인간 BCRP를 발현시킨 MDCK cell line의 구축과 그 모델의 응용에 관한 연구

이재일 서울대학교 대학원 2013 국내석사

약물상호작용(DDI)의 중요성이 날로 강조되면서 약물수송체 (drug transporter)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 미국 FDA는 약물상호작용에 큰 영향을 미치는 7가지 주요 약물수송체들을 발표하고 신약허가 과정에서 이들에 대한 약물상호작용 평가 자료를 함께 첨부하도록 지시하고 있다. 따라서 신약개발 과정에서 수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 평가할 수 있는 스크리닝 체계의 구축은 매우 시의적절하며 실용적인 의미를 갖는다 할 수 있다. 본 실험에서는 위 중요 수송체 중 하나인 BCRP를 cloning하였으며 그 gene의 기능을 MDCK cell에 안정적으로 발현하는 세포주를 구축하고자 하였다. RT-PCR과 western blot연구를 통해 mRNA와 protein의 존재를 확인하였고 방사활성으로 표지된 기질물질의 수송활성을 평가함으로써 BCRP가 잘 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 시중에 상용화 되어있는 8 가지 약물들을 선정하고 이들에 대한 Inhibition screening 연구를 진행하였다. Transport 방식을 이용한 실험에서 rosuvastatin과 pravastatin에서만 sigmoid한 inhibition의 상호작용이 관찰되었으며 이들에 대한IC50값을 계산할 수 있었다. Rosuvastatin과 pravastatin의 IC50값은 각각 9.24 ± 6.40 μM과 1330 ± 865 μM 이였으며 이는 문헌상의 값과 비슷하였으며 보다 낮은 IC50값을 갖는 rosuvastatin이 BCRP와 더 높은 친화력을 갖는 것으로 사료된다. 본 연구에서 구축한 약물수송체 스크리닝 시스템은 신약후보물질에 대한 약물수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 개발 초기단계에서 예측할 수 있으며 궁극적으로 신약개발 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대된다. FDA recently identified seven transport systems, including BCRP (ABCG2), as the transporters that may potentially be related to drug-drug interaction (DDI). While in vitro screening system that expresses the human BCRP is widely available, the availability is limited to only academia and, thus, the practical application (e.g., screening of new chemical entities) has not been possible. Therefore, the objective of the study was to clone and functionally express the efflux transporter in MDCK cells without such limitation. BCRP was cloned and stably expressed in MDCK cells using standard protocols. RT-PCR and western blot were carried out to verify the existence of mRNA and protein in the cell. In addition, the function of the efflux transporter, as expressed by basal to apical transport rate, was determined using radio-labeled substrate. To further study the applicability of the screening system, eight test compounds (rifampicin, rosuvastatin, pravastatin, digoxin, cyclosporin A, cimetidine, cidofovir and clevudine) that are commonly used in the clinic were selected and the function determined. Based on PT-PCR and western blot studies, the mRNA and the protein corresponding to the efflux transporter were readily detected, suggesting that the transporter is expressed. Amongst the eight test compounds, only rosuvastatin and pravastatin were found to interact with the transporter. The IC50 values for rosuvatatin and pravastatin were 9.24 ± 6.40 and 1330 ± 865 μM, respectively, indicating that the kinetic variables were comparable to the literature values. Therefore, BCRP assay system established in this study may be practically useful in predicting DDIs in early phase of drug development.

한국인에서 BCRP의 유전적 다형성이 로수바스타틴의 약물동태에 미치는 영향

최민제 계명대학교 일반대학원 2019 국내석사

로수바스타틴은 HMG-CoA 환원효소 억제제(statin)의 한 종류로서 콜레스테롤의 합성을 억제하여 이상지질혈증에 사용한다. 로수바스타틴은 organic anion-transporting polypeptide (OATP)에 의해 혈액에서 간으로 흡수되며, breast cancer resistance protein (BCRP)에 의해 장관으로 배출된다. 로수바스타틴을 투여하였을 때 약물을 대사시키는 효소나 수송체의 유전적 다형성이 약물의 체내동태에 영향을 주어 사람마다 약물반응이 다르게 나타날 수 있다. 따라서 본 연구에서는 로수바스타틴의 체내동태에 관여하는 수송체중의 하나인 BCRP의 유전적 다형성의 빈도와 유전적 다형성에 의한 로수바스타틴의 약물동태를 알아보고자 하였다. 유전형 분석은 건강한 한국인 402 명을 대상으로 pyrosequencing (BCRP c.376C>T와 BCRP c.421C>A)방법으로 수행하였다. BCRP (c.376C>T/c.421C>A)유전형 분석결과를 바탕으로 CC/CC (group Ⅰ, n=9), CC/AA (group Ⅱ, n=8) 그리고 CT/CC, CT/CA (group Ⅲ, n=4)의 유전형군으로 분류하였다. 로수바스타틴 10 mg을 단회 경구 투여하였고, 약물 투여 전(0 시간)과 약물 투여 후 36 시간까지 혈액시료를 수집하고 혈장 내에 있는 로수바스타틴의 농도를 LC-MS/MS를 이용하여 측정하였다. BCRP c.376C>T와 c.421C>A의 빈도는 각각 1.6%와 27.0%로 나타났다. BCRP (c.376C>T/c.421C>A)유전형의 빈도는 wild-type인 CC/CC가 51.7%로 가장 높았고, CC/CA, CC/AA, CT/CC 그리고 CT/CA는 각각 37.1, 8.0, 2.2 그리고 1.0%로 나타났다. Ⅱ군은 Ⅰ군보다 AUC0-36값이 1.87배 증가하였고(P < 0.05), CL/F는 45.6%감소하였다(P < 0.01). Ⅲ군은 Ⅰ군보다 AUC0-36값이 2.28배 증가하였고(P < 0.01), CL/F는 54.1%감소하였다(P < 0.01). 유전형군에 따른 반감기는 유의한 차이를 보이지 않았다. 본 연구 결과 BCRP c.421C>A와 c.376C>T의 유전적 변이로 인한 BCRP의 기능이 감소되어 약물의 혈중농도는 증가하였다. 그리고 BCRP c.376C>T의 유전적 변이는 동양인에서만 특이적으로 발생하며, BCRP c.421C>A 변이 보다 단백질의 기능이 더 감소하여 wild-type과 대조하였을 때 약물의 혈중농도를 더 증가시켰다. 따라서 BCRP c.376C>T의 변이가 c.421C>A의 변이보다 임상적으로 더 큰 영향을 줄 것이다. 이를 통하여 임상에서 BCRP의 유전형에 따라 로수바스타틴을 투여하여 부작용 발생 위험을 낮출 수 있으며 맞춤약물 치료의 근거를 제공할 수 있을 것으로 사료된다. Rosuvastatin, a type of HMG-CoA reductase inhibitor (statin), inhibits cholesterol synthesis and is used to treat dyslipidemia. It is absorbed from the blood into the liver by organic anion-transporting polypeptide (OATP) and is then released into the intestinal tract by breast cancer resistance protein (BCRP). Response to rosuvastatin may vary across individuals as genetic polymorphisms in the transporters or enzymes that metabolize rosuvastatin have varying effects on its pharmacokinetics. Therefore, in the present study, the frequency of genetic polymorphisms in BCRP and their effects on the pharmacokinetics of rosuvastatin were investigated. Genotyping was performed via pyrosequencing (BCRP c.376C>T and BCRP c.421C>A) on 402 healthy Koreans. Based on the BCRP genotype (c.376C>T/c.421C>A) present, the participants were classified into three groups: CC/CC (group Ⅰ, n=9), CC/AA (group Ⅱ, n=8), and CT/CC, CT/CA (group Ⅲ, n=4). Rosuvastatin (10 mg) was orally administered once; blood samples were collected before administration (hour 0) and 36 hours after drug administration to measure plasma rosuvastatin concentrations using LC-MS/MS. The frequencies of BCRP c.376C>T and c.421C>A were 1.6% and 27.0%, respectively. The frequency of BCRP (c.376C>T/c.421C>A) CC/CC, the wild-type, was the highest (51.7%), followed by that of CC/CA (37.1%), CC/AA (8.0%), CT/CC (2.2%), and CT/CA (1.0%). The AUC0-36 was 1.87 times higher (P < 0.05) and CL/F was 45.6% lower (P < 0.01) in group II than in group I. The AUC0-36 was 2.28 times higher (P < 0.01) and CL/F was 54.1% times lower (P < 0.01) in group III than in group I. There were no significant differences in the half-life across the three groups. We observed that BCRP c.421C>A and c.376C>T genetic mutations negatively affected BCRP functioning, thereby increasing drug concentration in the blood. Furthermore, the BCRP c.376C>T mutation, which is specifically found among Asians, weakens the functions of BCRP to a greater extent than BCRP c.421C>A mutation, thereby leading to a higher drug concentration in the blood than that in individuals with the wild-type genotype. Therefore, the BCRP c.376C>T mutation may have a greater clinical impact than the c.421C>A mutation. Administration based on BCRP genotype can lower the risk of adverse reactions of rosuvastatin, thus allowing customized drug therapy.

유방암내성단백질(BCRP)를 과발현하는 항암제내성암세포의 선별 및 프라보노이드 BCRP억제제의 탐색

이향숙 조선대학교 2006 국내석사

Background and Objective: The overexpression of breast cancer resistant protein (BCRP) confers multidrug resistance (MDR) on cancer cells. MDR cells could be sensitized to anticancer drugs when treated concomitantly with a chemosensitizer. In this study, flavonoids have been screened for the development of chemosensitizers reversing BCRP-mediated MDR using a BCRP-overexpressing cancer cell line. Materials and methods: The mitoxantrone-resistant breast cancer cell subline was selected from the parental MCF-7cells by treating mitoxantrone chronically. Expression of BCRP were determined using Western blot and RT-PCR analyses. Chemosensitizing effects of flavonoids were determined by the MTT assay. Results: The human breast cancer cell subline MCF-7/MX5 cells selected in the presence of 5 μg/ml mitoxantrone (MX) were more resistant to MX (15.7 (5.1 times) and 5-fluorouracil (4.4 times) than were the MCF-7cells. Western blot and RT-PCR analyses revealed that the MCF-7/MX5 cells overexpressed BCRP mRNA and protein, whose activity was inhibited by nicardipine, a known BCRP inhibitor. Of eleven flavonoids tested 5,7,4′-trimethoxyflavone, 5,6,7,3′,4′,5′-hexamethoxyflavone and 5,6,7,3′,4′-pentamethoxyflavone showed higher chemosensitizing effects than nicardipine. Conclusion: The mitoxantrone-resistant brest cancer cell subline MCF-7/MX5 could provide a useful model for the screening of chemosensitizers of BCRP-mediated MDR. It is anticipated 5,7,4′-trimethoxyflavone, 5,6,7,3′,4′,5′-hexamethoxyflavone and 5,6,7,3′,4′-pentamethoxyflavone could be candidates for BCRP inhibitors.

OATP1B1과 BCRP 유전자형에 따른 rosuvastatin의 약동학, 지질강하효과, 그리고 지질대사체변화 분석

김태은 서울대학교 대학원 2012 국내박사

Rosuvastatin은 HMG-CoA reductase inhibitor (statin)의 한 종류로서, 혈중 low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) 농도를 낮추어 심혈관계 질환을 예방하는 목적으로 사용된다. 스타틴계 약물은 organic anion-transporting peptide(OATP)에 의해 간세포 내로 들어가 작용을 나타내며, breast cancer resistance protein(BCRP)은 일부 스타틴에서 약물 흡수를 저해하고 제거를 담당하는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 연구에서는 OATP1B1과 BCRP의 유전자형에 따른 rosuvastatin의 약동학, 지질강하효과를 평가하고 지질대사체를 탐색하였다. 총 442명의 혈액으로부터 OATP1B1의 388A>G, 521T>C, -11187G>A의 세 가지 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 BCRP 421C>A를 검사한 후 OATP1B1에 대하여 388A>G가 존재하는 경우 *1b, 388A>G와 521T>C가 함께 존재하는 경우 *15, 388A>G, 521T>C, -11187G>A가 모두 존재하는 경우 *17로 정의하였다. BCRP C/C 또는 C/A 형이면서 OATP1B1 *1b/*1b, *1b/*15, *1b/*17, *15/*15, *15/*17, *17/*17인 사람 중 자원자에 한하여 스크리닝을 통해 34명의 건강한 성인 피험자를 선별하였다. 각 피험자는 총 21일 동안 1일 1회 rosuvastatin을 투여하였다. 약동학 평가를 위하여 21일 째 rosuvastatin 투여 직전 및 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 24 시간에 채혈하였다. 지질강하효과 평가를 위한 채혈은 rosuvastatin 첫 투약직전 및 5일째, 12일째, 20일째 투약 직전 그리고 마지막 21일째 투약 후 약 24시간 후에 이루어졌다. 지질대사체 평가를 위한 채혈은 첫 투약 24시간 전과 마지막 21일째 투약 직전 및 투약 후 4, 8 시간째 이루어졌다. 약물농도는 liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)로 측정하였고, 약동학 분석은 비구획 모형분석(non-compartmental analysis)을 시행하였다. 521T>C를 포함하고 있지 않은 *1b/*1b, 521T>C를 한 개의 allele에만 포함하고 있는 *1b/*15과 *1b/*17, 521T>C를 양쪽 allele에 포함하고 있는 *15/*15, *15/*17, *17/*17 세 종류의 그룹으로 나누어, 혼합모형을 이용한 분산분석을 통하여 유전자형간 비교를 시행하였다. 유전자형에 따라 rosuvastatin의 약동학적 특성을 비교하면 BCRP C/A 형이 C/C 형보다 Cmax와 AUClast 각각 1.36(confidence interval, 1.06-1.73)배, 1.47(1.18-1.83)배 높았으며 Tmax는 1.22(1.03-1.45)배 연장되었다. OATP1B1에서는 *15/*17형과 *17/*17형의 Cmax가 *1b/*1b형에 비하여 1.97(0.89-4.35)배 높았으며, AUClast는 1.69(0.82-3.45)배 높았다. *15/*17형과 *17/*17형은 *1b/*15, *1b/*17형 에 비해서도 Cmax와 AUClast가 각각 1.68(0.76-3.75)배, 1.50(0.73-3.09)배 높은 양상이었다. LDL-C, total cholesterol, triglyceride, high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)로 확인한 지질강하효과에 있어서는 BCRP 또는 OATP1B1 유전자형에 따른 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 지질대사체 분석하였을 때, oleamide, retinoic acid, pregnanetriol, lysophosphatidylcholine(C18:1) 이 rosuvastatin 투약 후 의미 있게 감소하였다. 결론적으로, OATP1B1 521T>C와 BCRP 421C>A의 유전적 변이는 rosuvastatin의 약동학에는 영향을 미치지만 지질강하효과에는 유의한 영향을 끼치지 않으므로 이에 따른 용량 조절은 필요하지 않을 것으로 생각된다. 또한 rosuvastatin 투여 후 의미있게 감소한 지질대사체들은 rosuvastatin의 효과에 대한 생체표지자(biomarker)의 가능성을 가진다고 하겠다. BACKGROUND Rosuvastatin is a HMG-CoA reductase inhibitor (statin) which is used to prevent the cardiovascular disease by lowering low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) concentration. Rosuvastatin enters into the hepatocyte where they work by organic anion-transporting peptide (OATP)1B1 and it is excreted to bile by breast cancer resistance protein (BCRP). The aim of this study is to evaluate the influence of OATP1B1 and BCRP genotypes on the pharmacokinetics and lipid lowering effect of rosuvastatin and to explore lipid profiles after rosuvastatin administration. METHODS A total of 34 healthy Korean volunteers who have OATP1B1 genotypes of *1b/*1b, *1b/*15, *1b/*17, *15/*15, *15/*17 or *17/*17 and BCRP genotypes of C/C or C/A were enrolled. Subjects were administered rosuvastatin 20 mg once a day for 21 days. Blood samples for pharmacokinetics were obtained before the rosuvastatin administration and 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 24 hours after drug administration on day 21. Blood samples for evaluating lipid lowering effect of rosuvastatin were taken before the first drug administration, before 5h, 12th, 20th drug administration and 24 hours after 21th drug administration. Plasma concentration was analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pharmacokinetic analysis was performed using non-compartmental method. The OATP1B1 genotypes were grouped according to the existence of 521T>C in each allele and the statistical comparisons were conducted by ANOVA using mixed effect model. RESULTS When the pharmacokinetics of rosuvastatin was compared between the genotypes, BCRP C/A exhibited significantly higher Cmax and AUClast by 1.36(confidence interval, 1.06-1.73) folds and 1.47(1.18-1.83) folds, respectively, and prolonged Tmax by 1.22(1.03-1.45) folds, compared to BCRP C/C. The group of OATP1B1 *15/*17 and *17/*17 showed higher Cmax and AUClast by 1.97(0.89-4.35) folds and 1.69(0.82-3.45) folds, respectively, than *1b/*1b. The group of OATP1B1 *15/*15 and *17/*17 exhibited higher systemic exposure than the group of *1b/*15 and *1b/*17 with the geometric mean ratios (confidence interval) of 1.68(0.76-3.75) and 1.50(0.73-3.09) for Cmax and AUClast, respectively. In the lipid lowering effect evaluated by LDL-C, total cholesterol, triglyceride and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), there was no significant difference between OATP1B1 and BCRP genotypes. Lipid profiling showed significant decrease in oleamide, retinoic acid, pregnanetriol, lysophosphatidylcholine(C18:1). CONCLUSION The variants of OATP1B1 521T>C or BCRP 421T>C influence on the pharmacokinetics of rosuvastatin, however, they do not affect the lipid lowering effect of rosuvastatin, which implies that modification of regimen is not needed. The metabolites with significant difference between before and after the treatment, is thought to be the possible biomarkers of the effect of rosuvasatin.

cDNA array를 이용한 BCRP 유전자의 발현조절에 관한 연구

문재훈 仁濟大學校 大學院 2004 국내석사

목적 : 다약제내성을 매개하는 단백질의 하나로 최근에 발견된 breast cancer resistance protein (BCRP)은 기질로서 다수의 항암제를 포함하고 있어 화학요법의 성공여부에 영향을 줄 것으로 예상된다. 이 단백질의 발현이 개인에 따라 차이가 있는지 어떠한 자극에 의해 조절이 되는지에 대한 연구가 거의 없는 실정이어서 본 연구에서는 여러 가지 항암제를 처리한 암세포주의 cDNA array를 이용하여 BCRP의 발현에 영향을 주는 약물들에 대한 검색을 하고자 하였다. 또한 이 단백질이 개인에 따라 차이가 있는지 암조직에서의 발현이 어떻게 나타나는지 공개된 데이터에이스로부터 자료를 확보, 분석하고자 하였다. 방법 : 개인에 따라 암조직에 따른 BCRP 발현량의 변화를 조사하기 위해서 미국 약물유전체 연구네트워크에서 운영하는 PharmGKB 데이터 베이스로부터 52 명의 암환자로부터 암조직 및 정상조직을 분리해 조직별로 BCRP의 발현량을 실시간 RT-PCR 방법으로 분석한 자료를 수집하여 분석하였다. 클로닝한 BCRP cDNA를 주형으로하여 BCRP에 특이적인 방사능 표지된 탐색자를 제작하여, 26 종의 암세포에 26 종의 서로 다른 자극을 처리한 cDNA array에 결합시켰다. 각 spot의 방사능 세기를 스캔하였고, cDNA array상의 cDNA 량을 보정하기 위하여 BCRP실험에 사용하였던 membrane으로부터 결합된 BCRP 탐색자를 제거하고, 방사능 표지된 ubiquitin 탐색자로 다시 반응을 시켜 스캔하였다. 결과 : PharmGKB로부터 수집한 BCHP의 발현자료를 분석한 결과 정상조직에서 BCRP의 발현량은 개인간에 많은 차이를 보이고 있었으며, 동일한 환자에서 얻어진 암조직에서의 발현량과 비교해 볼 때 암발생에 의한 BCRP의 발현량의 증가는 일관성있는 양상을 보이지 않았다. cDNA array 분석 결과 아무런 자극이 없는 상태에서 BCRP의 발현량은 암세포주의 종류에 따라 달랐으며 허파, 피부에서 유래한 암세포와 일부 유방암 유래 세포주에 많이 발현되는 것으로 나타났다. 20여종의 항암제 및 감마선 조사, UV선 조사, 영양분 고갈 등의 자극에 의해 BCRP의 발현량이 변화하는 것으로 나타났는데, 일부세포에서는 감마선 조사에 의한 발현량의 증가가 뚜렷하게 나타났다. 전체적으로 BCRP의 발현의 변화는 암세포의 유래, 암세포의 종류에 따라 다양하게 나타났고 한 가지 자극에 의한 BCRP의 발현조절도 세포에 따라 다르게 나타나는 것으로 알 수 있었다. 결론 : BCRP 유전자의 발현은 개인간에 많은 차이가 있는데, 암의 발생과정에서 일관성있게 발현이 증가하는 것은 아닌 것으로 생각된다 대신에 여러가지의 항암제들이 조직에 따라 암세포의 성질에 따라 BCRP의 발현량을 증가시키는 것으로 나타났다. 항암치료를 위한 UV선 조사나 감마선 조사, heat shock과 같은 물리적인 자극도 BCRF의 발현을 증가시켰다. 이것은 BCRP의 발현이 매우 다양한 요소들의 복합적인 작용에 의해 조절됨을 의미하여 항암치료에서 다약제내성의 심각성을 고려할 때 이 들 조절 인자들에 대한 심층적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. Objectives Breast cancer resistance protein (BCRP), which was recently discovered for its involvement in multidrug resistance, has been thought to affect the efficacy of chemotherapy since many anti-cancer drugs are substrates for this protein. Limited number of reports have been addressed for the individual variation or regulators of the BCRP expression. In the present study, we screened for possible stimuli to regulate the BCRP expression using cDNA array. For the study of individual variation of BCRP expression, the BCRP expression data was retrieved from the public database and analyzed. Methods In order to study individual variation of BCRP expression, the expression profile data that includes BCRP expression measured by relatime RT-PCR in normal or tumor tissues of 52 patients was retrieved from PharmGKB database and analyzed. Radiolabeled BCRP-specific cDNA probe was incubated with Cancer cell cDNA array that includes cDNA spots from 26 kinds of cancer cells treated with 26 different signals. Radioactivity of each spot was scanned. In order to normalize the quantity of cDNA spotted, the same membrane was reprobed with radiolabeled ubiquitin probe and scanned. Results The BCRP expression profile of 52 patients showed wide individual variation and there was no consistent correlation between tumorigenesis and BCRP expression. From cDNA array study, BCRP expression under normal condition was various with the kinds of cancer cells and showed high expression in lung cancer cells, skin cancer cells, and some of breast cancer cells. BCRP expression was changed by the treatment of 20 kinds of anti-cancer drugs, gamma irradiation, UV irradiation, and serum starvation. BCRP induction by gamma irradiation was apparent in several cancer cells. On the whole, the expression profile was dependent on the origin and kind of cancer cells. And the same stimuli showed different effects in different cancer cells. Conclusions BCRP expression showed wide individual variation but seemed not to be induced by tumorigenesis. Instead, various kinds of anti-cancer drugs increased BCRP expression in tissue- and cancer cell-specific manners. Other anti-cancer therapy such as gamma irradiation, UV irradiation, and heat shock also increased BCRP expression in cell type-specific manners. These results suggest that BCRP expression can be affected by combinational effects of different factors and, considering the significance of multidrug resistance phenomenon in clinical aspects, further explorations into such factors will be need.

유방암 내성 단백질 BCRP 발현 저하와 P-glycoprotein 과발현의 관계에 관한 연구

강길 조선대학교 2006 국내박사

P-glycoprotein (Pgp), multidrug resistance-associated protein (MRP) 및 breast cancer resistance protein (BCRP) 등의 세포막 수송체의 과발현은 암세포에 다약물 내성을 일으키는 주된 원인이 되고 있다. 본 연구는 이 수송체들의 발현이 서로 연관되어 있는지 확인하기 위하여 수행되었다. 유전자 발현은 RT-PCR방법, Western blot 및 면역화학염색법으로 분석하였다. 약물 감수성 폐암 세포주인 SK-MES-1/WT세포는 낮은 수준의 Pgp, 중등도 수준의 MRP 및 높은 수준의 BCRP를 발현하였으나, doxorubicin내성 세포주인 SK-MES-1/DX1000세포는 높은 수준의 Pgp, 중등도 수준의 MRP 및 낮은 수준의 BCRP을 발현 하였다. 본 실험에서 관찰된 SK-MES-1/DX1000세포에서 Pgp발현이 증가에 의해 BCRP 발현이 감소하는 현상이 Pgp 억제제(PSC833 및 verapamil)와 MDR1 siRNA를 이용해 Pgp발현을 knock-down시킨 방법으로 부분적으로 회복되었다. 이 결과는 오염된 클론에 의해 얻어진 것이 아니라는 것을 이중 면역화학염색법을 이용하여 공초점 현미경으로 확인하였다. 이 같은 결과는 같은 세포내에서 Pgp가 특이적으로 BCRP발현을 기능적으로 저하한다는 것을 시사한다. PSC833은 SK-MES-1/DX1000세포에서 BCRP발현 및 c-Jun의 인산화를 증가시켰다. Dominant-negative c-Jun (DN-c-Jun)의 발현은 PSC833에 의한 BCRP발현 증가를 부분적으로 차단하였다. 이상의 결과는 폐암 세포주 SK-MES-1/DX1000세포에서 Pgp가 BCRP의 발현을 기능적으로 감소시키며, 이 같은 현상에 c-Jun이 적어도 부분적으로 매개한다는 최초의 증거를 제시하고 있다.

Improved Brain Delivery of Gefitinib via Co-Administration with Dual P-glycoprotein and Breast Cancer Resistance Protein Inhibitors

백유경 이화여자대학교 대학원 2025 국내석사

Blood-brain barrier (BBB) presents a significant obstacle to drug delivery to the brain. P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) are the primary efflux transporters at the BBB, hindering drug entry into the brain. As these transporters function cooperatively, dual inhibition of P-gp and BCRP is essential to enhance drug delivery to the brain, rather than mono-inhibition. Gefitinib is a first-line treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC), which frequently metastasizes to the brain. However, gefitinib is ineffective against brain metastases due to its inability to cross the BBB. This study aims to evaluate whether the brain penetration of gefitinib increases when co-administered with three dual P-gp/BCRP inhibitors – CDK 4/6 inhibitor Ⅳ, BX795, and CGP60474 – thereby expanding its indications as a treatment for brain tumors. We compared the cytotoxicity of gefitinib alone and in combination with the dual inhibitors in vitro using hCMEC/D3 cells. The results showed a significant increase in cytotoxicity with three dual P-gp/BCRP inhibitors. An analytical method using LC-MS/MS was developed to accurately and reproducibly analyze plasma samples and brain homogenates obtained from in vivo studies. The method was validated in compliance with FDA guidelines. In animal experiments, dual inhibitors were co-administered intravenously with gefitinib. While the plasma concentrations of gefitinib were unaffected, the brain-to-plasma ratio significantly increased in the group treated with gefitinib in combination with the dual inhibitors, especially in CDK 4/6 inhibitor IV and CGP60474. These findings demonstrate that co-administration of gefitinib with dual inhibitors improves drug delivery to the brain without affecting its plasma profile. In conclusion, the dual inhibitors hold promise in overcoming BBB-related challenges, thereby enhancing the efficacy of anticancer drugs in treating brain tumors. 혈액-뇌 관문(BBB)은 뇌로의 약물 전달에 중요한 장벽으로 작용한다. 이 장벽에서 주된 배출 수송체인 P-당단백질(P-gp)과 유방암 저항성 단백질(BCRP)은 뇌로의 약물 진입을 방해하며, 이 두 수송체는 협력적으로 작용하기 때문에 P-gp와 BCRP의 이중 억제가 뇌로의 약물 전달을 향상하는 데 필수적이다. 게피티닙은 전이성 비소세포폐암(NSCLC)의 1차 치료제로, 이 암은 뇌로 자주 전이된다. 그러나 게피티닙은 BBB를 통과하지 못해 뇌 전이에 대한 효과가 제한적이다. 본 연구는 세 가지 P-gp/BCRP 이중 억제제인 CDK 4/6 억제제 IV, BX795 및 CGP60474와 함께 투여했을 때 게피티닙의 뇌 침투력이 증가하는지 평가하여 뇌종양 치료제로의 적응증을 확장하는 것을 목표로 하였다. hCMEC/D3 세포를 사용하여 in vitro에서 게피티닙 단독 및 이중 억제제 병용 시 세포독성을 비교했으며 그 결과, 세 가지 P-gp/BCRP 이중 억제제를 병용한 경우 세포독성이 유의미하게 증가함을 확인하였다. 동물 실험에서는 이중 억제제를 게피티닙과 정맥으로 병용 투여하였으며, 혈장 내 게피티닙 농도에는 변화가 없었지만, 게피티닙 병용 투여 그룹에서 뇌 대 혈장 비율이 유의미하게 증가함을 확인하였다. 특히, 양성 대조군으로 사용한 elacridar 처리 그룹에서는 모든 시간대에서 통계적인 유의성이 나타났으나, 이중 억제제 처리 그룹에서는 특정 시간대에서 뇌 대 혈장 비율이 유의미하게 증가하였다. 이 결과를 통해 게피티닙과 이중 억제제 병용 투여가 혈장 농도에 영향을 미치지 않으면서도 뇌로의 약물 전달을 개선할 수 있음을 보여주었다. 결론적으로, P-gp/BCRP 이중 억제제는 항암제의 BBB 투과를 증진함으로써 뇌종양에서 항암제의 효능을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Pharmacokinetic studies of rosuvastatin, an OATP substrate, in mice with vitamin D deficiency

주슬아 가천대학교 메디컬캠퍼스 일반대학원 2024 국내석사

Rosuvastatin은 고지혈증 치료제이며 OATP와 BCRP 기질이다. 비타민 D 결핍은 특히 노인, 임산부, 어린이, 장기 입원 환자에게 흔하게 발생한다. 또한 골다공증, 당뇨병, 심혈관 질환, 일부 암, 결핵과 같은 전염병과도 관련 이 있다. 선행 연구에 따르면 비타민 D가 결핍은 간의 Oatp2b1과 Oatp1a1 발현을 억제하여 rats의 pravastatin에 대한 반응을 감소시킬 수 있다고 보 고되었다. 다른 연구에 따르면 비타민 D가 결핍된 mice에서는 간에서 Oatp1a1, 1a4, 1b2, 2b1의 mRNA 발현 수준이 대조군과 비교했을 때 뚜렷 한 변화가 없다고 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 비타민 D 결핍이 rosuvastatin의 약동학에 미치는 영향과 organic anion transporting polypeptides (OATP) 에 의한 수송 가능성을 조사하기로 하였다. 본 실험에서, rosuvastatin을 1 mg/kg으로 마우스에 정맥 투여했을 때 대 조군과 비타민 D 결핍 그룹에서 rosuvastatin의 혈중 농도, 관련된 parameter, 뇨배설 실험, 변배설 실험에서 모두 차이가 없었다. 그러나 rosuvastatin을 10 mg/kg으로 마우스에 경구 투여했을 때 rosuvastatin의 혈중 농도가 감소하였고, AUClast와 AUCinf 유의하게 감소하였다. 생체이용 률 역시 감소하였다. 추가적인 뇨배설 실험에서는 두 그룹 간에 차이가 없었 으며, 변배설 실험에서는 비타민 D를 결핍 그룹에서 cumulative fecal recovery가 다소 증가하였으나 유의성은 없었다. 이는 rosuvastatin의 약동 학이 경구 투여 시 생체 내 비타민 D 결핍에 의해 크게 영향을 받았음을 시사 한다. 비타민 D가 결핍된 mice의 간과 소장에서 Oatp와 Bcrp 발현 정도를 비 교해봤을 때, 간에서는 Oatp1a1, 1a4, 1b2, 2b1, Bcrp에 유의한 차이가 관 찰되지 않았고, 소장에서의 Bcrp는 차이가 없었으며, Oatp2b1이 유의하게 감소하였다. 이는 비타민 D 결핍이 소장에 있는 Oatp2b1이 rosuvastatin 수 송에 영향을 미침이 관찰되었다. 이 연구를 종합해 보면, mice의 비타민 D 결 핍은 소장의 Oatp2b1이 rosuvastatin의 장 세포로의 이동을 억제하여 소장 에서의 rosuvastatin 흡수를 감소시키고 변으로 더 많이 배설되는 결과를 초 래할 수 있음을 시사한다. 추가로 비타민 D가 결핍된 rats에 rosuvastatin을 정맥 주사했을 때 rosuvastatin의 전신 노출이 감소하고 cumulative urinary recovery는 차이 가 없었으며, cumulative fecal recovery가 유의하게 증가하였다. mice의 결 과와 달리 rats에게 정맥 투여할 경우 약동학적 차이가 나타난 것으로 종의 차이로 인한 것으로 이는 OATP 연구의 난제로, rats을 대상으로 한 추가 연 구에서는 rats에서의 OATP의 잠재성을 고려할 필요가 있음을 시사한다. Rosuvastatin, a treatment of hypercholesterolemia, is well-known to be a substrate of organic anion transporting polypeptide (OATP) and breast cancer resistance protein (BCRP). Considering vitamin D deficiency is widespread in South Koreans, we investigated the pharmacokinetic studies of rosuvastatin, an OATP substrate, in animals fed a vitamin D-deficient diet. When rosuvastatin was administered intravenously at 1 mg/kg in mice, no differences were observed in the systemic exposure, relevant parameters, urinary excretion, and fecal excretion of rosuvastatin in control and vitamin D-deficient mice. However, when administered orally at 10 mg/kg of rosuvastatin, there was a decrease in systemic exposure, with significantly reduced AUClast and AUCinf in mice with vitamin D deficiency. Oral bioavailability was also lessened in the vitamin D-deficient group. Cumulative urinary recovery studies revealed no difference between the two groups, while cumulative fecal recovery showed a slight increase in the vitamin D deficiency group, though not statistically significant. In addition, vitamin D deficiency significantly decreased Oatp2b1 mRNA expression without change of Bcrp level in small intestine of mice, but not in liver. In liver of mice with vitamin D deficiency, no significant changes were observed in Oatp1a1, 1a4, 1b2, 2b1, and Bcrp. Additionally, when rats were intravenously injected with rosuvastatin at 1 mg/kg, there was a decrease in systemic exposure to rosuvastatin. The rats with vitamin D deficiency exhibited a significant increase in cumulative fecal recovery, while cumulative urinary recovery found no substantial difference between the two groups. Additional investigation is needed for rats with vitamin D deficiency. Collectively, vitamin D deficiency significantly affected the pharmacokinetics of orally administered rosuvastatin in vivo mice, likely due to decreased Oatp2b1 expressional level in small intestine. This study suggests the possible risk of OATP-mediated pharmacokinetic changes in vitamin D deficiency.

Rat BCRP의 Cloning과 이를 발현하는 MDCK cell line의 구축

이은정 서울대학교 대학원 2015 국내석사

약물이 체내에서 특정 조직으로 이동할 때 많은 수송체가 관여하는데, 수송체가 약물을 얼마나 조직세포로 잘 흡수하는지, 또는 조직세포 밖으로 내보내는지에 따라 약물의 체내 분포가 달라진다. 이런 중요성을 인식하여 미국 FDA는 여러 약물 수송체 중 약물 상호작용에 주로 관여하는 7가지 수송체를 선정하고, 신약개발 중 신약 후보물질이 약물 수송체와 관련한 약물상호작용을 발생시키는지 검토하도록 권고하였다. 신약개발 단계에서는 인간을 대상으로 약의 유효성, 안전성을 평가하기 전에 실험동물에 약물을 투여하여 체내 분포, 대사, 배설이 어떻게 진행되는지 알아보는 in vivo 실험을 반드시 거쳐야 하며 이 실험 결과를 바탕으로 신약 후보물질을 결정하게 된다. 이 때 인간의 약물 수송에 관여하는 수송체는 기질 특이성, affinity 등의 측면에서 실험동물의 수송체와 다르다. 실험동물로 in vivo 실험을 하는 것은 궁극적으로 인간에서 나타날 결과를 미리 예측해보기 위함인데, 종간 차이에 대해 예측하지 못한다면 실험동물에서의 약물 체내동태 결과를 신뢰하기 힘들다. 따라서 실험동물과 인간에게 나타나는 약물동태 결과의 괴리를 극복하기 위하여 약물 수송체의 종차를 정확하게 이해하는 것이 매우 중요하다. 따라서 본 실험에서는 FDA 선정 7가지 수송체 중 하나인 BCRP에 해당하는 rat에서의 abcg2를 cloning 하기로 하였다. Rat abcg2가 많이 발현 된 rat liver total RNA로부터 Reverse transcription과 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 통해 abcg2 gene을 증폭시켰다. 그리고 PCR을 통해 얻은 abcg2 DNA를 T-vector와 ligation 시킨 뒤 pcDNA3.1/myc-His(-) vector 내로 subcloning 하였다. 완성된 clone을 MDCKⅡ cell에 stable 하게 transfection 시켰다. 이후 2~3주간 geneticin으로 selection 과정을 거친 후 RT-PCR 반응을 진행하여 rat BCRP DNA가 mRNA 단계에서 존재함을 확인할 수 있었다. 이 in-vitro system이 기능적으로도 잘 발현됨이 검증된다면 신약후보물질에 대한 약물 수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 개발 초기단계에서 예측할 수 있으며 궁극적으로 신약개발 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대 된다.

Identification of the transporter responsible for the efflux of 20-HETE-glucuronide in the human hepatocyte cell line HepG2 and Huh-7 cells

이다혜 인제대학교 일반대학원 2024 국내석사

Objectives: Although 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), a metabolite derived from arachidonic acid, has been known to be involved in the pathophysiological mechanisms of cardiovascular diseases and cancer development, the mechanism responsible for its cellular elimination remains poorly understood. Therefore, the present study was conducted to identify the transporter responsible for the efflux of 20-HETE-glucuronide. A further research goal was to study the cytotoxicity and changes in gene expression profiles induced by intracellular 20-HETE accumulation. Methods: The cellular expression of efflux transporters was confirmed by RT-PCR, qRT-PCR, and immunoblot assay. Changes in the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells were determined by enzyme-linked immunosorbent assay with and without chemical inhibitors and siRNAs specific for each transporter. Cytotoxicity induced by the accumulation of 20-HETE within the cells was confirmed by CCK-8 assay, and the impact of 20-HETE on changes in gene expression was investigated by RNA sequencing analysis. Results: Treatment with MK571 and Ko143, chemical inhibitors specific for multidrug resistance-associated protein (MRP) and breast cancer resistance protein (BCRP), decreased the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells by 69-99% (p < 0.001) and 58-63% (p < 0.01), respectively. With the exception of these two transporters, there were no significant differences in 20-HETE-glucuronide efflux in the other transporters with the inhibitors. Treatment with siRNAs specific for MRP2 and BCRP decreased the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells by 47% (p < 0.05) and 32% (p < 0.05), respectively, as the expression of each transporter protein decreased. The use of chemical inhibitors and siRNAs against the corresponding transporter proteins in Huh-7 cells yielded the same pattern of results as in HepG2 cells. Intracellular accumulation of 20-HETE resulted in a significant decrease in cell viability by up to 48% (p < 0.01), and concomitantly, there was an increase in transcriptomic expression associated with cardiovascular disease and cell division. Conclusions: MRP2 and BCRP were identified as the main transporters involved in the efflux of 20-HETE-glucuronide. Moreover, it was found that intracellular accumulation of 20-HETE caused cytotoxicity and up-regulated the expression of transcripts associated with cardiovascular disease and cell division. The present studies provide a molecular mechanism for the transporter of intracellular 20-HETE out of the cells and a method for controlling the amount of intracellular 20-HETE. The present results would lay the foundation for further studies on the mechanisms of 20-HETE-induced cardiovascular diseases, cancers, and other cellular toxicities. 목적: Arachidonic acid로부터 대사되는 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE)가 심혈관계 질환 및 암 발생에 관여한다는 사실이 널리 알려져 있음에도 불구하고 20-HETE의 세포 밖 수송 메커니즘에 대한 연구는 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 20-HETE-glucuronide가 세포 밖으로 수송될 때 관여하는 수송단백체를 규명하는 것을 목표로 하였다. 또한 세포 내 20-HETE가 축적됨에 따라 야기되는 세포 독성과 유전자 발현의 변화를 알아보고자 하였다. 방법: HepG2와 Huh-7 세포에서 수송체의 발현양을 RT-PCR과 qRT-PCR, immunoblot assay를 통해 확인하였다. 각 수송체 특이 저해제와 siRNA를 세포 배양 중 처리하여, 처리군과 비처리군 사이에 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glucuronide 양의 변화를 enzyme-linked immunosorbent assay를 통해 분석하여 어떤 수송체가 관여하는지 확인하였다. 세포 내 20-HETE 축적에 따른 세포 독성은 CCK-8 assay를 통해 확인하였으며, RNA-sequencing을 통하여 20-HETE에 의한 전사체 발현 변화를 분석하였다. 결과: Multidrug resistance-associated protein (MRP)와 breast cancer resistance protein (BCRP) 각각에 특이적인 화학적 저해제인 MK571와 Ko143을 처리하였을 때, 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glucuronide가 69-99% (p < 0.001)와 58-63% (p < 0.01)로 각각 감소하였다. 그 밖에 다른 수송체에서는 해당 저해체를 처리하였을 때 유의적인 차이가 없었다. MRP2와 BCRP 각각에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 수송단백체의 발현양이 감소함에 따라 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glulcuronide의 양이 각각 47% (p < 0.05), 32% (p < 0.05) 감소하였다. HepG2 세포에서 화학적 저해제와 siRNA를 사용하여 도출된 결과는 같은 방법으로 다른 간 세포주인 Huh-7 세포에 처리하였을 때에도 유사한 결과가 관찰되었다. 세포 내 20-HETE가 축적됨에 따라 세포의 생존율이 최대 48% (p < 0.01)로 감소하였을 뿐만 아니라, 심혈관계 질환 및 암에 관련된 전사체의 발현이 유의적으로 증가되었다. 결론: MRP2와 BCRP가 20-HETE-glucuronide를 세포 밖으로 수송하는데 관여하는 주요 수송단백체임을 확인하였다. 또한 세포 내 20-HETE 축적은 세포 독성을 야기하고 심혈관계 질환 및 세포분열과 관련된 전사체의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 본 연구결과는 20-HETE를 세포 밖으로 수송하는 기전을 제시하였으며, 세포 내 20-HETE 농도를 제어하는 방법을 제공하여 향후 20-HETE의 세포 독성 메커니즘에 대한 추가적인 연구를 이어 나갈 수 있는 토대를 마련하였다고 판단된다.