Monocyte chemoattractant protein-1에 의한 신혈관 생성의 유도 기전

강수진 울산대학교 2006 국내박사

배경:신혈관 생성은 죽상경화방의 형성 및 진행에 기여한다고 알려져 있으며,여러 키모카인 중에서도 특히 단핵구 주화성 단백 (monocyte chemoattractant protein-1. MCP-1)이 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 MCP-1에 의해 유도되는 신혈관 생성 과정에서 염증세포나 성장인자가 관여하는지 여부 및 수용체 결합 후 신호 전달 체계에 대한 세부적인 작용 기전을 규명하고자 하였다. 방법:In vitro 모형인 내피세포 증식 모형(endothelial cell proliferation model)과 ex vivo 모형인 대동맥 절편 모델 (rat aortic ring model) 및 in vivo 모형인 chick chorioallantoic membrane (CAM) 을 이용한 분석을 실행하였다. 결과: 세 가지 모형을 통하여 MCP-1이 신혈관 생성을 유도함을 확인하였고,특히 대동맥 절편 모델 실험에서 염증세포의 매개 없이 MCP-1에 의해 직접적으로 유발되는 내피세포의 증식을 관찰하였다. 동맥 절편에 MCP-1을 처리하였을 때 p42/44 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성화를 통해 혈관 내피 성장인자 A (vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)의 mRNA 발현이 증가되었고,CAM 모형에서 VEGF-A의 제해제인 Flt2-11를 첨가할 경웅 신혈관 생성은 억제되어 신혈관 유도 과정에서 VEGF-A가 필수적으로 관여함을 확이하였다. MCP-1에 의해 유도되는 혈관 생성은 Rho 단백 억제제인 Clostridiumm difficile toxin B 및 RhoA 단백을 특이적으로 저해하는 C3 transferase에 의해 억제되었으나, MCP-1에 의한 VEGF-A 생성단계는 Rho 단백억제제에 의한 영향을 받지 않았다. 결론: MCP-1은 혈관 내피세포와의 직접적 반응을 통해 신혈관 생성을 유도하는데 이는 독립적인 두 단계,즉 수용체 결합 후 P42/44 MAPK 에 의해 활성화되는 VEGF-A의 생성단계 및 VEGF-A를 매개로 하여 RhoA 신호 전달 체계를 통해 유발되는 신혈관 형성 단계를 거쳐 이루어 진다. 중심단어:monocyte chemoattractant protein-1,신혈관 생성

Deoxoartemisinin 유도체의 합성과 항신생혈관기전의 항암성에 관한 연구

박남수 연세대학교 대학원 2008 국내석사

Artemisinin 탄소 12번 위치의 nonacetal (탄소-탄소) 구조의 유도체 C-11-α-bromomethyldeoxoartemisinin 3과 deoxoartemisinin trimer 4를 합성하였고 그램 스케일 단위로 쉽게 준비할 수 있도록 새로운 합성 방법을 도입하였다. C-11-α-bromomethyldeoxoartemisinin 3은 artemisinic acid를 시작물질로 사용하고 핵심 반응 과정인 광산화반응에서 산 촉매로 Cu(OTf)2를 사용함으써 이전보다 더 높은 수율로 합성할 수 있었다. Deoxoartemisinin trimer 4는 pharmacophore peroxide 결합을 유지하면서 artemisinin 탄소 12번 위치에 핵심 반응 과정인 direct alkylation을 도입함으로써 부생성물인 anhydroartemi-sinin 18를 생성하지 않으면서 합성할 수 있었다. Deoxoartemisinin trimer 4는 전체 반응과정 중 4 steps이 줄어들어 10 steps으로 합성할 수 있었고 전체 수율이 이전 결과보다 3배 이상 증가됨을 확인할 수 있었다. 생물학적 실험 결과, deoxoartemisinin 유도체 3, 4 둘 다 chorioallantoic membrane의 신생혈관생성(neovascularization)을 억제하는 것을 확인하였다. C-11-α-bromomethyldeoxoartemisinin 3은 5nmol의 농도에서 75%의 신생혈관 생성억제 효과를 나타냈고, deoxoartemisinin trimer 4는 5nmol의 (-)-thalidomide와 같은 억제비율이 0.5nmol의 저농도에서 나타나는 것을 확인하였다 (57% 신생혈관 생성억제). Mouse matrigel plug 실험결과, VEGF와 deoxoartemisinin 유도체를 포함한 matrigel들이 거의 완전히 신생혈관생성을 억제하는 것을 확인하였다. Deoxoartemisinin 유도체 3, 4 둘 다 matrigel의 색깔이 옅어지고 헤모글로빈 수치가 거의 없는 것으로 보아 신생혈관생성(angiogenesis)을 강하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로, 다양한 구조를 가지는 nonacetal 형태의 deoxoartemisinin 유도체 31종을 합성하였다. 이 31종의 유도체들을 chorioallantoic membrane 실험을 한 결과, 28, 30, 31, 32, 36, 40, 45 deoxoartemisinin 유도체들이 5nmol의 농도에서 70% 이상의 신생혈관 생성억제가 나타남을 확인하였다 (5nmol에서 57%의 억제효과 : (-)-thalidomide).Deoxoartemisinin 유도체들은 artemisinin의 탄소 12번 위치의 nonacetal (탄소-탄소) 구조 때문에 화학적으로 불안정한 acetal (탄소-산소) 구조보다 더 긴 plasma half-life를 가질 수 있다. 그리고 acetal 결합을 가진 artemisinin 유도체들이 가지는 신경독성(neurotoxicity)을 피할 수 있는 이점을 가질 수 있다. 그러므로 deoxoartemisinin 유도체들이 더 높은 생물학적 이용가능성, 화학적 안정성 그리고 신경독성을 줄일 수 있다는 측면에서 주목 받고 있다. 특히, deoxoartemisi-nin 유도체인 C-11-α-bromomethyldeoxoartemisinin 3과 deoxoartemisinin trimer 4가 생물학적 실험 결과 신생혈관생성과 관련된 다양한 종양의 치료를 위한 화학 요법의 약물로서 약품 후보물질이 될 수 있는 가능성을 가지고 있음을 확인하였다. 그리고 deoxoartemisinin 유도체 28, 30, 31, 32, 36, 40 ,45 들이 생물학적 실험 결과 높은 신생혈관 생성억제를 나타냈고 신생혈관생성에 의한 종양의 억제 후보 물질로서의 가능성을 확인하기위해 더 많은 동물실험 평가를 할 만한 가치가 있음을 발견하였다.Receptor protein은 세포내의 분자 생물학 개념에서 작은 분자량을 가지는 천연물을 이용 하여 생물 유기 화학적 연구를 연결해주는 중요한 분자이다. 생리활성 물질인 artemisinin의 receptor protein의 발견은 artemisinin과 protein의 관계를 규명함으로써 artemisinin 분자의 새로운 생유기적 특징을 찾을 수 있을 것이라고 기대할 수 있다. 그래서 target protein을 확인하기위해 artemisinin에 biotin을 도입한 biotinylated deoxoartemisinin 유도체를 합성하였다. Novel C-12 nonacetal type (C-C) derivatives of artemisinin 3, 4 well synthesized easily on gram scale by new synthetic procedure. C-11-α-bromomethyldeoxoartemisinin 3 was synthesized in moderate yield from more abundant artemisinic acid 2 by applying photooxygenative cyclization as a key reaction step using acid catalyst Cu(OTf)2. Deoxoartemisinin trimer 4 was prepared by direct alkylation at C-12 position of artemisinin as a key synthetic step without destroying the pharmacophore peroxide bond and producing by product AHA 18. Total reaction steps of deoxoarte-misinin trimer 4 were reduced by four steps (10 steps in total) and overall yield was improved three times more than that of the previous report. In the biological assay, chicken chorioallantoic membrane (CAM) neovasculari-zation was inhibited by both deoxoartemisinin derivatives. C-11-α-bromo-methyldeoxo-artemisinin 3 showed significant inhibition of angiogenesis at 5nmol/egg (75% of inhibition effect) and deoxoartemisinin trimer 4 also exhibited same inhibition percentage (57% of inhibition effect) of (-)-thalidomide (5nmol/egg) as reference drug in low concentration of 0.5nmol/egg. In mouse matrigel plug assay, matrigel containing VEGF and deoxoartemisinin derivatives showed almost complete inhibition of angio-genesis. Both deoxoartemisinin derivatives strongly blocked the growth of new blood vessels into the matrigel implant demonstrating by both visual images of matrigel and almost no hemoglobin content of matrigel. On the basis of present results, we have begun to design and synthesize 31 diverse derivatives of artemisinin, especially deoxoartemisinin derivatives. Among these derivatives, deoxoarte-misinin compounds 28, 30, 31, 32, 36, 40, 45 showed strong and potent anti-angiogenic acitivity over 70% of inhibition effect compared to 57% of inhibition effect of reference drug (-)-thalidomide.Deoxoartemisinin derivatives may have a longer plasma half-life based on C-C nonacetal linkage at C-12 position of artemisinin than hydrolytically more vulnerable C-O acetal linkage of artemisinin derivatives. And they may also have advantage of avoiding neurotoxicity that has been presented in artemi-sinin derivatives carrying C-O acetal linkage. Therefore, deoxoartemisinin derivatives should receive attention as potent valuable agents for their better bioavailability, stability and reduced neuro-toxicity compared to acetal type derivatives. Notably, novel deoxoartemisinin derivatives 3, 4 have a potential to develop drug candidates as chemotherapeutic agents for treatment of various angiogenesis-dependent tumors. And also 28, 30, 31, 32, 36, 40, 45 deoxoartemisinin derivatives have deserved further in vivo assay evaluation as potential drug candidates for chemotherapy of tumors which depend on angiogenesis.Receptor proteins are key molecules which connect the bioorganic study using low-molecular weight natural products with molecular biology within the cell. Detection of receptor protein for artemisinin which is a biological active compound looks forward to having new bioorganic features of artemisinin molecule by examination of relationship between artemisinin and protein. Thus, biotin is introduced to artemisinin for indentifying the target protein.

새로운 혈관생성억제제인 KJ3가 동소이식 유방암 백서에서 신생혈관생성에 미치는 영향과 기전

변창규 연세대학교 대학원 2004 국내박사

Because angiogenesis or the formation of new blood vessels plays an important role in pathologic processes such as the growth and metastasis of tumors, blocking of this process may be a new strategy of cancer treatment. In this study, we evaluated the anti-angiogenic activity of KJ3, a new agent extracted from Embellisia chlamydospora KF208, by using in vitro and in vivo tests. The mechanism of this agent was also investigated by measuring the expression of matrix-metalloproteinase(MMP)-2, MMP-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in experimental breast cancer animals. Trypan blue exclusion method was used for endothelial cell viability assay. Endothelial cell invasion assay and capillary tube formation assay were performed to evaluate the in vitro activity of anti-antiogenic effects. Chorioallantoic membrane(CAM) assay using chick embryo was examined for in vivo activity. C3HHeJ mice with FM3A breast cancer cell lines were used to examine the anti-angiogenic activity of KJ3 in mice. 7 week old female C3HHeJ mice were devided into 4 groups (n=24), and FM3A tumor tissues were inoculated in the subcutaneous area. Normal saline, KJ3, fumagillin and betulinic acid were injected intraperitoneally with a third of LD50, determined by FACS analysis. The size and weight of tumors and mice were measured on day 0, 2, 4 and 6. After sacrificing the mice, tumor masses were obtained, and MMP-2 and MMP-9 expression were measured by zymography and VEGF expression by ELISA. In endothelial cell viability assay, more than 95% of cells were viable under 20 ㎍㎖ of KJ3. In endothelial cell invasion assay, cell invasion induced by 30 ng㎖ bFGF was suppressed gradually by KJ3 in dose dependent manner. In vitro capillary tube formation assay showed that 10 ㎍㎖ of KJ3 suppressed the tube formation of endothelial cells which was induced by bFGF 30 ng㎖. In CAM assay, control group showed 10 % inhibition rate whereas KJ3 inoculated groups with 10, 100, 200 ugegg showed 47, 64, 86 %, respectively. KJ3 treated group in CeHHeJ mice with FM3A tumors, as well as the positive control groups treated with fumagillin and betulinic acid, showed statistically significant tumor growth inhibition effect on day 2, 4, and 6 (p<0.05). MMP-9 expression was increased significantly in KJ3, fumagillin, and betulinic acid treated groups compared with negative control group (p<0.05), but MMP-2 expression was not. KJ3 and betulinic acid treated groups showed significantly decreased expression of VEGF (p<0.05). In conclusion, KJ3 showed inhibitory effets to endothelial cell invasion, capillary tube formation, vascular formation in CAM, tumor growth and expression of VEGF, and so possibility of using as an angiogenesis inhibitor in tumor treatment. It also showed incresed tumor expression of MMP-9 and may be related with tumor invasion and metastasis. 새로운 혈관이 생기는 신생혈관생성은 종양의 성장과 전이에 중요한 기전으로, 이의 차단은 종양치료에 하나의 새로운 전략이 될 수 있다. 본 연구에서는 Embellisia chlamydospora KF208에서 추출한 KJ3의 신생혈관생성 억제작용을 생체외 및 생체내 검사를 통하여 검증하였고, 작용 기전을 알아보기 위하여 실험동물의 유방암에서 matrix-metalloproteinase(MMP)-2와 MMP-9, vascular endothelial growth factor(VEGF)의 발현을 측정하였다. 세포독성을 보이지 않는 KJ3의 최적농도를 구하기 위한 혈관내피세포 생존 분석은 trypan blue exclusion 방법을 이용하였다. 생체외 혈관 내피세포의 신생혈관생성 억제작용을 검사하기 위하여 혈관내피세포 침습 및 생체외 모세관 형성 검사를 시행하였다. 생체내에서의 영향은 chick embryo의 융모요막을 이용하여 검사하였다. 백서에서 KJ3의 신생혈관생성 억제작용을 검사하기 위하여 C3HHeJ 백서에서 FM3A 유방암을 이용하였다. 7주령의 암컷 C3HHeJ 백서를 네 군(n=24)으로 나누어 FM3A 종양조직을 피하조직에 주입한 후, 생리식염수와 KJ3, fumagillin과 betulinic acid를 미리 FACS를 이용하여 구한 FM3A의 LD50의 13 씩을 복강내로 0, 2, 4, 6 일째에 주입하고, 종괴의 크기와 백서의 무게를 측정하였다. 실험 7일째 백서를 희생하여 종괴를 얻은 후, zymography를 이용하여 MMP-2와 MMP-9의 활성을, ELISA를 이용하여 VEGF의 발현을 알아보았다. 혈관내피세포 생존 분석에서 KJ3 농도가 20 ㎍㎖ 이하에서는 생존세포의 수가 95% 이상이었다. 생체외 혈관내피세포 침습 검사 결과 bFGF 30 ng㎖에 의하여 유도되는 세포침습은 KJ3의 용량에 비례하여 억제되었다. 생체외 모세관 형성 검사에서도 bFGF 30 ng㎖ 투여에 의하여 유도되는 모세관 형성이 KJ3 10 ㎍㎖ 투여에 의하여 억제되었다. 융모요막 검사에서 대조군은 10%의 억제율을 보인 반면 계란 1개당 KJ3 10, 100, 200 ㎍이 투여된 군들에서는 각각 47, 64, 86%의 억제율을 보였다. C3HHeJ 백서에 주입한 FM3A 종괴에서는 양성대조군으로 사용한 fumagillin과 betulinic acid 투여군에서와 같이 KJ3 투여군에서도 종괴 증식억제를 보였는데, 음성대조군과 비교시 종괴주입 후 2, 4, 6일 모두 통계적으로 의의있는 감소를 보였다 (p<0.05). MMP-2는 각 군 모두 발현이 없었으나, MMP-9는 대조군보다 KJ3, fumagillin, betulinic acid 투여군에서 의의있게 증가하였다 (p<0.05). ELISA를 이용한 mouse VEGF 측정결과 KJ3와 betulinic acid 투여군은 대조군에 비하여 의의있게 감소한 VEGF의 발현을 보였으나(p<0.05), fumagillin 은 대조군과 비슷한 발현을 보였다. 결론으로, KJ3는 혈관내피세포의 침습과 모세관 형성을 억제하고, 융모요막의 혈관생성을 억제하며, 동소이식 유방암백서에서 종양의 성장 및 VEGF의 발현을 억제시켜 혈관생성억제제로서 종양치료에 사용 될 수 있는 가능성을 제시하였고, 종양의 MMP-9의 발현을 증가시켜 종양의 침습과 전이과정에도 관여할 수 있을 것으로 사료된다.

유두상 갑상선 미세암에서 혈관내피성장인자(VEGF), 혈관내피성장인자수용체-1(VEGFR-1), 저산소증 유발인자(HIF-1α)의 mRNA 발현

윤태일 아주대학교 대학원 2005 국내석사

목적: 신생혈관생성(angiogenesis)은 암종양의 성장 및 전이에 반드시 필요하며 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 신생혈관생성 (angiogenesis)을 일으키는 중요한 인자로 알려져 있다. 최근 진단기술의 발달로 촉지되지 않는 10mm미만의 유두상 갑상선 미세암(papillary thyroid microcarcinoma, 유두상 미세암)의 진단이 급격히 증가하고 있다. 본 연구는 유두상 미세암 조직에서 VEGF와 VEGF의 수용체인 혈관내피성장인자수용체 (vascular endo-thelial growth factor receptor-1,VEGFR-1), VEGF의 발현을 유도하는 저산소증 유발인자(Hypoxic induced factor 1α, HIF-1α), 각각의mRNA발현정도를 분석하여 신생혈관생성의 발현형의 변화여부를 확인하고 여러 임상 및 병리적 특징과 VEGF mRNA의 발현정도와의 상관관계를 분석 하기 위하여 시행되었다. 대상 및 방법: 유두상 갑성선암 진단 하에 갑상선절제술을 시행한 환자 중 종양의 크기가 10mm이하인14명의 환자를 대상으로 수술 중에 암종양조직과 동측의 정상갑상선조직을 채취하여 mRNA의 손상을 막기 위해 조직을 RNA later용액을 첨가하여 신선한 상태로 영하70℃로 냉동 보관하였다. 정상조직과 암종양조직에서 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 mRNA발현정도 를 정상조직과 암종양조직에서 비교하였다. 발현정도는 농도측정기(densitometer) 를 이용하여 정량화 하였고 대상환자의 임상 및 병리적 특징과의 상관여부를 조사하 였다. 결과: HIF-1α는 암종양조직이 정상조직에서보다 발현강도가 높았고(p=0.024) VEGF는 오히려 암종양조직에서 정상조직에서보다 발현강도가 낮았다 (p=0.002). VEGFR-1은 두 조직간의 차이가 없었다. 갑상선피막 침범 유무에 따라 비교했을 때 암종양조직에서 VEGF mRNA 발현의 차이는 없었고 림파선 전이 유무에 따라 비교했을 때는 통계적인 유의성은 없지만 전이가 있는 군에서 다소 높게 VEGF mRNA가 발현되었다. 40세를 기준으로 나이에 따라 암종양조직에서의 VEGF mRNA의 발현강도를 비교했을 때는 40세 이전인 군에서 발현강도가 낮은 경우가 많았다. 결론: 유두상 갑상선 미세암 환자에서 신생혈관생성을 촉진하는 VEGF의 강력한 전사조절인자(transcription regulator)인 HIF-1α mRNA가 암종양조직에서 주위 정상조직에서보다 높게 발현되었음에도 VEGF mRNA는 암종양조직에서 낮게 발현되었다. 여러 임상특징과의 상관관계에서 갑상선암에서 예후에 강력한 영향을 미치는 나이가 40세 이전인 경우에 암종양조직에서의 VEGF mRNA 발현강도가 낮은 경우가 많았다. 이 결과로 미루어볼 때 대부분의 유두상 미세암이 임상암으로 진행하지 않고 좋은 예후를 나타내는 것은 유두상 미세암인 경우에 암종양조직에서 신생혈관 형성의 발현형(angiogenic phenotype)의 변화가 일어나지 않는 것과 관련이 있는 것으로 생각된다. __________________________________________________________________________ 핵심 되는 말: 유두상 갑상선 미세암, 혈관내피성장인자, 신생혈관생성, 저산소증 유발인자

허혈성 백서모델에서 물리적장벽파괴와 에리트로포이에틴 투여방법에 따른 신생혈관생성과 신경보호

권용진 아주대학교 일반대학원 2018 국내석사

연구배경 및 목적: 모야모야병은 아시아인에서 흔한 뇌 혈관 질환으로, 뇌 혈관의 내경 동맥 및 윌리스환 주변부의 진행성 협착으로 인한 (1) 두개강 내 저관류상태와 (2) 두개강 내 측부혈관인 윌리스환 주변부의 혈관변화를 특징으로 한다. 따라서 혈류가 부족한 두개 내, 외 지역의 혈관을 직접 연결하거나 간접적으로 혈관재건을 촉진시키는 수술이 유일하다. 지금까지 개발된 본 질환의 실험 모델은 특징적인 임상 양상을 충분히 표현하지 못했기 때문에 발병 메커니즘을 파악하거나 치료 방법을 개발하는 데 제한점이 많았다. 두개강 내 저관류 상태에 있는 모야모야병 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 신경보호와 관련된 인자들이 증가되어 있어 새로운 뇌졸중이 발생했을 때 허혈이 줄어드는 ‘허혈 내성(ischemic tolerance) 혹은 허혈성 전조건화(ischemic preconditioning)’가 나타난다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서 본 연구의 첫째 목적은 제작한 동물 모델이 허혈성 전조건화가 있어 급성 허혈성 뇌졸중에 대해 신경보호가 있으면서 위에서 언급한 두가지 특징을 가지는 실험동물을 제작하는 것이다. 둘째, 혈관재건을 촉진하는 최소 침습수술인 물리적장벽파괴술과 병행하여 신생혈관생성 촉진효과가 있는 에리트로포이에틴의 투여 방법에 따른 신생혈관생성 및 신경보호 정도를 평가한다. 연구방법: 단계 1_허혈성 전 조건화된 모야모야 동물모델을 확립하기 위해 양측내경동맥 폐색을 1-3주간 시행하고 이후 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색하여 뇌경색 부위가 가장 적고 사망률이 낮아 적절한 허혈내성이 일어나는 조건을 확립하기 위해 뇌혈류량, 행동실험, 뇌경색의 크기의 상관관계를 비교하였고 윌리스환 주변부의 혈관변화를 확인했다. 단계 2_제작된 동물모델에 우측 중대뇌동맥에 90분간 일시적으로 폐색한 후 2시간에 에리트로포이에틴을 복강내 및 두피내에 국소적으로 단회투여(5000U/kg)하여 투여 방법에 따른 기능적 회복과 신경보호, 신생혈관생성 정도를 비교 하였다. 연구결과: 단계 1_영구적 중대뇌동맥폐색 모델(370mm3)과 비교할 때, 양측 내경동맥 폐색으로 허혈성 전 조건화를 1-3주간 시행한 개체에서 중대뇌동맥폐색을 시행하였을 때 2주간 시행한 개체에서 뇌경색의 크기(167mm3) 가 줄어들었고, 생존률(100%)도 가장 높아 적합한 개체로 간주되었다. 2주간 내경동맥 폐색 동물에 중대뇌동맥을 폐색하여 내경동맥 폐색 전상태와 비교하여 혈류량이 60% 미만이고 신경학적 행동점수가 10점 이상을 보이는 개체에서만 뇌경색이 나타나는 특성이 있었기 때문에 허혈성 전 조건화가 발생한 것으로 간주되어 적합한 동물모델로 최종 선택되었다. 가짜 수술 모델과 비교하여, 선택된 최종모델에서 윌리스환 주변의 주요혈관(내경 동맥, 후교통동맥, 중대뇌동맥, 뇌기저동맥)의 감소(p=0.05)가 있었다. 단계 2_우측 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색한 모델의 경색주변부위(peri-infarct area) 혈관 밀도(79%)를 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 그룹이 혈관밀도(vessel density)가 증가(91%, p=0.005)하였지만 복강내 투여군과 두피내 국소적 투여 군간에는 차이가 없었다. 앞선 실험과 같이 동물모델의 뇌경색 크기(246mm3)를 비교하여, 확립된 동물모델에서 에리트로포이에틴의 복강 내 투여 그룹이 뇌경색 크기(142mm3)가 감소하여 신경보호효과가 있었지만 두피내 국소적 투여 군에서는 뇌경색 크기(198mm3)가 비슷하여 신경보호효과를 입증하지 못했다. 결론: 저관류 상태를 유지하고 윌리스환 주변부 혈관의 변화가 있는 허혈성 전 조건화 모야모야 동물모델을 확립하였다. 이 모델을 통해 물리적장벽파괴술과 에리트로포이에틴의 단회투여와 투여방법에 따른 신생혈관생성에는 차이가 없었지만, 신경보호에는 복강내 투여만이 효과가 있었으므로 에리트로포이에틴의 다수투여가 투여방법에 따른 효과가 있으리라 기대한다.

쥐의 국소 뇌허혈 모델에서 Erythropoietin의 혈관생성효과에 관한 고찰 : Angiogenic Effect of Erythropoietin in Focal Cerebral Ischemic Model of Rat

이경복 高麗大學校 大學院 2004 국내박사

배경 및 목적: 조혈기능으로 널리 알려진 Erythropoietin (EPO)이 최근의 연구들에서 뇌경색 후 세포사를 억제하고, 신경세포의 신생에 관여한다는 사실이 밝혀졌다. 한편, EPO의 혈관생성 효과는 다른 세포들의 in vitro 실험에서는 보고가 있으나 in vivo에서, 특히 뇌에서의 효과에 대해서는 거의 연구되어 있지 않다. 이에 본 연구에서는 뇌허혈 쥐 모델에서 EPO 투여 후 혈관 신생에 대해서 알아 보고자 하였다. 방법: 중뇌동맥을 90분간 폐색시키는 방법으로 국소 뇌허혈 모델을 제작하였고, 각 군 당 쥐를 3마리씩으로 하여, EPO군은 4일째부터 3일 동안 r-human EPO (5000 IU/kg)를 복강 내 투여하였으며, 대조군에는 생리 식염수를 주사하였다. 뇌경색 발생 후 10일째 면역조직화학을 시행하여 laminin 염색에서 혈관의 면적을 계산하였고, vWF 항체로 신생혈관의 수를 세었다. 또한, 모든 쥐들에 7일째부터 BrdU를 매일 복강 내 투여하여 10일째 BrdU와 vWF 이중염색을 시행하였으며, Nissl 염색으로 두 군의 뇌경색 부피도 측정하였다. 결과: 뇌경색 10일 후에 관찰한 결과 EPO를 투여한 군에서 대조군에 비해 뇌경색의 주변부위에서 혈관밀도가 높게 측정되었으며(2.500.43㎟ vs. 1.04±0.09㎟, p<0.001), vWF 양성 혈관의 수도 증가하였다(11.11±1.83 vs. 7.11±1.76, p<0.001). 또한, EPO를 투여한 군에서 얇은 내벽을 가진, 길어진 혈관들을 많이 볼 수 있었으며, vWF와 BrdU의 이중 염색에서 양성을 보이는 혈관세포들이 대조군에 비해 증가되었다(22.0±3.61 vs. 9.67±3.06, p=0.01). 한편, 뇌경색의 크기에 있어서는 EPO를 투여한 군과 대조군에서 차이가 없었다. 결론: 본 실험에서 EPO를 투여한 군의 뇌경색 주변부위에서 혈관의 면적과 수가 증가된 소견을 보였고, 증식하는 내피세포가 유의하게 많이 관찰되었는데, 이는 EPO가 신생혈관의 생성을 촉진시키는 효과가 있음을 시사하는 결과라 할 수 있겠다. Background and Purpose: Among the extra-haematopoietic functions of erythropoietin (EPO), angiogenesis, the process through which new blood vessels arise from preexisting ones, has been indicated. We assessed the angiogenic effect of EPO in focal cerebral ischemic rat model. Methods: Focal middle cerebral artery (MCA) infarctions were induced by intraluminal thread occlusion method for 90 minutes. Rats were divided into two groups; a control group (n=3) that received saline only, and a EPO injection group (n=3) that received intraperitoneal EPO (5000 IU/Kg) injection at four to six days after MCA infarction. All groups were injected with BrdU for 3 consecutive days at 7 days after MCA infarction. Immunohistochemical stainings with anti-laminin and anti-von Willebrand factor (vWF) antibodies were performed to evaluate the amount of new vessel formation in ischemic boundary area. Quantitative measurement of angiogenesis and extent of ischemic injury was done after 10 days of MCA infarction using image analyzer. Results: Vascular density (vascular area per microfield) in ischemic boundary was higher in the EPO injection group than the control group (2.50±0.43㎟ vs. 1.04±0.09㎟, p<0.001). Total number of vessels was increased in the EPO treated group) than the control group (11.11±1.83 vs. 7.11±1.76, p<0.001) in vWF immunohistochemical staining. In the EPO group, many enlarged and thin-walled vessels were observed, and more vWF and BrdU double positive cells were seen in ischemic boundary. The infarction volume, however, was not different in both groups. Conclusions: This study suggests that EPO treatment enhance new vessel formation occurring in ischemic penumbra after MCA infarction.

종양혈관생성에서 내피전구세포의 역할

안중배 연세대학교 대학원 2003 국내박사

기존의 항암약물들은 주로 증식이 빠른 세포를 표적으로 개발되어 왔다. 하지만 정상적으로 빠른 성장을 보이는 조직에 많은 독성을 나타내게 되며 그 효과에도 한계를 보이게 되었다. 종양의 혈관형성에는 angiogenesis뿐만 아니라 내피전구세포에 의한 vasculogenesis도 중요한 역할을 담당함이 제시되었다. 따라서 암 조직 내에서 활발하게 증식하고 있는 종양 내피세포에만 특이하게 억제시킬 경우 암 치료효과는 향상될 것이다. 내피전구세포는 골수에서 유래하며, CD34 양성 단핵구에 존재함이 알려졌다. 내피전구세포의 혈관생성부위로 이동하는 특성을 종양 특이 매개체로 이용하고자 본 연구를 계획하게 되었다. 본 연구에서는 항암약물치료를 시행하는 환자에게 과립구 성장 촉진인자(G-CSF)를 처치하여 백혈구수 증가시켜 말초 혈액에서 CD34 양성 단핵구를 분리 후, basic fibroblast growth factor (bFGF)와 vascular endothelial growth factor (VEGF) 성장인자를 이용한 생체외 배양을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. CD34 양성 단핵구는 생체외 배양 28일경에 cobblestone 형태를 나타내 내피세포의 형태로 분화됨이 확인되었다. 이들 세포는 LDL 섭취반응이 양성으로 나타나 내피세포의 기능을 가지고 있음이 확인되었다. 2. CD34 양성 단핵구에서 분화된 세포는 matrigel 배양에서 18∼24시간 경과 후 맥관 형성이 확인되어 이들세포가 신혈관생성에 관여할 수 있음이 확인되었다. 3. CD34 양성 단핵구를 5주 이상 장기간 배양시 분화된 내피세포의 특이적 표지자인 CD31과 P1H12가 발현됨을 확인하였다. 4. Realtime PCR을 이용하여 내피세포 연관 유전자 발현 정도를 측정한 결과, IGFBP4, vWF, CTGF, COL6A1, COL18A1, MCAM (Muc 18), VEGFR3/Flt4, CD34, CD105/endoglin, eNOS 발현이 확인되었다. 5. CD34 음성이면서 표면 부착성 증식형태를 유지하는 단핵구에서도 같은 성장인자를 이용하여 배양시 일부에서 내피세포의 형태를 관찰할 수 있었다. CD34 음성 단핵구에서 내피세포 형태로 분화된 세포들도 LDL 섭취반응이 양성으로 나타나 내피세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다. 6. CD34 양성 단핵구에서 내피세포형태로 분화된 세포들은 telomerase 활성이 관찰되어 이들 세포가 순환 성체 세포가 아닌 전구세포 이전 단계임을 제시하였다. 7. 마우스에 인체종양을 형성한 동물실험에서 인체의 CD34 양성 말초단핵구에서 유도된 내피전구세포가 혈관을 통한 주입시에 종양조직으로 이동하여 2주 이상 생존하고 있음이 확인되어 종양의 혈관생성과정에 관여함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 말초 혈액에는 내피전구세포가 존재함을 확인할 수 있으며 이들 세포는 CD34 양성 단핵구에서만 아니라 CD34 음성 단핵구에서도 내피세포로 분화됨이 밝혀졌다. 암환자에서 이들 세포를 분리한 후 생체외 증폭, 배양할 경우 이들 세포를 약제 및 치료유전자의 자가 매개체로 응용할 수 있을 것으로 사료된다. Most chemotherapeutic agents in current use have been developed to target cells with a high proliferation rate. However, the role of these agents is limited in that they are also toxic to normal tissue with a high proliferation rate. The therapeutic effect would be improved if they could act specifically on endothelial cells of tumor vessels which are actively proliferating within tumor tissue. It has been suggested that vasculogenesis by endothelial cell precursors as well as angiogenesis play an important role in the production of blood vessels in neoplasms. Endothelial cell precursors arise from the bone marrow and are present in CD34 positive monocytes. The present study was designed in order to utilize the process of migration of endothelial cell precursors to the area of active vessel production as a tumor specific mediator. In patients undergoing chemotherapy, G-CSF was administered and thus mobilization of mononuclear cell was induced. CD34 positive peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated from peripheral blood and ex vivo culture using bFGF and VEGF was carried out. The following results were obtained. 1. The cells derived from CD34 positive PBMC presented with a cobblestone appearance at 28 days, revealing differentiation into endothelial cells. They were also positive to the LDL uptake reaction, showing that they have biological endothelial cell functions. 2. Twenty four hours after culture in matrigel, cells differentiated from CD34 positive PBMC demonstrated tube formation, showing their ability to participate in neovascularization. 3. More than 5 weeks after culture, cells derived from CD34 positive PBMC expressed CD31 and P1H12, endothelial cell specific markers. 4. The expression of endothelial cell-related genes was evaluated using realtime PCR. IGFBP4, vWF, CTGF, COL6A1, COL18A1, MCAM (Muc18), VEGFR2/Flt4, CD34, CD105/endoglin, eNOS were expressed. 5. The morphology of endothelial cells was also observed in adherent CD34 negative cells when cultured with the same growth factors. As these cells were positive to the LDL uptake reaction, it was shown that they are differentiating into endothelial cells. 6. The cells derived from CD34 positive PBMC demonstrated telomerase activity, showing that they are more immature than differentiated cells. 7. In the experiment with tumor formation in mice, it was shown that endothelial cell precursors derived from CD34 positive PBMC mobilized mainly into tumor area after being injected through tail vein. By isolation and ex vivo amplification of endothelial cell progenitors from cancer patients, we suggest that endothelial cell progenitors maybe used as autologous mediators of chemotherapeutic agents and target genes in targeted cancer therapy.

영아혈관종의 면역조직화학적 염색을 통한 예후 평가

장진호 연세대학교 대학원 2002 국내석사

영아혈관종은 피부혈관이상 (cutaneous vascular anomalies)의 한 형태로 신생아의 약 1.1%-2.6%에서 발생하며, 혈관기형 (vascular malformation)과는 달리 환아의 성장과 더불어 성장기, 정지기 및 퇴행기를 거쳐 결국에는 자연 소실된다. 따라서 대부분의 임상의들은 위의 내용을 근거로 적극적 치료보다는 임상관찰만을 권유하고 있지만, 현재 병변의 단계가 성장기인지 정지기인지 퇴행기인지를 객관적으로 알 수 있는 지표가 없어서, 혈관종의 병변확대 범위를 예측하기 어려울 뿐더러, 경우에 따라 약 20%에서는 궤양과 출혈 등의 문제가 발생 할 수 있고 약 40%의 환아에서 모세혈관확장, 위축, 저색소침착 또는 반흔 등의 미용상 후유증을 남길 수 있다. 또한, 병변이 성장하지 않더라도 부모는 의사의 권유에도 불구하고 노출부위의 혈관종을 치료하기 원하는 경우가 많다. 본 연구에서는 여러 임상단계에 있는 영아혈관종 조직들을 대상으로 새로운 혈관형성에 중요한 역할을 하는 혈관생성인자들인 basic fibroblast growth factor (bFGF;FGF-2), vascular endothelial cell growth factor (VEGF)와 aFGF의 수용체인 Flg (receptor for aFGF), 혈관생성억제인자 endostatin과 세포고사 인자 caspase-3에 관한 면역조직화학적 염색을 시행함으로써 여러 단계에 있는 혈관종 인자들의 발현특성을 알아보고 이를 근거로 하여 혈관종의 단계 및 예후를 객관적으로 판단하고자 하였다. 면역조직화학적 염색상 영아혈관종의 성장기에는 bFGF, Flg, VEGF가 발현되었고, 성장기 단계에서 triamcinolone 병변내 주사요법으로 치료 후에도 bFGF, Flg, VEGF가 염색되었으나 endostatin은 염색되지 않았다. 정지기에는 bFGF, Flg만 발현되었고, 퇴행기에는 어떤 항체도 염색되지 않았다. Caspase-3에 대한 항체는 비활성화된 효소에도 결합하는 비특이성을 보여 확실한 결론을 내릴 수 없었다. 위의 결과로 VEGF의 발현은 다른 두 단계와 달리 성장에 대한 표시자로써 이용될 수 있고, 이것이 발현된다는 것은 혈관종의 성장이 계속 될 수 있을 가능성이 있고, 이에 대한 치료가 필요하다는 것을 의미할 수 있다. Infantile hemangioma constitutes a type of cut aneous vascular anomaly with the incidence of 1.1%-2.6% in neonates, which, in contrast to vascular malformation, regresses as the child grows through the growth, involuting and involuted phases. Most of the clinicians recommend simple observation with the expectation of spontaneous regression on the empirical basis. However, due to the absence of any established markers of each clinical phase, it is often quite impossible to predict the expansile growth of the hemangioma, and in some cases serious cosmetic problem may arise; in 20%, ulceration and bleeding may occur and 40% of the cases may end up with telangiectasia, atrophy, hypopigmentation or cicatrical changes. Also, even if the tumor remains still, parents request some degree of treatment despite the medical advice. In this study, we stained tissue sections of hemangiomas in all clinical phases with antibodies to the important angiogenetic factors; basic fibroblast growth factor (bFGF;FGF-2), vascular endothelial cell growth fact or (VEGF) and Flg (receptor for aFGF). Expression of angiostatic fact or, endostatin and apoptotic factor, caspa se-3, were also investigated. By the means of immunohist ochemical staining, we found that in the growth phase of infantile hemangioma, bFGF, Flg, and VEGF were expressed, and after treatment with intralesional triamcinolone, bFGF, Flg, and VEGF were also expressed but not endostatin. In the involuting phase, bFGF, Flg were expressed, and in the involuted phase, none of the above factors were expressed. As caspase-3 antibody also stained inactive caspase-3 enzyme, we could not obtain any conclusions from the nonspecificstains. From the above results, expression of VEGF can be used as a marker to differentiate growth phase from the other phases and its presence may indicate the potential for further growth and necessity for treatment.

자궁내막암의 예후인자로서 CD105 (endoglin)와 CD31 발현을 이용한 혈관생성의 평가

심승혁 울산대학교 대학원 2008 국내석사

목적: 자궁내막암 환자에서 혈관생성 (angiogenesis)를 평가함에 있어 CD105 (endoglin)와 범내피성 (panendothelial) 표지자인 CD31을 비교하고, 예후인자로서의 가치와 생존율과의 관계를 알아보고자 하였다. 연구방법: 69예의 자궁내막암 환자를 대상으로 나이, 병기, 조직학적 유형, 조직분화도, 자궁근층의 침범정도 (myometrial invasion, MI), 림프혈관강 침범 (lymphovascular space invasion, LVSI), 림프관 전이, 총괄생존율 (overall survival)을 후향적으로 조사하였다. 모든 경우에서 CD105 (endoglin), CD31, 혈관내피세포성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF), MIB-1 (Ki67)에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. CD105와 CD31을 이용하여 미세혈관 밀도 (microvessel density, MVD)를 측정하였고 환자의 임상 병리적 특성 및 생존율과의 연관성을 조사하였다. 또한 VEGF의 발현정도와 Ki67을 이용한 종양세포의 증식지수 (proliferation index)를 조사하여 CD105 및 CD31 MVD와의 연관성을 알아보았다. 결과: 평균CD105 MVD은 15.8±6.2이었고, 평균CD31 MVD는 27.8±10.9이었으며(P<0.05) 두 표지자간에 유의한 상관관계가 있었다 (r=0.290, P=0.019). 그러나 CD105, CD31 MVD 둘 다 나이, 병기, 조직학적 유형, 조직분화도, 자궁근층의 침범정도, 림프혈관강 침범, 림프관 전이 등의 임상병리적인 특성과는 유의한 연관성을 보이지 않았다. CD105 MVD와 VEGF는 양의 상관관계를 보였지만 (Spearman`s ρ=0.612, P<0.01), CD31의 경우는 그렇지 않았다 (Spearman`s ρ=0.097, P=0.442). VEGF가 증가함에 따라 CD105 MVD의 평균도 유의하게 증가하였으나 (P<0.01) CD31은 그렇지 않았다(P=0.328). Ki67 세포증식지수도 CD105 MVD간에 양의 상관 관계를 보였지만(Pearson`s r=0.410, P=0.01) CD31 MVD의 경우는 그렇지 않았다 (r=0.100, P=0.428). CD105 MVD가 낮은 경우에 평균 생존기간이 2127±176일로서 CD105 MVD가 높은 경우의 평균 생존기간 1195±350일보다 유의하게 더 길었던 반면 (P=0.009, log-rank test), CD31 MVD는 생존기간에 영향을 주지 않았다 (P=0.718). 결론: 자궁내막암에서 CD105는 종양 내 혈관생성을 인지하는데 있어 특이성이 높은 표지자로, CD31보다 생존율에 대한 예측인자로서 가치가 크다고 생각되며, 앞으로 자궁내막암의 항혈관생성 (antiangiogenic) 치료의 표적에 endoglin이 사용될 수 있을 것으로 생각된다. Objective: The purpose of this study was to compare CD105 (endoglin) and the panendothelial marker CD31 in the assessment of angiogenesis in endometrial cancer and to detect the prognostic value of CD105 Methods: Sixty nine patients with endometrial cancer were included in this study, and the clinicopathologic parameters including age, FIGO stage, histologic type, histologic grade, depth of myometrial invasion, lymphovascular space invasion, lymph node metastasis, and overall survival were compared with microvessel density (MVD) detected by CD105 and CD31 retrospectively. In addition, the expression of VEGF and the proliferation index (Ki67) of tumor cells were evaluated and their values correlated with MVD. Results: The mean MVD for CD105 was 15.8±6.2, and that for CD31 was 27.8±10.9 (P<0.05). A significant correlation was found between these two markers (r=0.290, P=0.019). With respect to clinicopathologic variables, none of the comparisons was found to be significant. CD105 MVD was positively associated with the expression of VEGF, although this was not the case with CD31 MVD (Spearman’s ρ=0.612, P<0.001 and ρ=0.097, P=0.442, respectively). The mean CD105 MVD significantly increased with the increase in VEGF score (P<0.01, Kruskal-Wallis test), whereas this was not significant for CD31 MVD (P=0.328). Ki67 proliferation index was significantly correlated with CD105 MVD (Pearson’s r=0.410, P=0.01), but correlation could not be observed with CD31 MVD (r=0.100, P=0.428). Finally, the survival was significantly longer (mean survival 2127±176 days) in patients with lower CD105 MVD in comparison with shorter survival time (mean survival 1195±350 days) in patients with higher CD105 MVD (P=0.009, log-rank test). This correlation was not found for CD31 MVD (P=0.718). Conclusion: As a specific marker for intratumoral neoangiogenesis in endometrial cancer, MVD measured by CD105 has a prognostic value and correlated with proliferation index of tumor cells. Therefore, in the future, endoglin could be a potential target for antiangiogenic therapy.

The role of CD99 in tumor angiogenesis

이혜령 강원대학교 일반대학원 2008 국내석사

Angiogenesis of endothelial cells is speculated to represent a key step in the growth of tumors. A growing tumor may switch to the angiogenic phenotype, induce the formation of new capillaries, and start to invade the surrounding tissue. Tumor angiogenesis is a process that requires migration, proliferation and differentiation of endothelial cells. CD99 protein, a 32kD integral membrane protein, is expressed in most endothelial cells suggesting that CD99 plays a role in angiogensis. In this study, the effects of CD99 signaling on angiogenesis and tumor growth were investigated. CD99-Fc fusion proteins and CD99 peptide I- III, which contain an excellular domain from amino acid 89 to 107 of CD99, inhibit the adhesion of mouse brain endothelial bEND.3 cells to extracellular matrix (ECM) and their invasion through ECM. However, they do not block the proliferation of bEND.3 cells. CD99-peptides I - III inhibited the motility and aggregation of bEND.3 cells on the matrigel. The inhibitory effects of CD99-peptide I and II on the tube formation of bEND3 cells was partly restored by over-expression of dominant negative forms of CD99 or transfection of CD99 siRNA. The injection of CD99 peptide I suppressed the growth of mouse melanoma cells, B16-F10, in the nude mouse. These results suggest that CD99-Fc fusion proteins and CD99-peptide I - III reduce tumor angiogenesis through the inhibition of ECM adhesion and migration of endothelial cells. 내피세포의 혈관생성은 종양형성에 중요한 과정 중 하나이다. 암이 진행되면서 새로운 모세혈관을 형성하고, 주변 장기로의 침윤을 보이기도 한다. 종양의 신생혈관생성은 암세포의 이동, 확산, 내피세포의 분화가 수반되는 것이 특징이다. CD99단백질은 32kD 세포막 단백질로써 대부분의 내피세포에서 발현된다. 이 사실은 CD99가 신생혈관생성에 영향을 미칠 가능성을 제시한다. 본 연구에서는 CD99 신호가 신생혈관생성과 종양성장에 미치는 영향을 조사하였다. CD99의 세포질외영역 중 89에서 107까지의 아미노기를 포함하고 있는 CD99-Fc 융합단백질과 CD99 펩티드 Ⅰ-Ⅲ은 생쥐 뇌내피세포인 bEND.3와 세포외기질간의 유착, 그리고 이 내피세포의 세포외기질을 통한 침윤을 억제하였다. 그러나 bEND.3의 증식에는 영향을 미치지 않았다. CD99-펩티드 Ⅰ-Ⅲ은 matrigel 상에서 bEND.3의 운동성과 응집을 억제하였다. bEND.3의 관 형성에서 CD99-펩티드 Ⅰ과 Ⅱ의 억제 효과는 CD99의 dominant negative부분의 과 발현이나, CD99 siRNA의 이입에 의해 어느 정도 회복되었다. CD99-펩티드 Ⅰ를 주입한 누드 생쥐에서 흑색암종 세포의 성장이 억제되었다. 이와 같은 결과는 CD99-Fc 융합 단백질과 CD99 펩티드 Ⅰ-Ⅲ이 내피세포와 세포외기질간의 유착과 이동을 억제함으로써 종양의 신생혈관생성을 감소시킨다는 것을 제시한다.