Real-Time PCR을 이용한 벼 알마름병균 Burkholderia glumae와 B. gladioli의 진단 기술 개발

김병규 단국대학교 대학원 2013 국내석사

세균성 벼알마름병은 1956년 일본에서 최초로 보고된 이후 전 세계 많은 국가에서 발병사례가 보고되었고 국내에서는 1987년 발병이 공식적으로 처음 확인된 이후 현재 전국적으로 확산 추세에 있는 벼의 주요 관리 대상 병중에 하나이다. 국내 세균성 벼알마름병 피해면적은 기상 여건에 따라 다소 차이는 있으나 매년 꾸준히 증가하고 있어 발생 초기에 예찰 및 방제하여 농가의 피해를 최소화 시키는 방법이 필요한 실정이다. 그러나 고전적인 방법으로는 초기 병징이 유사한 병의 경우 정확한 동정이나 조기 진단이 불가능하며, 현재까지 개발된 분자적 또는 생화학적 탐침자의 경우도 특이성 및 민감도에 있어서도 새로운 개선이 최선인 상태이다. 최근, 유전체 정보 해독기술의 급속한 발전으로 다양한 병원미생물에 대한 정확한 진단 분석 이용 기술이 가능해 짐에 따라 본 연구에서는 농업 현장에서 문제시되고 있는 이들 병원균에 대한 정확한 모니터링을 위해 유전체 기반의 종 특이 탐침자를 발굴 개발 하고자 하였다. Burkholderia glumae의 경우는 B. glumae BGR1 (Genbank: Accession No. NC_012724)의 유전체 정보 중 종 특이적인 유전자 rhs family (GenBank accession No. 237878396)를 BLAST(Basic Local Alignment Tool)분석을 통해 선발 한 후 최적 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 B. glumae 5개 균주, 동속 이종의 Bukholderia 6종, 그리고 기타 근연 속인 세균 18종을 사용하였다.그 결과 본 연구에서 제작된 프라이머를 통해 B. glumae 5개 균주에서만 138 bp 크기의 특이적인 유전자 산물이 증폭되었고, 함께 분석된 다른 균주에서는 증폭되지 않았다. SYBR Green Real-Time PCR의 최대 정량적 민감도는 plasmid DNA 경우 1.45 × 10^3 copies/㎕ 였고, genomic DNA는 5 fg, 균 현탁액은 OD600 0.1 × 10^-6 으로 각각 확인되었다. 또한, B. glumae에 의해 자연 감염된 종자에서도 그 특이성을 확인 할 수 있었다. B. gladioli의 경우는 B. gladioli BSR3 (Genbank: Accession No. NC_015381)의 유전체 정보를 분석하여 특이적인 유전자 hypothetical protein (GenBank Accession No. YP_004349188.1)을 선발 후 최적 프라이머를 제작하였다. 특이성 검정은 B. gladioli 7개의 균주, 다른 Bukholderia 14종, 그리고 기타 병원성 세균 15종을 이용해 증폭 여부를 비교 분석하였다. 그 결과 B. gladioli 7개 균주에서만 231 bp 크기의 특이적인 유전자 산물을 확인하였다. SYBR Green Real-Time PCR의 최대 정량적 민감도는 plasmid DNA의 경우 1.41 × 10^3 copies/㎕ 였고, genomic DNA는 50 fg, 균 현탁액은 OD 600 0.1 × 10^-5 으로 각각 확인 되었다. 또한 B. gladioli에 인위 감염된 유모기의 벼 에서도 그 특이성을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 개발된 각각의 프라이머들은 종자 검역 및 농가에서 정확한 병 예찰, 진단 및 방제에 유용한 표지 인자로서 활용할 수 있음 확인할 수 있었다. In this study, we developed a reliable, quick, and accurate quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay to detect grain rot caused by Burkholderia glumae and B. gladioli in rice. The control of bacterial grain rot is difficult, and the only practical methods for disease management rely on the use of pathogen-free seed, appropriate culture practices, and resistant cultivars. Therefore, the specific detection of these pathogens in seed is essential for effective control of the disease. However, other Burkholderia spp. are also detected by currently available molecular and serological methods. In this study, we exploited the available genome sequence information in public databases to develop specific PCR primers for accurate diagnosis of B. glumae and B. gladioli. The SYBR Green Real-Time PCR primer sets were designed based on the rhs family gene (GenBank accession number 237878396) of B. glumae BGR1, and on hypothetical protein (GenBank Accession Number YP_004349188.1) of B. gladioli BSR3, respectively, because these genes are structurally diverse and unique to each species. The specificity of the primers for B. glumae was evaluated using purified DNA from 5 isolates of B. glumae, 6 different species of Burkholderia, and 18 other reference pathogenic bacteria. The primer sets specifically amplified 138 bp fragment of the gene from B. glumae. Amplification products were not obtained from other Burkholderia, or from other pathogenic bacteria. To check the specificity of the primer set, the number of other reference microorganisms, including other Burkholderia spp., was tested by SYBR Green Real-Time PCR with bg138F/R primer set. The quantification limit was at least 1.45 × 10^3 copies/㎕ of cloned amplified target DNA using purified DNA, or 0.1 × 10^-6 OD 600 unit of cells per reaction, respectively. The specificity of the primers for B. gladioli was estimated using purified DNA from 7 isolates of B. gladioli, 14 different species of Burkholderia, and 15 other reference pathogenic bacteria. The primer set was tested by conventional PCR against seven isolates of B. gladioli. As expected, a 231bp DNA fragment was amplified. To confirm the specificity of the primers, a large collection of other microorganism, including other Burkholderia spp., was tested by SYBR Green Real-Time PCR with bgl231F/R primer set. The detection limit of reaction was at least than 1.41 × 10^3 copies/㎕ of cloned amplified target DNA using purified DNA, or 0.1 × 10^-5 OD 600 unit of cells per reaction, respectively. It is believed that these protocols and primer set developed in this study and reliable and has great potential for analyzing large numbers of samples.

Quorum sensing-dependent proteomes and anticipation of stationary-phase stress in Burkholderia glumae

구은혜 서울대학교 대학원 2013 국내박사

Burkholderia glumae, the causative agent for bacterial rice grain rot, has a LuxR-LuxI type quorum sensing (QS) system. The bacterium utilizes N-octanoyl homoserine lactone synthesized by TofI and its cognate receptor TofR to activate expression of genes for toxoflavin biosynthesis and an IclR-type transcriptional regulator gene, qsmR. Since QS is essential for pathogenicity of B. glumae, we analyzed QS-dependent proteome by two-dimensional gel electrophoresis and ESI-MS/MS. We found that a total of 79 proteins, including previously known QS-depedent proteins, were differentially expressed between the wild-type BGR1 and the tofI mutant BGS2 strains. Among this set, 59 proteins were found in the extracellular fraction, and 20 were cytoplasmic. The extracellular 34 proteins including protease, lipase, phosphatases, were secreted through the type II secretion system (T2SS). Real-time RT-PCR analysis showed that the corresponding genes of the 49 extracellular and 13 intracellular proteins are regulated by QS at the transcriptional level. The T2SS, encoded by 12 general secretion pathway (gsp) genes with three independent transcriptional units, was controlled by QS. β-Glucuronidase activity analysis of gsp::Tn3-gusA gene fusions and electrophoretic mobility shift assays revealed that the QsmR directly regulates the expression of gsp genes. The T2SS defective mutants were less virulent than the wild type in rice panicles, indicating that the T2SS-dependent extracellular proteins play important roles in B. glumae virulence. Acyl-homoserine lactone-mediated QS regulates diverse activities in many species of Proteobacteria. QS-controlled genes commonly code for production of secreted or excreted public goods. QS affords a means of population density-dependent gene regulation. Control of public goods via QS provides a fitness benefit. Another potential role for QS is to anticipate overcrowding. As population density increases and stationary phase approaches, QS might induce functions important for existence in stationary phase. Here we provide evidence that in two related species of the genus Burkholderia QS allows individuals to anticipate and survive stationary phase stress, base toxicity. Survival requires QS-dependent activation of cellular enzymes required for production of excreted oxalate, which serves to counteract ammonia-mediated alkaline toxicity during stationary phase. Our findings provide an example where QS can serve as a means to anticipate stationary phase or life at the carrying capacity of the population by activating expression of cytoplasmic enzymes, altering cellular metabolism and producing a shared resource or public good, oxalate.

Adaptive mutation and pellicle formation in static culture of Burkholderia glumae causing bacterial grain rot

곽지영 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Bacteria under unfavorable environment make necessary adjustments to survive. The morphological and genetic diversification in bacteria involve changes including lifestyle switch from motile to sessile cells in pellicle initiation and development. The pellicle as a thin buoyant multicellular layer at the air-liquid interface in Gram-negative bacteria have received little attention compared to the solid surface colonizing biofilm produced from Gram-negative bacteria. Though, there remain questions to be answered in functional role and the trigger of bacterial cellulose biosynthesis as pellicles, here the aerobic rice pathogen Burkholderia glumae BGR1 biosynthesizing cellulase-sensitive pellicles in bis-(3′-5′)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP)- and flagellum-dependent, yet in quorum sensing independent manner with colony morphological variation and reduced virulence is shown. The elevated level of c-di-GMP was detected in pellicle forming colony variants. Since c-di-GMP is involved in adhesin production and motility associated biofilm formation inhibition, the PAS/GGDEF motif possessing diguanylate cyclase gene for c-di-GMP diosynthesis, the pelI from B. glumae and the adapted GGDEF motif carrying response regulator, pleD, from Agrobacterium tumefaciens was taken to investigate a role in facilitated pellicle formation in B. glumae under unfavorable in vitro condition. A cluster of genes involved in bacterial cellulose biosynthesis (BCS) was found to harbor bcsD, bcsR, bcsQ, bcsA, bcsB, bcsZ, and bcsC in B. glumae. An inverse relationship between the mutations in BCS genes and virulence of BCS mutants in rice plants was observed that the mutants had significantly reduced virulence. The bcsB upregulated PAS/PAC domain carrying bspP (BGLU_RS28885) mutant strain in B. glumae had facilitated pellicle formation. The quicker pellicle formation was observed from bspP spontaneous deletion or point mutation strains of B. glumae. The spontaneous mutations in bspP was considered as genetic sacrifice to better adapt to unfavorable environment and to survive. By possessing relatively flexible genome structures as survival tactics in bacteria, the aerobic BGR1 genetically alters genotype resulting phenotypic changes that fits the environment better. The colonies with various morphology and quicker pellicle formation as more fitted individuals were able to survive a week in static culture growth condition. The unfavorable bacterial niche such as omitted aeration from in vitro culture condition for an aerobe, triggered colony variants with diverse genetic mutations in bspP to facilitate pellicle formation for aerobic cells to gain excess to available oxygen. The cells in static culture were able to survive as they avoid cell death due to alkalization via the obcA upregulation for keeping extracellular pH close to neutral through oxalate production. Hence, the extended survivorship in bspP mutant was supported by bcsB gene upregulation, and oxalate-mediated detoxification of the alkaline static environment. Though bspP as adaptive genetic provided successful extension in viability in unfavorable environment, had adverse effects on B. glumae colonization and virulence in the host. 세균벼알마름병원균은 호기성 식물 병원균으로써 호의적이지 않은 환경에서 생존하기 위해 운동성 세균 생활방식을 고착성 세균 생활방식으로 전환하고 유전자 희생을 통한 세균막을 형성 후 생존한다. 유전 및 표현형의 환경 적응을 위한 변이는 환경에 가장 적합하게 변이 되는데, 호기성인 세균벼알마름병원균 야생형 BGR1은 공기 순환 없는 액체 배양 조건에서 편모 의존적 운동성으로 대기와 가까운 액체의 경계 면으로 이동하여 생존하고 빠르게 세균막을 이룬다. 대기와 배양액의 경계 면에 도달한 BGR1은 운동성을 잃고 세균막을 이루는 세균 군집의 모양은 고체 배지 배양 시 각기 다르게 나타난다. 촉진된 세균막은 bis-(3′-5′)-cyclic dimeric guanosine monophosphate(c-di-GMP)의 생합성이 증가하여 이루어진 현상으로 호의적이지 않은 생체외 시험관적 조건에서 생존하기 위한 적응이다. 생체외 시험관 적 조건에서 생존하기위한 적응이 성공적으로 BGR1이 살 수 있도록 도움이 되었지만 생체내, 벼에 접종시 병원성이 현저히 감소되거나 사라진 것이 확인되었다.

세균성벼알마름병을 유발하는 Burkholderia glumae에서 phtotoxin인 toxoflavin형성에 있어 acylhomocerin lactons의 역할

박주연 전남대학교 대학원 2007 국내석사

세균성벼알마름병을 유발하는 세균인 Burkholderia glumae는 중요 발병인자인 식물독소 toxoflavin을 생산한다. toxoflavin의 생성과 이동은 quorum sensing에 의해 조절된다고 알려져 있지만 자세한 기작은 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 quorum sensing의 신호물질인 acyl homocerin lactone(AHLs)을 불활성시키는 유전자(aiiA)를 Bacillus sp. 240B1에서 cloning하고 Burkholderia glumae에 발현시킴으로써 acyl homocerin lactone(AHLs)과 관련된 신호전달 기작을 연구하였다. Burkholderia glumae안에서 aiiA의 지속적인 발현으로 인해 Burkholderia glumae가 생산하는 C6-HSL과 C8-HSL이 모두 불활성 되는 것을 real-time PCR과 TLC분석으로 확인하였다. 하지만 유묘부패증상과 벼알마름병은 감소되지 않았으며 toxoflavin의 생합성 유전자(toxA)의 전사와 발현 또한 감소되지 않았다. 이러한 결과 QS의 신호물질은 중요병원인자인 toxoflavin의 생성과 조절에 관여하지 않는다고 추정된다. Burkholderia glumae the cause of bacterial rice grain rot produces a broad-host range phytotoxin, called toxoflavin, which is a key to the pathogenicity of the bacterium in rice. It has been reported that the production and transport of toxoflavin are regulated by quorum sensing. Because the signal pathway involved in quorum sensitivity and its connection with pathogenicity of B. glumae has been resolved, an N-acyl-homoserine lactonase (aiiA) gene from Bacillus sp. 240B1 was introduced into B. glumae. The aiiA gene of Bacillus sp. strain 240B1 was amplified with a specific primer set by PCR and the native promoter replaced with the constitutive promoter from the nptII gene. Transformation of B. glumae strains with aiiA inhibited production of its quorum sensing signals but did not reduce the disease incidence of rice seedling rot and rice grain rot. The transformants did not reduce transcription of the toxoflavin biosynthetic operon (tox operon) nor the translation of the mRNA. Our results indicate that factors other than quorum sensing molecules, acyl homoserine lactones, in B. glumae influence the expression of the virulence factor, toxoflavin.

Multifunctional Roles of GluS-GluR Two-Component Regulatory System in Burkholderia glumae

마룬가 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Burkholderia glumae는 다양한 미생물 유기체들이 어떻게 다양한 환경에서 진화, 적응하는지에 대한 통찰력을 제공하는 다양한 생물학적 기능 시스템들을 가지고 있다. 이러한 시스템들에 대한 일부의 복잡성에도 불구하고 본 연구는 일반적인 세균에서의 정보처리 흐름의 기초적 역할을 담당하는 two-component regulatory systems (TCS)의 패러다임을 제시하고자 한다. mini-Tn5를 사용한 B. glumae BGR1의 mini-Tn5 무작위 돌연변이 유도체 중 하나는 Luria–Bertani (LB) 배지에서 필라멘트 모양의 세포형태로 발견되었다. 이 돌연변이 유도체에 대한 분자 및 유전적 분석은 이것이 two-component regulatory systems 반응 조절 유전자인 gluR (BGLU 1G13360)에 mini-Tn5 삽입 돌연변이를 가지고 있음을 밝혔다. 이 gluR 의 전사방향 아래에서 TCS 감지-인산화효소인 gluS (BGLU 1G13350)가 발견되어 B. glumae BGR1의 GluS-GluR TCS 의 기능과 역할을 추적할 수 있게 되었다. gluR 돌연변이는 LB 배지에서 필라멘트 세포를 형성한 gluS 돌연변이와 달리 42C에 민감하며, 세포 분열 및 세포벽 (dcw) 생합성을 담당하는 유전자들의 발현을 wild type에 비해 증가되었기에 GluR을 세포 분열의 필수 조절 인자로 파악하였다. TCS는 감지-인산화효소가 환경 신호를 감지하여 반응 조절기에 전달하여 적절한 세포 반응을 유도하는 체계적인 시스템을 통해 다양한 세균 활동을 조절한다. 이 연구에선 B. glumae에서 GluR이 세포 분열을 시작하는 외부 신호로 감지하는 것을 글루타민과 글루타메이트로 확인했다. 또한, GluR은 담배 잎에서 과민성 반응의 유도와, 숙주인 벼에서의 완전한 독성발현 및 식물의 방어기작인 과산화수소의 해독을 위해 필요했다. 이 모든 것은 B. glumae의 병원성, 생존 및 환경적응의 중요한 요소들에 GluR이 관여하는 것이다. GluR은 III 형 분비 시스템 및 망간 항산화효소 유전자 katM과 직접 상호 작용하여 병원균의 독성 및 병원성을 촉진한다. 이 연구에서는 GluS-GluR이 B. glumae의 β- 락탐 항생제 내성을 조절하는 것에 기능적으로 연결되어 있으나, 서로 구별되는 메커니즘을 통해 항생제 내성이 만들어짐을 추가로 보여주었다. gluS 또는 gluR의 비활성화는 β-lactam 항생제에 대한 내성을 부여한 반면, wild type은 이러한 항생제에 민감하였다. 이러한 표현형은 wild type에 비해 TCS 돌연변이체에서 β-락탐 분해효소 및 페니실린 결합 단백질을 코딩하는 유전자들의 발현이 현저하게 증가된 것에 뒷받침된다. 전반적으로, 본 연구는 TCS가 세균의 정교한 조절 시스템에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 더하고, 항생제 내성 반응에 대한 새로운 관점을 제공하며, 병원성 세균의 성공적인 제어를 위한 새로운 치료 방법을 제공 할 수 있다. Burkholderia glumae, just like any other microorganism, has a variety of adaptable biological systems that provide insight into how these organisms evolve, adapt, and function in a variety of environments. Despite the complexity of some of these systems, this work sheds light on the two-component regulatory systems (TCSs) paradigm, which serves as the basis for information flow throughout bacteria. Random mutagenesis of B. glumae BGR1 with mini-Tn5 resulted in a cell filamentation in Luria–Bertani (LB) medium in one of the mini-Tn5 derivatives. Molecular and genetic analysis revealed that gluR (BGLU 1G13360), a two-component system response regulator gene, carried the mini-Tn5 insertional mutation. A putative sensor kinase, gluS (BGLU 1G13350), was found downstream of gluR, prompting an exploratory study of the GluS-GluR TCS functional roles in B. glumae BGR1. The gluR mutant, unlike the gluS mutant formed filamentous cells in LB medium, was sensitive to 42C, and the expression of genes responsible for cell division and cell-wall (dcw) biosynthesis were elevated at transcription levels compared to the wild type, classifying GluR as an essential regulatory factor for cell division. TCSs regulate a variety of bacterial activities via an organized system in which the sensor kinase passes environmental cues to the response regulator, which decodes an appropriate cellular response. Accordingly, this study identified glutamine and glutamate as extrinsic cues that initiate cell division in B. glumae via GluR. Notably, GluR, and not GluS was also required for elicitation of the hypersensitive response in tobacco leaves, full virulence in host rice plants, and detoxification of hydrogen peroxide; all of which are important factors in the pathogenicity, survival, and fitness of B. glumae. GluR directly interacts with the type III secretion system and a manganese catalase gene katM to promote virulence and fitness of the pathogen. This study further showed that GluS-GluR is a functional TCS pair regulating β – lactam antibiotic resistance of B. glumae, but through a distinct mechanism. The inactivation of gluS or gluR conferred resistance against β-lactam antibiotics, whereas the wild type was susceptible to those antibiotics. This phenotype was supported by the significantly increased expression of genes encoding metallo-β-lactamases and penicillin-binding proteins in the TCS mutants compared to those in the wild type. Overall, this study adds to our understanding of how TCSs affect bacteria's sophisticated molecular systems, gives a new perspective on antibiotic resistance processes, and may provide a novel therapeutic approach for the successful control of bacterial pathogens.

Regulation of universal stress protein genes by quorum sensing and RpoS in burkholderia glumae

김홍섭 서울대학교 대학원 2013 국내박사

Burkholderia glumae possesses a quorum sensing (QS) system mediated by N-octanoyl-homoserine lactone (C8-HSL) and its cognate receptor TofR. TofR/C8-HSL regulates the expression of a transcriptional regulator, qsmR. We identified one of the universal stress proteins (Usps), Usp2, from a genome-wide analysis of QS-dependent proteomes of B. glumae. In the whole genome of B. glumae BGR1, 11 usp genes (usp1 to usp11) were identified. Among the stress conditions tested, usp1 and usp2 mutants died 1 h after heat shock stress, whereas the other usp mutants and the wild-type strain survived for more than 3 h at 45°C. The expression of all usp genes was positively regulated by QS, directly by QsmR. In addition, the expression of usp1 and usp2 was dependent on RpoS in the stationary phase, as confirmed by the direct binding of RpoS-RNA holoenzyme to the promoter regions of the usp1 and usp2 genes. The expression of usp1 was upregulated upon a temperature shift from 37℃ to either 28℃ or 45℃, whereas the expression of usp2 was independent of temperature stress. This indicates that the regulation of usp1 and usp2 expression is different from what is known about Escherichia coli. Compared to the diverse roles of Usps in E. coli, Usps in B. glumae are dedicated to heat shock stress. 대부분의 세균들은 살아가면서 여러가지 환경적인 스트레스 즉, 영양결핍, 온도 스트레스, 산화적 스트레스 그리고 독성 물질등과 같은 스트레스에 노출되어 있다. 이런 환경적인 스트레스를 극복하기 위해서 세균들은 스스로를 방어하기 위한 기작을 가지고 있다. 위와 같은 여러가지 스트레스에 반응하는 유전자 중 하나가 universal stress protein 인 usp 유전자이다. 본 연구는 세균성 벼알마름병을 일으키는 Burkholderia glumae가 quorum sensing (QS)이라는 밀도인식 기작과 stationary phase sigma factor로 알려져 있는 Rpos에 의해서 universal stress protein 유전자의 발현조절 기작과 여러가지 스트레스 중 heat shock stress에 중요한 역할을 한다는 사실을 밝혔다. B. glumae은 신호물질로 N-octanoyl-homoserine lactone (C8-HSL)을 사용하여 cell과 cell 사이에 의사소통을 하는 TofI/TofR QS system을 가지고 있다. tofI는 autoinducer인 C8-HSL를 합성하는 유전자이며, tofR은 이 autoinducer의 receptor 유전자이다. 이 TofR/C8-HSL의 복합체는 toxoflavin의 생합성과 IclR type transcriptional regulator인 qsmR을 조절한다. 우리는 B. glumae의 QS에 의존적인 단백질체 분석을 통하여 universal stress protein들 중 Usp2 단백질을 동정하였다. B. glumae BGR1 전체 genome에서 총 11개의 usp 유전자 (usp1 부터 usp11) 들을 동정하였다. 스트레스 조건에서 실험한 결과 usp1 mutant와 usp2 mutant들은 heat shock stress 후 1시간 내에 죽은 반면, 다른 usp mutants들과 wild-type인 BGR1은 45℃에서 3시간 이상 생존하였다. 모든 usp 유전자들의 발현은 QS에 의해 positive하게 조절되며, 직접적으로는 QsmR에 의해 조절된다. 추가적으로 usp1과 usp2 의 발현은 stationary phase에서 sigma factor인 RpoS에 의해서도 조절된다. 이것은 usp1과 usp2의 promoter region에 RpoS-RNA holoenzyme이 직접 binding하는 것으로 확인을 하였다. usp1의 발현은 37℃에서 28℃ 또는 45℃로 온도 shift에 의해서도 upregulation 되었다. 반면에 usp2의 발현은 온도 스트레스와는 무관하다. 이것은 usp1과 usp2의 발현 조절이 기존에 밝혀져 있는 E. coli의 기작과 다르다는 것을 나타낸다. usp1과 usp2는 heat shock stress 조건에서 B. glumae의 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.

The Lipopolysaccharide of Burkholderia glumae Plays a Role as a Virulence Factor and a Barrier from External Environment

이채영 부산대학교 대학원 2019 국내석사

Burkholderia glumae BGR1 is a Gram-negative plant pathogen and has been shown to cause grain rot, sheath rot and panicle blight to rice. Gram-negative bacteria usually have lipopolysaccharide (LPS) composed of the three parts: lipid A, core-oligosaccharide (core-OS) and O-antigen. Core-OS attached between lipid A and O-antigen is divided into an inner-core and an outer-core, which is structurally distinct from other Gram-negative bacteria. O-antigen consists of oligosaccharide subunits composed of various sugars and is exposed to external environmental conditions. Previous studies have shown that LPS is known to be a barrier from the outside environment because it is located in the bacterial outer membrane, and therefore the susceptibility changes due to LPS deficiency under antimicrobial peptide materials or various external stress conditions. In this study, the role of LPS in B. glumae was investigated by mutating wbiFGHI operon and waaC that are affected to O-antigen and core-OS synthesis, respectively. To determine whether B. glumae LPS is associated with virulence, the production of exopolysaccharide (EPS), bacterial motility and virulence to rice were tested about LPS-deficient mutant strains. It has also been investigated whether LPS acts as a barrier to external factors by observing the survival rate of LPS deficient mutant strains and the wild-type under various stress conditions that can be obtained from hosts or environment. A core-OS mutant was not significantly different from BGR1 wild-type in the measured EPS amount and hydrogen peroxide resistance. But it was more sensitive against antimicrobial peptide substances (polymyxin B and SDS) and under various environmental stress conditions (low pH, high osmolarity and saline) than the wild-type. Each mutation of wbiFGHI operon gene involved in the synthesis of O-antigen showed a similar response like BGR1 wild-type under all conditions tested. The virulence and motility test results of LPS deficient strains were similar. O-antigen mutants did not differ greatly in motility and disease to the actual host compared to BGR1 wild-type, but the motility of the core-OS mutant strain was greatly reduced and the virulence was also significantly reduced. This decrease in virulence may be due to reduced motility or the antimicrobial peptides of the host on the weakened outer membrane. And its complementary strain restored virulence like the wild-type level. Hydrogen peroxide reaction, EPS production and bacterial motility are all known to be associated with quorum sensing (QS) of B. glumae. However, according to the experimental results, there was no significant difference between the wild-type and the LPS mutants to hydrogen peroxide reaction and the production of EPS, but the motility of the core-OS mutant strain was greatly decreased only. Thus, the deficiency of LPS in B. glumae may not be directly related to QS but may be thought to affect only motility through other pathways. These results indicated that LPS of B. glumae BGR1 can act as a barrier in the bacterial outer membrane against antimicrobial peptides and various stress conditions. In addition, LPS could act as a virulence factor.

Investigation of Virulence Factors in Burkholderia glumae BGR1 through Mutant Analysis and Yeast Two-hybrid Screening

김진년 부산대학교 대학원 2016 국내석사

Burkholderia glumae는 벼에서 세균성 벼알 마름병 (Bacterial panicle blight, BPB) 유발하며, 이로 인한 벼의 피해는 전세계적으로 매우 심각한 실정이다. 따라서 벼를 재배하는 국가들에 있어서 B. glumae의 병원성 기작과 주요 인자에 대한 연구는 매우 중요하다. B. glumae의 병원성은 일반적으로 Quorum-sensing (QS) system에 의해 조절되는 다양한 병원성 인자들의 복합적인 작용에 의해 유발된다고 알려져 있으나 아직까지 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 현재까지 알려진 B. glumae의 병원성 인자로는 toxoflavin, lipase, type III effectors, 편모에 의한 이동성이 있다. 이전의 연구에서 RNA-seq 기술과 생물정보학을 통해 숙주인 벼에 감염된 형태의 in vivo 조건과 실험적 환경의 in vitro 조건에서 B. glumae BGR1의 유전자 발현 차이를 비교∙분석하였다. 이러한 분석을 통해, in vivo와 in vitro 다른 조건에서 B. glumae BGR1의 유전자 발현 차이가 10배 이상 되며, QS system과 연관성이 낮은 B. glumae BGR1의 새로운 20개 병원성 인자 후보 유전자들을 선정하였다. 본 연구에서는 선정된 B. glumae BGR1의 새로운 20개 병원성 인자 후보 유전자들에 대하여 각각의 상실 돌연변이체를 구축하고, 이에 대한 이동성과 병원성 표현형을 확인하기 위해 bacterial swarming motility assay와 rice stem inoculation assay 실험을 수행하였다. 그 결과 흥미롭게도 SLM11 (bglu_1g30730, TetR family transcriptional regulator)과 SLM19 (bglu_1g05000, Histone H1-like protein) 돌연변이체에서 그 이동성과 병원성이 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 돌연변이체 실험을 통해 확인된 B. glumae BGR1의 병원성 인자, SLM11과 SLM19에 대하여 숙주인 벼의 단백질과 상호작용을 확인하기 위해 yeast two-hybrid (Y2H) 실험을 수행하였다. 먼저 Y2H assay 실험을 통해 생물적∙환경적 요인의 스트레스에 반응하는 벼의 특이적 단백질들과 상호작용 여부를 확인하였다. 그 결과, SLM11에 대하여 WRKY90 (SUSIBA2-like protein)과 XB12 (CS domain containing protein)의 벼 스트레스 반응 단백질과 상호작용 반응을 확인할 수 있었다. 이후 벼 스트레스 반응 단백질과 상호작용을 확인할 수 있었던 SLM11에 대하여 실제로 B. glumae BGR1을 감염시킨 벼의 cDNA library에서 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해 Y2H screening 실험을 수행하였다. 그 결과, 벼에서 생물적∙환경적 요인의 스트레스에 반응하는 aconitate hydratase protein을 비롯하여 병원성 신호를 인지하는 C2 domain containing protein, 가뭄 스트레스에 반응하는 vacuolar ATPase G subunit. 활성산소의 생성을 억제하는 thioesterase family protein, 식물 마름병에 대한 해독 작용을 하는 heavy metal transport/detoxification protein 등과 상호작용 반응을 확인할 수 있었다. 이것은 실제로 B. glumae BGR1이 숙주인 벼에 질병을 유발함에 있어 병원성 인자로 SLM11이 벼의 방어적 기능과 연관된 단백질들에 작용할 수 있음을 시사한다. B. glumae BGR1의 병원성 인자에 대한 연구에 있어서 상실 돌연변이체를 구축하고, 이에 대하여 bacterial swarming motility assay와 rice stem inoculation assay의 수행은 유용한 연구 방법으로 활용 될 수 있을 것으로 여겨진다. 아울러 이러한 방법을 통해 확인된 병원성 인자에 대하여 숙주인 벼의 단백질들과 상호작용 여부를 Y2H screening 실험을 통해 탐색함으로써, 이후 B. glumae BGR1의 병원성과 숙주인 벼의 방어 기작을 이해하는데 도움이 될 것으로 여겨진다.

세균성벼알마름병원균 burkholderia glumae의 사상형 형성 기작 연구

황세영 동아대학교 대학원 2022 국내석사

세균성벼알마름병을 유발하는 Burkholderia glumae는 최근 이상기후와 토양의 산성화로 인해 국내에서 발병률이 증가함에 따라 효과적인 방제가 요구된다. 이전 연구를 통해 벼 발아 시 형성되는 polyamine 중 하나인 agmatine에 의한 B. glumae의 사상형 세포 형성은 산, 저온, 산화 스트레스 등에 내성을 가져 생존력이 유지됨을 확인하였다. 본 연구진은 추가 연구를 통해 agmatine에 의해 사상형 세포 형성이 유도되었을 때 B. glumae 세포 외 Reactive oxygen species (ROS) 증가와 세포 내 ROS 감소 그리고 pH 감소가 유도됨을 확인하였다. 또한 사상형 세포를 형성한 B. glumae는 합성되는 toxoflavin 증가와 이동성에 제한이 생김을 확인하였으며 생물막 형성이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 사상형 세포 유도에 pH 스트레스가 원인이 된다는 것을 확인하였으며 사상형 세포로 인한 독성인자의 발현 증가는 벼 모종에 치명적인 요인으로 작용할 가능성을 제시한다. 더불어 식물 방어반응은 B. glumae에게 스트레스로 작용될 것이며 이는 B. glumae의 사상형 세포의 형성을 유도할 가능성을 제시한다. 생태적으로 식물세포에서 B. glumae의 형태 변화와 이동을 확인하기 위해 벼 종자와 벼 잎집에 BGR1-GFP strain을 처리하여 형광 발현을 관찰하였다. B. glumae의 사상형 세포는 식물세포 내 침입 전 식물 세포벽 위에 위치하였으며 세포 분화 유도로 생성된 단세포의 BGR1-GFP는 식물세포 내에 위치함을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 B. glumae의 사상형 세포 형성 유도는 기주 식물의 방어반응으로부터 나타날 수 있으며 식물 세포 침입에 있어 중요한 요소로 작용할 수 있는 가능성을 제시한다. Burkholderia glumae, which causes rice bacterial blight, is required to be controlled effectively as the incidence rate of Burkholderia glumae is increasing in Korea due to the recent abnormal climate and soil acidification. Previous studies confirmed by agmatine that the formation of filamentous cells of B. glumae, one of the polyamine formed during rice germination, is resistant to acid, low temperature and oxidative stress. In this study shown that when filamentous cell formation induced by agmatine, B. glumae extracellular Reactive Oxygen Species (ROS) increases, intracellular ROS decreases, and pH decreases are induced. In addition, filamentous cells of B. glumae confirmed that the increase in synthesized toxoflavin and mobility were limited, and biofilm formation has increased. These results confirmed that pH stress is a factor of filamentous cell formation, and the increased expression of virulence factors. Suggesting the possibility of acting as a fatal factor for rice seedlings. In addition, the plant defense response will act as stress on B. glumae, suggesting induced the formation of filamentous cells. Fluorescence expression was observed by treating BGR1-GFP strain on rice seeds and rice leaf sheath to ecologically confirm the change of B. glumae in plant cells. Filamentous cells are located on the plant cell wall with single cells. Therefore, in this research, B. glumae's filamentous cell formation may appear from the plant defense responses and suggests the possibility of acting as an important factor in plant cell invasion.

Regulation of methionine biosynthesis genes by quorum sensing in Burkholderia glumae

정혜성 서울대학교 대학원 2014 국내석사

Burkholderia glumae is a Gram-negative bacterium that produces a broad-spectrum phytotoxin, called toxoflavin. Toxoflavin production is dependent on the TofI/TofR quorum sensing system, which is mediated by N-octanoyl homoserine lactone (C8-HSL). C8-HSL is biosynthesized by TofI and its cognate receptor is TofR. The TofR/C8-HSL complex activates the expression of toxoflavin biosynthesis and an IclR-type transcriptional regulator gene, qsmR. Quorum sensing is a cell-to-cell signaling mechanism that refers to the ability of bacteria to respond to small diffusible autoinducers. When an autoinducer reaches a critical threshold, the bacteria detect and respond to the signals to alter gene expressions. Autoinducer is a byproduct of the activated methyl cycle (AMC), which is a central metabolic pathway responsible for the methylation of cellular components and the recycling of certain sulfur-containing amino acids. The last step of AMC involves the methylation of homocysteine to produce methionine. In Escherichia coli, there are two different enzymes, MetH and MetE, that catalyze methionine biosynthesis. MetH is dependent on vitamin B12 whereas MetE is not. In B. glumae, there are two metE homologs, metE1 and metE2, and a metH gene is split into two genes, metH1 and metH2. The objectives of this study are to determine if methionine biosynthesis is regulated by quorum sensing and identify regulation mechanisms of quorum sensing-dependent methionine biosynthesis genes in B. glumae. The metE1, metE2, or metH1-2 mutant showed similar growth rates as the wild type strain BGR1 in M9 minimal medium supplemented with 0.2% glucose. The metE1, metE2, and metH1-2 triple mutant was a methionine auxotroph. Autoinducer assay using a Chromobacterium violaceum biosensor on TLC plates indicated that there was no significant difference in C8-HSL production between the methionine biosynthesis gene mutants and the wild-type strain. Vitamin B12 bioassay provided indirect evidence for the vitamin B12 biosynthesis in B. glumae. Expression of metE1 is up-regulated by quorum sensing as proved by reverse transcription and real-time PCR experiments. Expression of metE2 was not expressed at a detectable level; however, its expression was activated in the absence of metH in a QS-dependent manner. These results indicate that methionine biosynthesis is controlled by quorum sensing; however, its biological meaning is still under investigation.