potentially contributing to the age-related risk in C9orf72-linked ALS. 근위축성측삭경화증 (ALS)은 상위 및 하위 운동 뉴런의 점진적인 퇴행을 특징으로 하는 치명적인 신경퇴행성 질환이다. ALS와 관련된 다양한 유전적 돌연변이 중에서, C9orf72 유전자에서의 헥사뉴클레오타이드 반복 서열 확장은 가장 흔한 유전적 원인으로 알려져 있다. 이 돌연변이는 폴리-프롤린-아르기닌(poly-PR) 펩타이드를 포함한 독성 디펩타이드 반복 단백질(dipeptide repeat proteins)을 생성한다. 기존 연구에 따르면, poly-PR 펩타이드는 Nav1.2–β4 나트륨 채널 복합체를 통해 나트륨 전류를 증가시킴으로써, 선택적으로 피질 운동 뉴런의 과흥분성을 유도하는 것으로 보고되었다. 하지만 아직까지도 이러한 효과가 나이에 따라 어떻게 달라지는지는 알려지지 않았다. 이에 본 연구에서는, 배양된 피질 운동 뉴런의 다양한 배양 일수 (Day in vitro, DIV)와 생후 다양한 나이의 생쥐에서 얻은 급성 뇌 절편을 사용하여 전기생리학적 실험을 수행하였다. 그 결과, poly-PR에 의한 과흥분성은 생후 56일 (P56) 전후의 젊은 성체 생쥐의 피질 운동 뉴런에서 유의하게 관찰되었으며, 이와 유사한 특성을 가진 DIV14의 배양 운동 뉴런에서도 유사한 효과가 나타났다. 반면, 미성숙(P5, DIV7) 또는 고령(P150, 1년령, DIV 21, DIV 28) 운동 뉴런에서는 poly-PR에 의한 과흥분성이 관찰되지 않았다. HEK-293T 세포에 Nav1.2 및 β4서브유닛의 발현 비율을 조절하며 진행한 실험에서도 β4서브유닛이 과도하게 발현될 경우 poly-PR에 의한 나트륨 전류 증가 효과가 소실됨을 확인하였다. 이러한 결과들을 종합하면, 노화에 따른 Nav1.2와 β4의 발현 변화가 피질 운동 뉴런에서 poly-PR에 대한 민감성을 조절하는 핵심 요인이며, 이는 C9orf72 유전자 변이에 의한 ALS에서 연령에 따른 발병 메커니즘을 밝히는 데에 기여할 수 있음을 시사한다.

Solid State NMR Studies of Structure and Dynamics of Dipeptides and DNA Oligonucleotides

이정희 University of Washington 1990 해외박사

Synthesis and biological activity of cyclic dipeptides

하태욱 부산대학교 1986 국내석사

Purification and characterization of bioactive compounds from the culture of Pediococcus pentosaceus LabMP-A05 isolated from kimchi

손재영 을지대학교 대학원 2024 국내석사

Pediococcus pentosaceus has a broad spectrum of antimicrobial properties, making it interest for its potential as a probiotic microorganism. Many studies have demonstrated the potential of this bacterium to enhance human health. There is controversy over the stability and potential side effects of directly applying lactic acid bacteria to the human body. As a result, research has shifted its focus to bioactive compounds instead of the bacteria. Bacteriocins from P. pentosaceus have been extensively studied for their antimicrobial properties. However, the commercial sector faces many constraints. These limitations include susceptibility to proteolytic enzymes, restricted antimicrobial activity, and suboptimal yields during production. The study aimed to identify non-bacteriocin bioactive low-molecular-weight compounds in P. pentosaceus LabMP-A05. This strain was isolated and identified from Chinese cabbage kimchi, a traditional Korean fermented food. The culture filtrates (CFs) of P. pentosaceus LabMP-A05 were analyzed using preparative-high performance liquid chromatography (prep-HPLC) and compared with the HPLC profile of Lactobacillus plantarum LBP-K10 from a previous study. The results confirmed similar fractionation patterns and suggested that P. pentosaceus LabMP-A05 may produce bioactive compounds, such as cyclic dipeptides (CDPs), similar to those produced by Lb. plantarum LBP-K10. The liquid-liquid extraction method with methylene chloride facilitated the isolation of peptidyl and cyclic peptidyl compounds from P. pentosaceus LabMP-A05 CFs. Disc diffusion assays confirmed significant antiviral and antifungal activity in P. pentosaceus LabMP-A05 CFs. The CFs were separated and isolated into bioactive compounds using prep-HPLC. The collected samples were lyophilized and analyzed using gas chromatography Multi-Omics High Resolution Mass Spectrometry (GC-HRMS) with both electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) techniques. The EI/CI GC-HRMS analysis identified peptidyl compounds in 13 out of 21 fractions of P. pentosaceus LabMP-A05. These compounds include cyclo(Ser-Pro), cyclo(Tyr-Pro), cyclo(Arg-Gly), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Met- Pro), cyclo(Phe-Leu), cyclo(Leu-Pro), and cyclo(Phe-Pro). Next, cytosolic proteins obtained from cell disruption of P. pentosaceus LabMP-A05 were isolated to study the enzymes responsible for CDP biosynthesis using Diethylaminoethyl cellulose-Sepharose CL-6B resin (DEAE-Sepharose CL- 6B) weak-anion exchange chromatography. The protein fractions were fractionated using native-polyacrylamide gel electrophoresis (native-PAGE). Two achromatic bands protein bands that did not react to ninhydrin were identified using liquid chromatography Multi-Omics High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS). The analysis identified five significant proteins. Among the proteins being considered, two primary candidates were selected: ornithine carbamoyltransferase (protein accession number: AHA05672.1) (37.11 kDa) (A05-OCT) and Xaa-Pro aminopeptidase (protein accession number: ABJ68292.1) (40.6 kDa) (A05-AP). These proteins were hypothesized to play a crucial role in synthesizing and/or regulating CDPs. To evaluate the potential for large-scale production of CDPs using overproduced recombinant proteins in the Escherichia coli system, polymerase chain reaction (PCR) was used for amplification. The nucleotide sequences of both genes were cloned into the pET 15b protein overproduction system after PCR- amplified A05-OCT (1,083 bp) and A05-AP (1,176 bp) genes were cloned into pGEM T-easy vector. The constructs were introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS and induced with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside. The analysis of the overproduction strain using sodium dodecyl sulfate-PAGE confirmed that only A05-AP was induced as a soluble protein. The A05-AP-verproducing E. coli BL21 (DE3) pLysS CFs was analyzed using prep-HPLC, revealing notable increases in specific peaks in the prep-HPLC profile. Nine different CDPs with antimicrobial properties were effectively characterized in P. pentosaceus LabMP-A05, highlighting its potential as a promising food additive and preservative. Additionally, using the E. coli system to selectively produce CDPs further establishes the significance of P. pentosaceus LabMP- A05 in food production. Pediococcus pentosaceus는 광범위한 항균 스펙트럼을 가지고 있으며 최근 프로바이오틱스로 주목받으며 다양한 연구가 진행되고 있다. 많은 연구에서 이 박테리아가 인간의 건강을 향상시킬 수 있는 잠재력을 입증했다. 유산균을 인체에 직접 적용하는 것의 안정성과 잠재적인 부작용에 대한 논란이 있다. 이에 따라 본 연구는 박테리아의 활성 대신 생리활성 화합물로 초점을 옮겼다. 대부분의 연구는 P. pentosaceus가 생산하는 박테리오신에 초점을 맞추고 있다. 박테리오신은 항박테리아 및 항균 활성이 있는 것으로 보고되고 있지만, 단백질 분해 효소에 대한 민감성, 제한된 항균 스펙트럼, 낮은 수율 등 상업적으로 활용하기에는 여러 가지 한계가 있다. 따라서 본 연구에서는 한국의 전통 발효식품인 김치에서 분리 동정한 P. pentosaceus LabMPA05의 박테리오신 이외의 생리활성 화합물을 규명하고자 하였다. 이 균주는 한국의 전통 발효 식품인 배추 김치로부터 분리 및 동정되었다. 선행 연구의 Lactobacillus plantarum LBP-K10과 P. pentosaceus LabMPA05의 배양 여과물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 비교 및 분석한 결과, 두 프로필의 유사한 분획 패턴을 확인하고 P. pentosaceus LabMP-A05가 Lb. plantarum LBP-K10에 의해 생성된 것과 유사한 사이클릭 디펩타이드와 같은 생리활성 화합물을 생성할 수 있음을 시사했다. P. pentosaceus LabMP-A05의 배양 여과물에서 펩티딜 및 고리형 펩티딜 화합물을 추출하기 위해 선행연구의 메틸렌 클로라이드를 이용한 액체-액체 추출법을 사용하였다. 디스크 확산 분석 결과, P. pentosaceus LabMP-A05의 배양 추출물에서 상당한 항바이러스 및 항진균 활성을 확인했다. 해당 배양 추출물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 분리하여 분획물을 얻었다. 이후 분획물을 동결 건조하고 전자 이온화 및 화학 이온화 기술을 이용하는 기체 크로마토그래피-다중 오믹스 고해상도 질량 분석법(GC-HRMS)을 통해 분석했다. GC-HRMS 분석 결과, 21개 분획 중 13개 분획에서 펩티딜 화합물이 확인되었다. 이러한 화합물에는 cyclo(Ser-Pro), cyclo(Tyr-Pro), cyclo(Arg-Gly), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Met-Pro), cyclo(PheLeu), cyclo(Leu-Pro) 및 cyclo(Phe-Pro)가 포함된다. 다음으로 사이클릭 디펩타이드 합성에 관여하는 생합성 관련 효소를 스크리닝하기 위해 P. pentosaceus LabMP-A05의 세포 내 단백질을 DEAE-Sepharose CL-6B 수지(DEAE-Sepharose CL-6B) 약-음이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리했다. 분리된 단백질 샘플을 native-polyacrylamide gel electrophoresis (native-PAGE)로 한 번 더 분리하고 닌히드린 반응을 통해 아미노산과 반응하는 단백질을 포함하는 두 개의 무채색의 밴드를 액체 크로마토그래피-다중 오믹스 고해상도 질량 분석법(LC-HRMS)으로 분석했다. 분석 결과 5개의 주요 단백질이 확인되었으며, 이 중 CDPs 합성에 가장 중요한 역할을 할 것으로 예상되는 ornithine carbamoyltransferase (protein accession number: AHA05672.1) (37.11 kDa) (A05-OCT)와 Xaa-Pro aminopeptidase (protein accession number: ABJ68292.1) (40.6 kDa) (A05-AP)를 선별했다. Escherichia coli에서 과잉 생산된 재조합 단백질을 사용하여 사이클릭 디펩타이드의 대량 생산 가능성을 평가하기 위해, 중합효소 연쇄반응을 통해 두 단백질의 유전자를 증폭하였다. 두 단백질 A05-OCT (1,083 bp) 및 A05-AP (1,176 bp)의 유전자 증폭물을 pGEM T-easy 벡터에 삽입한 후 복제과정을 거쳐 pET 15b 단백질 과잉 생산 벡터에 삽입하였다. 단백질 과잉 생산 벡터를 E. coli BL21 (DE3) pLysS에 형질전환하고 이소프로필 β-D-1- 티오갈락토피라노사이드로 단백질의 과잉 생산을 유도했다. Sodium dodecyl sulfate-PAGE를 사용한 과잉 생산 균주의 분석에서 A05-AP만이 가용성 단백질로 유도되었음을 확인했다. 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 A05-AP 생산 E. coli BL21 (DE3) pLysS CFs를 분석하여 프로파일에서 특정 피크의 현저한 증가를 확인했다. 항균 활성을 가진 9개의 다른 사이클릭 디펩타이드가 P. pentosaceus LabMP-A05에서 효과적으로 특성화하여 유망한 천연 식품 첨가제 및 보존제로서의 잠재력을 입증했다. 또한, E. coli 시스템을 활용한 사이클릭 디펩타이드의 선택적인 대량 생산방법을 통해 식품 산업에서 P. pentosaceus LabMP-A05의 중요성을 더욱 확고히하였다.

The Role of Proline-Containing Cyclic Dipeptides in the Culture Filtrate of Leuconostoc citreum LabMP-A03

성혜리 을지대학교 대학원 2025 국내석사

Antioxidative activity of histidine containing caffeic acid-dipeptides

서효석 서울대학교 대학원 2010 국내석사

Tyrosinase inhibitory activity and antioxidative activity of caffeoyl-amino acid-hydroxamic acid and antioxidative activity of caffeoyl-proline dipeptide

이송 서울대학교 대학원 2011 국내석사