Fabrication of DNA/RNA particles for CRISPR/Cas9 system and organic-inorganic hybrid materials by rolling circle replication

이제성 서울시립대학교 2017 국내석사

Over the past decade, a variety of methods for engineering of nucleic acid, such as DNA and RNA have been developed. Among them, the rolling circle replication (RCR) approach, including rolling circle amplification (RCA) and rolling circle transcription (RCT), has attracted considerable attention due to cost-effective production of nucleic acids. However, there have been few reports to apply RCR to generate the nucleic acid-based hybrid particles. In this thesis, we have developed a method for making new nucleic acid based structures, DNA-inorganic hybrid particles and RNA-Cas9 protein hybrid particles using RCR methods. For fabrication of DNA-inorganic hybrid particles, RCA with DNA polymerase and metal ions is required. Interestingly, the morphologies and functional properties of the DNA-inorganic hybrid particles was controlled by varying the concentration of metal ions. To fabrication of RNA-Cas9 protein hybrid particles for CRISP/Cas9 system, RCT with RNA polymerase with Cas9 protein is required. Here, we describe the method for fabricating these hybrid particles and their application such as MRI contrast agents, supercapacitor and CRISPR/Cas9 system. 지난 10년 동안 DNA 와 RNA를 포함하는 핵산을 조작하는 다양한 방법들이 개발되어왔다. 그 중에서도 특히 회전 순환 증폭 (RCA)과 회전 순환 전사 (RCT)를 포함하는 회선 순환 복제 (RCR) 방법은, 핵산의 비용 효율적인 생산으로 인하여 많은 관심을 받았다. 그러나 RCR방법을 이용하여 핵산 기반 하이브리드 입자를 만드는 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 RCR 방법을 응용하여 새로운 핵산 기반 하이브리드 구조물, DNA- 무기 하이브리드 입자 및 RNA-Cas9 단백질 하이브리드 입자를 만드는 방법을 개발하였다. DNA 무기 하이브리드 입자의 제조를 위해서는 DNA 중합효소와 금속 이온을 포함한 RCA기술을 이용하여 만들었다. 흥미롭게도, DNA 무기 하이브리드 입자의 형태와 기능적 특성은 금속 이온의 농도를 변화시킴으로써 조절되었다. 또한, CRISP / Cas9 시스템을 위한 RNA-Cas9 단백질 하이브리드입자는 Cas9 단백질 과 RNA 중합 효소를 포함한 RCT 기술을 이용하여 제작하였다. 본 논문에서는 이러한DNA 또는 RNA 기반 하이브리드 구조물의 제작 방법과, 그것들의MRI 조영제, 슈퍼 커패시터 그리고 CRISPR / Cas9 시스템과 같은 잠재적 응용분야에 대해서 기술하였다.

산화된 DNA 변형염기의 검출을 위한 단클론 항체 개발

이현호 인천대학교 대학원 2003 국내석사

DNA의 4개의 염기중 guanine은 산소프리라디칼의 공격에 의해 가장 쉽게 산화되는 염기이다. 8-Oxoguanine은 생체 내에서 가장 많이 생성되는 산화성 변형 염기들 중의 하나이며, 세포 DNA의 산화성 손상을 측정하는 수단으로서 많이 그 함량이 측정되어져 왔다 (Leipold, D. D. et al., 2000). 8-Oxoguanine은 C 대신 A와 mismatch하는 확률이 높아 GC → TA 돌연변이를 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나 8-Oxoguanine은 그 모태인 guanine보다 반응성이 훨씬 높아 산소프리라디칼에 의해 산화반응이 더 잘 유발되어 다양한 다른 변형물질을 생성하는 것으로 고되었다. (Duarte, V. et al, 2001). 이것은 세포의 산화성 손상 시에 8-Oxoguanine이 중간 생성물이며 최종적으로는 더 산화된 변형염기가 생성됨을 의미한다. 따라서 DNA 손상의 정확한 평가와 정량에는 8-Oxoguanine으로부터 유래된 산화성 손상 염기를 측정하는 기술이 필요하다. 이에 본 연구에서는 8-Oxoguanine으로부터 유래된 산화성 손상 염기를 검출할 수 있는 단클론 항체를 개발하기 위하여 먼저 광민감제인 methylene blue 존재 하에서 8-Oxoguanine을 광산화시켜 그 생성물들의 구조를 확인하고, 그 중 oxaluric aicd nucleoside를 분리하여 소 혈청 단백질에 결합시킨 것을 항원으로 사용하여 생쥐로부터 단클론 항체를 생성하였다. DNA의 deoxyribonuceloside가 아닌 8-Oxoguanine의 ribonucleoside인 8-Oxoguanine을 사용한 이유는 nucleoside는 분자량이 항원으로 작용할 만큼 크지 않으므로 단백질(소 혈청 단백질)에 결합시킨 복합체를 항원으로 사용하기 위함이다. 변형된 염기를 특이적으로 인지하는 항원을 생성시키기 위해 ribose의 두 개의 hydroxyl기를 periodate 반응에 의해 산화시켜 단백질의 lysine 잔기에 결합시켜 변형된 염기를 항체 생성계에 노출시키는 방법을 사용하였다. 산소라디칼은 세포생물학적 수준의 기초연구에서부터 발암유발기전, 항산화제 개발, 공해, 산업의학, 약물독성 및 항암제 개발 등의 응용연구에 이르기까지 생명공학의 모든 분야에서 주요 연구대상이 되고 있다. 이 같은 연구에서 가장 절실히 요구되는 것은 산소프리라디칼의 유해작용 판정이며 DNA 손상판정법은 분자생물학을 바탕으로 하고 있다는 점에서 그 유용성이 매우 크다 할 수 있다. 본 연구에서 개발된 oxaluric acid 특이적 단클론 항체는 인체에 대한 산화적 DNA손상을 혈액, 뇨, 강액, 뇌척수액, 자궁양수액 등의 체액의 변형 DNA 염기를 측정하여 인체에 대한 DNA 손상을 판정하고, 면역조직화학적인 응용을 통하여 조직특이적인 DNA 손상을 판정하는 등의 다양한 응용범위에 활용될 수 있다. 뿐만 아니라 손상 DNA의 수선에 관련된 단백질들의 확인 등 연구목적으로도 사용될 수 있다. Oxidative reactions within DNA commonly result in base modifications. Among them, 8-oxoguanine has been extensively studied in terms of repair and mutagenecity. However, 8-oxoguanine is highly susceptable to further oxidation. We photooxidized 8-oxoguanosine in the presence of a photosensitizer, methylene blue. The reaction products were separated by HPLC, and the main produce were characterized by LC/ESI/MS and LC/ESI/MS/MS. The main products were identified as spiroiminodihydantoin (Sp), iminoallantoin (Ia), and oxaluric acid nucelosides. The formation of the oxaluric acid was accounted for by a type Ⅱ mechanism involving formation of singlet oxygen, and the formation of Sp and Ia was by a type Ⅰ mechanism involving one electron oxidation. As an effort to develop an immunological assay which allows evaluation of the oxidized DNA lesions, we produced monoclonal antibodies by using isolated oxidized nucleosides conjugated to bovine serum albumin as antigens. The conjugates were prepared in the war that oxidized bases were exposed by linking ribose ring an the nucleosides to the protein.

(The) study on the oxidation of DNA-Silver nanodots and its application

박순영 서울대학교 대학원 2014 국내석사

Fluorescence has been progressively adapted toward in vivo molecular imaging recently because of their high sensitivity and selectivity, which make it possible to detect target at single molecule level with a high temporal resolution, in optimized system. To achieve efficacy of fluorescence imaging, a proper fluorescence probe is essential. ssDNA encapsulated Ag NDs are most attractive emerging fluorophores, because of their excellent photophysical properties and reasonable biocompatibility. However accurate structures and synthetic mechanisms of DNA-Ag NDs are still not clear. Therefore analyzing the response of DNA-Ag NDs in the process of oxidation gives us better understanding of DNA-Ag NDs. We examined the oxidation process of NDs by using red emissive DNA-Ag ND molecules in the presence of various reactive oxygen species. In addition, with discovered oxidative properties, we have developed ratiometric luminescence probes and new form of imaging process.

DNA 多型性 分析法에 의한 韓牛肉 判別用 標識遺傳子에 관한 硏究

박상규 建國大學校 大學院 1998 국내석사

PCR (polymerase chain reaction)기법이 한우와 비한우(홀스타인 및 그 외의 수입소)의 품종판별을 위해 적용되어왔다. 한우와 비한우를 RAPD로 확인하면 홀스타인, 헤어포드, 엥거스 같은 비한우에 있어서는 동일한 양상을 보이지만, 한우와는 다른 양상을 나타낸다. 즉, 한우에서 검출되는 모든 DNA 밴드들은 비한우에서 검출이 되지만, 비한우에서 검출되는 주된 밴드들 중에는 한우에서 관찰되지 않는 밴드가 있는데, 그 길이는 약 1.4kbp이었다. 이처럼 DNA 단편의 크기가 약 1.4kbp인 밴드는 한우를 제외한 여러 서양소 품종에 공통적으로 검출되기에 한우 판별을 위한 DNA 표지인자로 이용할 수 있었다. RAPD의 반응에 있어서 시료의 상태 및 실험조건에 따라 약해지는 검출감도를 높이기 위하여 2단계 증폭 방법이 도입 되었다. 1차로 증폭된 반응 생성물 중 1㎕를 반응 혼합액에 첨가하여 재증폭을 실행하였다. 1차 증폭산물의 밴드양상은 기존에 보고하였던 결과와 마찬가지로, 표지유전자가 비한우에서는 검출되지만 한우품종에서는 관찰되지 않았다. 이 결과는 표지유전자의 검출이 소 품종에 있어서 매우 특이적임을 뜻한다. 한편, 표지유전자를 probe로 이용하여 한우와 비한우의 제놈 DNA와 어떤 결합 양상을 나타내는지를 확인하기 위하여 southern hybridization을 실행하였다. 그결과 표식된 표지유전자는 홀스타인의 제놈 DNA뿐만 아니라 한우제놈 DNA와도 반응함을 알 수 있었다. 이러한 연구를 바탕으로, 한우의 증폭산물을 agarose gel에 전기영동한 후, 비한우의 표지유전자에 해당되는 부위의 agarose gel 단편을 template DNA로 이용하여 재증폭을 실행하였다. 그 결과 비한우의 표지유전자와 동일한 크기의 밴드가 한우에서도 검출이 되었다. 한우와 비한우 판별을 위한 표지유전자를 더욱 심도 있게 분석하기 위해 비한우에 해당되는 표지유전자를 pUC18 vector에 subcloning하였고, 염기서열분석을 하였다. 클로닝된 DNA 단편의 총 길이는 1435bp이었다. 이것을 Genebank를 통하여 상동성 검색을 한 결과 소에서 보고된 SINE sequence와 가장 높은 상동성을 보였다. 이것은 표지유전자가 제놈 DNA상에 반복 염기서열로 존재한다는 것을 뜻한다 이처럼 표지유전자의 검출은 primer의 결합력의 차이에 의해 한우 제놈 DNA에서는 증폭의 감도가 약해 주어진 조건하에저 표지유전자를 증폭 할 수 없기 때문이라 하겠다. 앞으로 한우와 비한우에 있어서 primer와 결합하는 부분의 염기서열의 차이가 해명된다면 이를 바탕으로 새로운 primer의 제작도 가능할 것이다. Genetic differentiation between Hanwoo and Non-Hanwoo was examined by randomly amplified polymorphic DNAs (RAPD) analysis. The RAPD pattern were identical among Non-Hanwoo, such as Holstein, Herford, Angus but the above pattern was different from that of Hanwoo. All bands detected in the Hanwoo samples were observed in Non-Hanwoo cattles samples, but one of the common bands found in samples was not detected in the Hanwoo samples. This band was 1.4kbp long. The band was useful as a marker for identifying a meat of Hanwoo from imported cattle meat. There were several reports that RAPD markers have extreme sensitivity to amplification conditions and poor reproducibility. The re-amplification technique was used for the improvement of band intensity. A 1㎕ aliquots of 1st PCR products was added to a reaction mixture and was re-amplified. No differences in band patterns were found between 1st-PCR and End -PCR products. Furthermore variable concentration of the re-amplified reaction mixture added to the PCR reaction mixture instead of a genomic DNA and then re-amplified, but genetic marker was not detected. In addition, Southern hybridization was performed with the probe of genetic marker. The result showed that the band patterns of Hanwoo by hybridization were same with that of Non-Hanwoo. This shows that DNA region of genetic marker is present in genomic DNA of Hanwoo as well as Non-Hanwoo. On the basis of these studies, it was performed 2nd and 3rd amplification with gel portion of DNA fragment in Hanwoo corresponding to the genetic marker detected in Non-Hanwoo. The genetic marker in Hanwoo samples was similar in size with that detected in Non-Hanwoo. In order to examine further the nature of the genetic marker, the breed-specific DNA marker band was cloned in the pUC18 vector. The cloned fragment was sequenced and its sire was 1435bp long. The marker sequence roveales homology with bovine microsatellite, Alu-like sequence and SINE sequence. This suggests that the binding region of the genetic marker is positioned in a repetitive DNA element widely dispersed in genomic DNA. Thus, the detection of the breed-specific DNA marker may be due to the difference of the primer oligonucleotide binding with genomic DNA and not be relative with the region of the genetic marker. Further studies are required to analysis of DNA fragment in Hanwoo corresponding to the genetic marker detected in Non-Hanwoo. This approach may be contributable to make a single band which is a DNA marker.

전기장에서 DNA 신장의 AFM을 이용한 연구

한성웅 동아대학교 2001 국내석사

현미경을 이용한 DNA 관찰은 DNA 형상 구조와 관련된 특성 분석에 있어 매우 중요한 정보를 제공한다. 이와 관련하여 여러 가지 현미경을 이용하여 DNA 구조에 대한 고해상도의 형상상을 얻을 수 있었다. 그러나 긴 DNA 형상을 해석하는데 있어 예상치 못한 불규칙한 꼬임 현상으로 인하여 DNA 분자의 형상 구조를 해석하는데 어려움이 있었다. 이러한 결과가 발표된 이후 전자 현미경, 형광 현미경, 원자간력 현미경 분야에서 각종 신장 기법이 개발되어 왔다. 이들 신장 기법들은 대부분 DNA 분자와 결합특이성을 가지는 물질로 적절히 처리된 표면과의 특정 생화학 반응을 응용하고 있다. 그러나 이러한 방법 중 특히 DNA 농도가 낮은 경우에 있어서는 신장동안의 DNA 손실이 큰 문제로 지적되고 있다. 최근 표면특성 분석에 활발히 응용되고 있는 AFM은 DNA와 DNA-단백질 착체 구조를 연구하는데 있어서도 잠재력을 가지고 있다. 그러나 DNA의 긴 가지를 형상화하는데 있어서 샘플 준비가 복잡하기 때문에 AFM 이용에는 어려움이 많았다. 하지만 AFM을 이용한 직접적인 DNA 구조의 물리적 맵핑(mapping)은 현재 중요한 관심사로 대두되고 있다. 본 연구에서는 Mg^2+ 처리된 마이카, aminosilane로 처리된 마이카(AP-마이카) 그리고 일반 마이카 표면에서 전기장을 인가하여 ppb 이하의 농도의 λ-DNA 신장을 행하여 낮은 농도에서의 DNA 신장의 최적 조건을 구하여 AFM에 의한 DNA 물리적 맵핑을 수행하였다. 일반 마이카, AP-마이카, Mg^2+ 처리된 마이카 표면상에서 500 ∼ 200VDC의 적용전압으로 전극거리 100 ∼ 300μm의 전기장 인가에 따른 YOYO-1 염색된 0.57×10^-6ng/mL 농도의 DNA 신장을 성공적으로 수행하였다. 인가 전압, 두 전극사이의 거리는 DNA 신장에 영향을 주었다. 따라서, 인가전압과 두 전극 거리의 관계는 DNA 신장에 있어 중요한 요소로 사료된다. 기질로서 AP-마이카를 사용했을 경우, 신장 효율이 가장 좋았다. 본 응용 기법은 극히 낮은 농도의 DNA일 경우에는 매우 효율적이지만 높은 농도에서는 신장된 부분이 상당히 조밀함으로 AFM 기법을 응용하여 연구하기에는 적합하지 못하다고 생각된다. An effective method of DNA stretching using electric field on mica surface was proposed for extremely low solution concentration of DNA. The difference in stretching efficiency for the different surfaces of bare mica, Mg^2+ soaked mica and AP-mica was discussed. The best performance of stretching was found from the surface of AP-mica under the same experimental condition. The microscopy of DNA is important information for analyzing structure-related properties. Highly resolved images have been obtained by electron microscopy, fluorescence microscopy (FM) and scanning probe microscopy especially for atomic force microscopy (AFM). In these images, especially when DNA is long, unexpected random coil makes the topology of the molecule difficult to interpret. For this necessary, a number of stretching methods have been developed for EM, FM and AFM. Most of these applications. These methods rely on DNA bound or hooked at randomly distributed sites. But in some of these methods, the loss of DNA molecules during the stretching is still a big problem especially when the concentration of DNA is low. AFM has displayed a great potential possibility in the study of the structure of DNA and DNA-protein complexes. However, the complications in sample preparation have until now hindered AFM from contributing vigorously to this field. On the other hand, direct physical mapping of DNA with AFM has been an attractive topic. Electric-field induced DNA stretching in a very low solution concentration of DNA on the bare mica, Mg^2+ soaked mica and AP-mica. An applied voltage and the distance between the negative and positive electrodes have influenced the stretching of DNA molecules. The stretching efficiency was best when the AP-mica was used as a substrate. In a higher concentration, the stretched portion was too dense to apply AFM studies.

DNA-펩타이드 하이브리드의 나노구조체 기반 인공효소 개발 연구

박준영 명지대학교 대학원 2023 국내석사

DNA Hydrogel을 이용한 Artificial enzyme의 구현을 위해, 우선 Digestive enzyme 중 하나인 Porcine Pancreatic Trypsin(이하 Trypsin)의 catalytic triad를 모델로 하여 세 set의 10-11 아미노산 서열로 구성된 “short peptide”를 ssDNA(Single strand DNA/단일 가닥 DNA)의 5` end와의 Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaction(이하, CuAAC, 혹은 CuAAC 반응)을 통해 peptide-DNA 컨주게이션을 만들었다. 다음으로, 해당 ssDNA와 hybridization을 할 수 있도록 하는 또 다른 세 ssDNA를 도입하여 DNA annealing을 통해 X-Shaped DNA(이하, X-DNA)를 제작했다. 마지막으로 이를 ligation 하여 DNA Hydrogel을 제작했으며, 해당 나노구조체가 DNAzyme Hydrogel로서 기능하는지 확인하기 위해, 이를 사용한 enzymatic reaction에 관한 연구가 진행되었다. Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(이하, L-BAPA)가 Trypsin과 같은 Serine protease에 의해 펩타이드 결합이 끊어지게 되면 이에 대한 생성물로 4-Nitroaniline이 만들어진다. UV-Vis 흡수 분광법을 통해, L-BAPA는 313nm에서 최대 흡수 파장을 나타내며, 4-Nitroaniline은 380-383nm에서 최대 흡수 파장을 나타낸다. 이때, DNA Hydrogel에 대하여 L-BAPA 용액에 투입하고 반응을 진행한 결과, 시간이 지날수록 313nm의 흡광도가 감소하면서 383nm의 흡광도가 증가함을 확인했다. 이는 대조군이자 모델 효소인 Trypsin에서 보여주는 반응과 일치한다. 한편, 약 66KDa 단위의 단백질인 Bovine Serum Albumin(이하, BSA)에 대해서는 Fluorescence data(Emission spectra) 및 SDA-PAGE를 통해 BSA가 Trypsin에 의해 단백질의 4차 구조가 붕괴하여 excitation wavelength 280nm 기준 341nm에서 발광 세기가 많이 감소하는 것을 확인했다. 그러나, 현재 DNA Hydrogel 모델에서는 해당 단백질에 대해서 유의미한 변화를 확인할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, L-BAPA와 같이 상대적으로 작은 유기물질에서는 DNA Hydrogel에 노출된 short peptide과 substrate 사이의 interaction으로 인해 catalytic triad가 해당 물질을 붙잡고 펩타이드 결합을 끊어낼 수 있었다. 이 연구를 통해, 모델 enzyme을 이루는 amino acid sequence 중 특정 sequence를 가져오는 것으로 enzyme을 모방하는 것에 관한 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대한다. In order to manifest artificial enzyme using DNA Hydrogel, with choosing three set of amino acid sequence(10 to 11) which includes catalytic triad from one of nature digestive enzyme, Porcine Pancreatic Trypsin(Trypsin in short), we made three independent sets of Oligonucleotide-peptide conjugates by performing Copper-Catalyzed Azide/Alkyne Cycloaddition(CuAAC reaction in short) on 5`end of ssDNA. Then, by using other three sets of ssDNA that can do hybridization with the conjugates and those ssDNA themselves, X-Shaped DNA(X-DNA in short) was made. Later, X-DNA was ligated, resulting in DNA Hydrogel. It was studied whether it could be functioned as enzymatic reaction or not as DNAzyme Hydrogel. When Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(L-BAPA in short) was cleavaged by Serine protease such as Trypsin, 4-nitroaniline is produced. By applying UV-Vis spectrophotometry, it shows maximμM absorption peak at 313nm. As DNA Hydrogel that has Oligonucleotide-peptide conjugates was mixed with L-BAPA substrate, absorption peak of 313nm was decreased, and 383nm peak was increased simultaneously. Its change is the same as one of control groups, substrate with Trypsin which is our model protein. Meanwhile, Bovine SerμM AlbμMin(BSA in short) has about 66KDa unit. As BSA reacts with enzyme, its tertiary structures break down by observing SDS-PAGE and Fluorescence emission spectra. Especially, when it cleavages, with excitation wavelength of 280nm, emission peak at 341nm is heavily decreased. But, with current DNA Hydrogel model, it did not show any significant changes or evidence of enzymatic reaction with BSA, in which relatively large structure such as BSA did not show the same effect as what L-BAPA’s case. Despite of this, small molecules such as L-BAPA were interacted with short peptides that “anchored“ on DNA Hydrogel, resulting in similar effect as what model enzyme’s catalytic triad did. With this research, we expect that we were able to contribute a method of mimicking enzymes by taking sets of amino acid sequences from original model enzyme.

방사선에 의한 인간 섬유아세포의 DNA 메틸화 양식

권영연 건국대학교 대학원 2010 국내석사

방사선의 이용은 의료, 농업, 공업, 에너지 분야 등 여러 분야에서 사용되고 있다. 그러나 방사선은 유전자에 독성을 나타내는 인자로서 인체에 다양한 영향을 주게 된다. 방사선에 피폭되면, chromosome aberration, Micronuclei, Prematurely condensed chromosome assay와 같은 방사선에 대한 생물학적 마커를 이용하여 인체가 피해를 입은 정도를 측정하게 된다. 하지만 이러한 방식은 실험자에게 고도의 기술을 필요로 하고 많은 시간이 소요 되며 피폭 선량 판독에 있어서 개인적인 차가 나타날 수 있는 한계점이 존재한다. 방사선은 세포에 유전적 불안정성을 일으키고 CpG site내의 cytosine의 메틸화 정도를 변화시킨다. 우리는 이를 이용하여 새로운 방사선에 대한 마커를 찾기 위하여 G0기 상태의 인간 섬유아세포의 DNA 메틸화 양식의 변화를 조사하였다. 인간 섬유아세포에 각각 0.05, 0.5, 5Gy의 방사선량을 조사한 후 24시간, 48시간 뒤에 DNA를 추출하여 Illumina사의 Human Infinium Methylation 27 Array chip을 사용하여 메틸화 변화를 측정하여 분석하였다. 이것은 방사선 피폭선량 측정에 DNA 메틸화를 적용하려는 첫 시도로 이 분석을 통하여 우리는 방사선 피폭선량을 측정할 수 있는 마커 후보들을 선별하게 되었다. Application of ionizing radiation in different areas is constantly increasing the use for medical and industrial purposes. Radiation is a genotoxic agent that gives rise to a variety of effects in human. Although chromosome aberration, micronuclei, prematurely condensed chromosome assays were used for biomakers of human radiation exposure, the biomonitoring of large groups of workers is difficult because there are required time consuming and highly skilled personnel. The inheritance of genomic instability suggests the possible involvement of epigenetic mechanisms by radiation, such as changes of the methylation of cytosine residues located within CpG dinucleotides. To find the specific biomarkers for heavy casualties to detect the radiation exposure in short time, we have investigated the altered patterns of genomic DNA methylation in the cell cycle arrested human dermal fibroblast cells. Irradiated HDF cells were harvested at 24 hrs and 48 hrs after the radiation exposure (0.05, 0.5 and 5 Gy) and the methylation status of genomic DNA was analyzed by Illumina Human Infinium Methylation 27 Array Chip. Through this analysis, we selected potential biomarkers to detect the radiation exposure. This is the first report which introduces the application of genomic DNA methylation analysis to detect radiation exposure.

고효율 단백질 발현을 위해 세포 내부에서 RNA 전사 가능한 DNA Hydrogel 개발

양진환 명지대학교 대학원 2023 국내석사

DNA는 핵산으로 구성된 유전정보를 전달하는 고분자 물질이다. 핵산은 생명체를 구성하는 기본 요소이기 때문에 핵산으로 구성되어 있는 DNA 구조체는 다른 나노 구조체의 기본단위 보다 생체 적합성이 뛰어나다. DNA 구조체는 서로 상보적인 서열을 갖는 염기로 만들 수 있어 설계가 용이하고 안정성이 높은 것으로 알려져 있다. 기존 nanostructure는 많은 부작용이 우려되고 있다. 또한, 기존의 전달은 유전자를 핵까지 전달하는 방식으로 이루어져 있어, 세포내 방벽에 의해 방해를 받는다. 본 연구는 생체 내 안정성이 뛰어난 나노 크기의 DNA hydrogel을 세포 내 약물 전달 운반체로 사용하고 전달 효율을 높이는 것을 목표로 했다. 나노 크기의 DNA hydrogel을 합성하기 위해 X 모양 DNA (X-DNA)를 building block으로 사용했다. 또한 세포 내 전달을 확인하기 위해 atto488로 labeling 된 DNA hydrogel을 세포에 처리했다. 처리된 DNA hydrogel은 정해진 시간마다 형광 현미경으로 관찰됐다. 관찰 결과 DNA hydrogel이 세포 내 들어가는 것을 확인했다. DNA hydrogel이 유전자 전달 운반체로 사용 가능한지 확인하기 위하여 eGFP (enhanced green fluorescent protein) 발현하도록 설계된 plasmid를 갖는 DNA hydrogel (P-gel)을 합성했다. P-gel은 transfection reagent와 함께 세포에 처리되었고 시간이 지나자 eGFP 발현을 형광현미경으로 관찰할 수 있었다. P-gel을 세포질에서 RNA를 전사해서 단백질 발현시키기 위해 T7 RNA polymerase 와 P-gel을 incubation 후 세포에 처리했다. 이후 형광 현미경으로 세포를 관찰했다. 단백질 발현은 확인되지 않았지만 추가연구를 통해 세포질에서 전사가 가능한 D-gel이 개발된다면, 핵으로 전달되어 발현하는 방식보다 더 높은 효율로 단백질을 발현할 수 있다. DNA is a polymeric substance that carries genetic information consisting of nucleic acids. Because nucleic acids are the basic building blocks of life, DNA structures consisting of nucleic acids are more biocompatible than other nanostructures. DNA structures are known to be easy to design and have high stability because they can be made of bases with complementary sequences. Existing nanostructures are feared to have many side effects. In addition, conventional transmission consists of transmitting genes to the nucleus, which is hindered by intracellular barriers. This study aimed to use nano-sized DNA hydrogel with excellent in vivo stability as an intracellular drug delivery carrier and increase delivery efficiency. X-shaped DNA (X-DNA) was used as a building block to synthesize nano-sized DNA hydrogels. In addition, DNA hydrogel labeled with atto488 was treated with cells to confirm intracellular transfer. The treated DNA hydrogel was observed under a fluorescence microscope at specified times. The observation confirmed that DNA hydrogel entered the cell. DNA hydrogel (P-gel) with plasmid designed to express enhanced green fluorescent protein (eGFP) was synthesized to determine whether DNA hydrogel can be used as a gene transfer carrier. P-gel was treated in cells with a transmission agent and over time eGFP expression could be observed with a fluorescence microscope. T7 RNA polymerase and P-gel were treated in cells after incubation to transcribe and protein expression of P-gel from the cytoplasm. The cells were then observed under a fluorescence microscope. Protein expression has not been confirmed, but if further studies develop D-gel that can be transcribed in the cytoplasm, protein can be expressed with higher efficiency than in the way it is delivered to the nucleus and expressed.

DNA 수화젤과 AuNPs 복합체에 대한 mRNA 도입 및 이를 활용한 빛 감응성 mRNA 전달체 개발연구

김민철 명지대학교 대학원 2025 국내석사

Messenger RNA(mRNA)는 이전부터 백신접종, 단백질 대체 요법 및 유전자 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가진 치료제로 알려졌으며, 코로나19 사태부터 면역 물질로서 잠재력이 입증되어 활발히 연구되어 왔다. 대표적으로는 생체 내에서 번역을 통해 단백질 생성에 기여하는 mRNA의 특성을 이용해 바이러스의 유전정보를 가진 plasmid DNA를 생체 외 합성을 통해 mRNA로 제조하여 생체 내에 운반시키면 체내에서 바이러스 단백질이 만들어지며, 그 바이러스에 대항할 항체(스파이크 단백질)를 직접 생성해내 면역작용을 유도하는 바이러스 벡터 백신으로 활용되고 있다. 문제는 이 mRNA의 치료제로서 가치가 높아질수록 mRNA치료제를 생체 내로 안전하게 운반하는 운반체와 불안정한 mRNA의 보관 방법에 대한 연구가 주요 장벽이 되었다. 이는 mRNA가 소형 nucleotide보다 생체 내 전달이 어렵고 다른 유형의 RNA에 비해 분자 크기가 크기 때문에 나노 입자에 캡슐화 시킬 필요가 있다. 일반적으로 mRNA는 생체 외 합성 후 세포 내 전달할 때 lipid nano particle(LNP)로 캡슐화 시켜 사용했는데, 다른 방법으로는 생체 내에 적합한 DNA를 사용해 hydrogelation 하여 mRNA를 감싸 보관 및 운반하는 방법이 연구되고 있다. 본 연구에서는 mRNA의 5`cap과 3`poly A 와 상호작용이 가능한 서열을 가진 X자 모양의 가지가 달린 DNA를 ligation하여 hydrogel을 제조 후, 표면이 + charge로 하전 된 gold nano particle(AuNPs, 약 20nm size)과 정전기적 인력으로 연결해 생체 외 합성된 mRNA를 안정적으로 보관하며 laser를 쬐었을 때 AuNPs 로 인한 photothermal effect로 gel에서 mRNA를 세포 내로 퍼뜨릴 수 있는 새 운반체 시스템을 설계했다. DNA를 사용해 hydrogel을 만들어 보관하는 방식은 LNP에 비해 생체 내 독성 관련해 더욱 안전한 형태라는 점과 X자 DNA의 scaffold형식의 ligation으로 인해 만들어진 hydrogel의 3차원적 구조의 안정성 덕분의 mRNA의 장기 보존력이 좋아질 수 있다는 장점이 있다. 또한 표면이 + charge로 하전 된 AuNPs가 정전기적 인력으로 hydrogel과 접합함으로써 생체 내에 들어갔을 때 여러 단백질로 인한 면역체계를 어느정도 보호할 가능성이 있고, laser를 통한 photothermal effect를 통해 hydrogel에서의 mRNA를 생체 내로 퍼뜨릴 수 있는 타이밍을 조절할 수 있다는 장점을 지닌다. Messenger RNA (mRNA) has long been known as a therapeutic agent with the potential to revolutionise vaccination, protein replacement therapy and the treatment of genetic diseases, and has been actively researched since the COVID-19 outbreak due to its demonstrated potential as an immunological agent. In particular, using the characteristics of mRNA, which contributes to protein production through translation in vivo, plasmid DNA containing the genetic information of the virus is prepared as mRNA through ex vivo synthesis and transported into the body, viral proteins are made in the body, and antibodies (spike proteins) against the virus are directly produced to induce immunity. The problem is that as the therapeutic value of these mRNAs has increased, research into carriers that safely transport mRNA therapeutics in vivo and storage methods for unstable mRNAs have become major barriers. This is due to the fact that mRNA is more difficult to deliver in vivo than small nucleotides and has a larger molecular size compared to other types of RNA, making it necessary to encapsulate it in nanoparticles. Generally, mRNA has been encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) for ex vivo synthesis and subsequent intracellular delivery, but other methods have been investigated for in vivo storage and transport of mRNA by hydrogelation with suitable DNA. In this study, we designed a new carrier system by ligating X-shaped branched DNA with a sequence that can interact with the 5`cap and 3`poly A of mRNA to prepare a hydrogel, and then electrostatically attracting gold nanoparticles (AuNPs, about 20 nm in size) with a surface charged with a positive charge to stably store the ex vivo synthesised mRNA, and spreading the mRNA from the gel into the cell by the photothermal effect caused by AuNPs when irradiated by laser. The advantage of using DNA to create and store hydrogels is that it is a safer form of in vivo toxicity compared to LNPs, and the stability of the three-dimensional structure of the hydrogel created by the scaffold-style ligation of X-shaped DNA leads to better long-term retention of mRNA. In addition, AuNPs with a + charge on the surface can be electrostatically attracted to the hydrogel, which has the potential to protect the immune system from various proteins in vivo, and the photothermal effect of the laser can be used to control the timing of spreading the mRNA in the hydrogel in vivo.

Building a Technology Platform for DNA-Encoded Chemical Library Selection Using Cellular Phenotypes

Sander, Philipp Nikolaus The Scripps Research Institute ProQuest Dissertati 2025 해외박사(DDOD)

소속기관이 구독 중이 아닌 경우 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

DNA-encoded chemical libraries (DELs) are powerful tools to rapidly survey chemical space for biological activity in a cost- and time-efficient manner by harnessing combinatorial chemistry and next-generation DNA sequencing to enable rapid drug discovery. However, as opposed to traditional high throughput screening, current DNA-encoded library selection methods primarily focus on binding-based assays against defined targets in vitro and cannot access the biological relevance and novelty of insight that phenotypic cell-based assays can yield. Combining the power of combinatorial chemistry through the application of DNA-encoded chemical libraries with the depth of complex insight furnished by phenotypic assays would greatly reduce the cost of academic and industrial hit discovery, as well as speed up design-make-test cycles to accelerate the medicinal chemistry lead optimization process.In this thesis I establish a methodology to transfect DNA-encoded small molecules into mammalian cells, and probe cellular function of these DNA-encoded small molecules by assaying for compound-induced gene expression, which identification of active small molecules by sequence analysis of their cognate DNA barcodes.I describe the concept and development of tools and methods and present a covalent labeling and immunoprecipitation strategy to enrich DNA barcodes encoding active compounds from cell-based transfection experiments. Compound-induced gene expression is linked to covalent labeling of DNA barcodes present in an activated cell. This DNA labeling functions as a type of activity recording that can summate both transient and sustained cellular signaling outputs and provides a compound-activity-dependent purification tag that allows recovery and sequencing of DNA barcodes. I also identify an additional tool compound that can be included in a future model DEL and report the establishment of a DNA sequencing protocol spanning library preparation and bioinformatic analysis. I discuss next experimental steps, important limitations of the current approach, and future directions of this methodology, as well as discusses potential application of this work towards the related fields of synthetic biology and biocomputing.