Effect of hypoxia on activation of pyroptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells

박찬호 Graduate School, Yonsei University 2023 국내석사

저산소성 뇌손상은 뇌에 일반적인 혈액 공급 과정이 정상적으로 진행하지 못할 때 발생합니다. 이러한 손상 사례는 대부분 혈전으로 막힌 혈관 때문에 산소와 혈액 공급 부족으로 불리는 허혈성 뇌졸중으로 이어집니다. 염증성 예정 세포사의 한 형태인 파이롭토시스는 저산소성 뇌 손상에서 신경 세포를 파괴하는 핵심 요소일 수 있습니다. 그러나 신경세포에서 염화코발트(CoCl2)로 인한 저산소성 뇌 손상에 대해 파이롭토시스가 어떻게 관여하는지 아직 알려지지 않았습니다. 이 연구에서, 우리는 SH-SY5Y 세포의 파이롭토시스가 염화코발트(CoCl2) 유도 저산소증에 의해 어떻게 영향을 받는지 확인했습니다. 염화코발트(CoCl2)는 저산소증 모방체로서 시험관내 및 생체내 연구 모두에 일반적으로 사용되어 왔습니다. 우리는 염화코발트 처리에 의해 저산소 상태가 형성된다는 것을 결정하기 위해 HIF-1α 발현 수준을 확인합니다. 염화코발트 처리에 따른 표준 파이롭토시스 관련 단백질 NLRP3, Caspase-1, GSDMD N-terminal(GSDMD-NT) 발현이 증가했습니다. 또한, 비표준 파이롭토시스 관련 단백질 Caspase-3, GSDME N-terminal(GSDME-NT)의 발현이 증가했습니다. 또한, c-YVAD-cmk 및 z-DEVD-fmk를 사용한 Caspase-1 및 Caspase-3의 억제는 세포 독성을 유의하게 완화시키고 GSDMD&E N-terminal 발현을 감소시켜 파이롭토시스에 의한 세포사를 예방하였습니다. 우리의 연구 결과는 염화코발트 처리에 의한 신경세포의 저산소 상태에서 Caspase-1/GSDMD 그리고 Caspase-3/GSDME 매개 파이롭토시스 관련 세포사 메커니즘을 확인하였습니다 Hypoxic brain injuries occurs when common blood supply process is unavailable to the brain. This case of damage mostly followed by ischemic stroke which called as lack of oxygen and blood supply because of blood vessel blocked by thrombosis. Pyroptosis, a form of inflammatory programmed cell death, may be a key factor in the destruction of neuronal cells in hypoxic brain injury. But it is still unclear how pyroptosis contributes to the hypoxic brain damage caused by cobalt chloride (CoCl2) on neuronal cells. In this study, we assessed how pyroptosis on SH-SY5Y cells is affected by cobalt chloride (CoCl2)-induced hypoxia. cobalt chloride (CoCl2) has been commonly used in both in vitro and in vivo research as a hypoxia mimic. we define HIF-1α expression level to determine hypoxic condition is formed by treatment of cobalt chloride. Canonical pyroptosis related proteins NLRP3, Caspase-1, GSDMD N-terminal (GSDMD-NT) expression were increased when treatment of cobalt chloride dose dependent. Also, non-canonical pyroptosis related proteins Caspase-3, GSDME N-terminal (GSDME-NT) were increased. Moreover, inhibition of Caspase-1 and Caspase-3 with ac-YVAD-cmk and z-DEVD-fmk significantly alleviated cell cytotoxicity and decrease GSDMD&E-NT expression to prevent pyroptotic cell death. Our findings determined a mechanism of pyroptosis cell death during the process of Caspase-1/GSDMD and Caspase-3/GSDME mediated pyroptosis in Cobalt chloride neuronal hypoxic condition.

S100A8/A9에 의한 1차 배양 미세아교세포 및 성상교세포에서 증가되는 S100A8의 TLR4/NF-κB/NLRP3 경로를 통한 pyroptosis 조절

김지은 건양대학교 대학원 2023 국내석사

염증 매개체 중 하나인 S100A8/A9는 알츠하이머병(AD) 또는 외상성 뇌손상(TBI)과 같은 여러 신경퇴행성 질환에서 증가하며 염증의 신뢰할 수 있는 마커로 간주된다. S100A8/A9는 위험 관련 분자 패턴(DAMPs)에 속하며 면역 반응을 유도할 수 있다. 미세아교세포와 성상교세포는 중추신경계(CNS)의 비신경 세포에 해당된다. 미세아교세포는 염증과 손상이 일어나는 동안 대식세포로 기능하며 중요한 식세포 역할을 한다. 또한 성상교세포는 여러 사이토카인의 분비 및 신경독성 물질의 방출을 담당한다. 염증과 관련된 세포 사멸 중 파이롭토시스(pyroptosis)는 유전적으로 암호화된 괴사의 경로 중 하나이며 비염증성 형태의 세포 사멸과는 다른 유형의 세포 사멸이다. 지금까지 다른 연구들에선 S100A8/A9를 사용한 암의 세포 사멸을 확인했지만 뇌 질환에서는 현재까지 밝혀진 바가 많지 않다. 본 연구에서는 S100A8/A9 처리에 의한 S100 A8 발현이 1차 미세아교세포 및 성상교세포의 파이롭토시스에 영향을 미치는지 조사하였고 그 결과, 1차 미세아교세포와 성상교세포에서 S100A8/A9에 의해 유발된 caspase-1의 활성화와 특정 사이토카인의 성숙은 TLR4/NFκB/ NLRP3 경로를 통해 파이롭토시스 세포 사멸을 유도함을 확인했다. 또한 S100 A8 short-hairpin RNA (shS100A8)는 ninjurin-1 (NINJ1) 및 GSDMD와 같은 파이롭토시스 관련 단백질의 발현을 억제하였다. 요약하면, 본 연구 결과는 1차 소교 세포 및 성상교세포에서 S100A8/A9에 의한 증가된 S100A8 발현이 파이롭토시스를 유도한다는 것을 밝히는 새로운 관점을 제안한다. One of the inflammatory mediators, S100A8/A9 is increased in several neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD) or traumatic brain injury (TBI) and is regarded as a reliable marker of inflammation. S100A8/A9 belongs to the danger -associated molecular patterns (DAMPs) and types of molecules that can elicit an immune response. Microglia and astrocytes are non-neuronal cells of the central nervous system (CNS). During inflammation and injury, microglia function as macrophages and play an important phagocytic role. Astrocytes take charge of secretion of multiple cytokines or release of neurotoxic amounts. Among the cell death associated with inflammation, pyroptosis is one of the genetically encoded pathways of necrosis and it is a different type of cell death from the non-inflammatory form of apoptosis. So far, other studies have confirmed cell death through S100A8/A9 in cancer, but not in brain disease. As a heretofore not revealed, I investigated whether S100A8 expression by each treatment of S100A8 and S100A9 affect the pyroptosis of primary microglia and astrocytes. The activation of caspase-1 and maturation of specific cytokines in the S100A8/A9-triggered primary microglia and astrocytes induced pyroptotic cell death through TLR4/NF-κB/ NLRP3 pathway. Furthermore, S100A8 short-hairpin RNA (sh S100A8) inhibited the expression of pyroptosis-related proteins like ninjurin-1 (NINJ1) and GSDMD. In summary, our findings suggest a novel perspective, revealing that the increased S100A8 expression by S100A8/A9 in primary microglia and astrocytes induce pyroptosis.

Filamin A stabilization and pyroptosis by USP2a

김한나 서울대학교 대학원 2020 국내석사

The prevalence of obesity is growing worldwide, amplifying concerns of non-alcoholic fatty liver diseases (NAFLD). The pathogenic mechanisms of NAFLD have not yet been fully clarified, but the cellular phenomenon termed endoplasmic reticulum stress (ER stress) is shown to be involved in the progression of NAFLD. ER stress occurs when there is an excessive accumulation of unfolded and misfolded proteins in the ER or ER calcium depletion due to pathological conditions. An adaptive mechanism called the unfolded protein response (UPR) is activated to maintain ER homeostasis in response to ER stress. However, when UPR for the recovery of homeostasis fails, ER stress may activate programmed cell death (PCD) cascade leading to disease progression. Historically, studies on NAFLD have laid much emphasis on apoptosis and necrosis. But more recently, other types of programmed cell death, such as the pro-inflammatory form of cell death, has gained more attention in the pathogenesis of NAFLD. Through a large number of studies conducted, ER stress-related 78-kDa glucose-regulated protein (grp78), protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), and inositol requiring enzyme 1 (IRE1α) sub-molecules were suggested as potential targets for treatments. Nevertheless, these had the limitations of side effects and nonspecific actions. Thus, the new target discovery is needed. Ubiquitin specific proteases (USP) are emerging as promising druggable targets for pharmacological intervention due to the advantages of the potential specificity, leading to better efficacy and reduce nonspecific side effects. However, there is a lack of studies on USPs regarding ER-stress related NAFLD. Therefore, this study aimed to discover novel targets for NAFLD and investigated the pathological mechanisms relating to ER stress for new treatment approaches. In this research, USP2a was identified as a potential regulator in NAFLD by using a high-fat diet (HFD) induced steatosis and a methionine deficient choline diet (MCD) induced NASH models. The expression of USP2a was significantly increased in these diet-induced NAFLD models. In addition, thapsigargin (Tg) treatment in AML12 cells also increased the expression of USP2a in ER. At the molecular level, the expressional increase of USP2a was dependent on the phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2α (eif2α). Next, the function of USP2a was investigated. The proteomics analysis and immunoprecipitation assay were performed and identified the specific intracellular fiber molecule, filamin A, as a novel binding protein of USP2a. Mechanistically, USP2a directly interacted and deubiquitinated filamin A, which increased the expressions of the store-operated calcium channels (SOCs) components. Besides, the overexpression of USP2a in hepatocytes in vivo using a hydrodynamic injection technique has stabilized the expression of filamin A and has enhanced both hepatic damage and pyroptotic markers, such as cleaved caspase-1 (c-cas1) and interleukin 1-beta (IL-1β). In contrast, USP2a inhibitor treatment has decreased the expression of c-cas1, and the knockdown of USP2a has increased cell survival. Collectively, the results have identified the novel role of USP2a in ER stress-induced NAFLD. It demonstrated the stabilization of filamin A and the increase of hepatic SOCs components, which further enhanced liver damage and pyroptosis. Thereby, this study provides the potential value of targeting USP2a for therapeutic treatments and insights into the pathogenesis of NAFLD. 비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 발생과 진행단계의 분자적 병리기전은 아직까지 명확하게 밝혀지진 않았지만, 세포 내 일어나는 현상인 소포체 스트레스가 (ER stress) 관여하는 것으로 제시되었다. 소포체 스트레스가 발생하면, 이에 대응하기 위해 비접힘 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR)을 실행하며 스트레스를 감소한다. 그러나, 소포체의 항상성이 회복되지 않을 경우, 세포의 기능변화 및 세포예정사를 유도 하며 질병의 진행을 유발시킨다. 최근엔 아폽토시스 (apoptosis) 뿐만 아니라, 염증을 수반하는 또 다른 형태의 괴사성 세포 사멸도 비알코올성 지방간 질환의 발생과 병리 진행에 역할을 하는 것으로 주목 된다. 비알코올성 지방간 질환에서 소포체 스트레스 관련 분자인 Grp78, PERK, IRE1α하위 분자 등이 타깃으로써 제시 되었지만, 부작용과 비 특이적 작용으로 한계가 있기 때문에 새로운 타깃의 발굴이 필요하다. Ubiquitin specific proteases (USP) 는 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자 화합물 (small molecule)로서 효율적인 약물 타깃으로 (druggable target) 가능한 것으로 보인다. 그러나 소포체 스트레스 관련하여 비알코올성 지방간 질환에서의 USP는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 비알코올성 지방간 질환의 치료 전략을 수립하기 위하여, 병인으로 작용하는 소포체 스트레스와 파이롭토시스 사이의 병리기전을 탐구하고 새로운 분자 타깃을 발굴하고자 했다. 첫번째로, 고지방 식이 요법으로 (high fat diet, HFD)유도한 지방간 모델과 메티오닌 콜린 결핍 식이 요법으로(methionine choline deficient, MCD) 유도한 지방간염 모델을 사용하여 USP2a를 비알코올성 지방간 질환에서의 조절자로 도출하였다. 또한, 소포체 스트레스 유도물질인 thapsigargin을 AML12 세포에 처리하였을때, USP2a 발현이 소포체에서 증가하였다. 이것은 소포체 스트레스 센서인 PERK의 하위 분자eif2α를 매개로 한 경로가 관여하는 것으로 나타났다. 두번째로, USP2a의 새로운 역할과 이에 관여하는 분자를 찾아내고자 하였다. 세포모델에서 프로테오믹스 (proteomics) 실험 및 분석을 통해, USP2a의 새로운 결합 단백질로 filamin A를 발굴하였다. Filamin A의 발현은 USP2a와 동일하게 고지방 식이를 섭취한 마우스의 간 조직에서도 증가하였다. 유체 역학을 통한 USP2a과발현-플라스미드를 주입하여 마우스의 간 조직에서 USP2a를 과발현 시킨 결과, filamin A의 발현이 증가하였다. 또한, 간의 대표적 store-operated channels (SOC)인 ORAI1과 STIM1의 발현이 증가하였다. 더불어, 파이롭토시스의 지표인 cleaved-caspase 1과 Interleukin-1 beta가 증가하였고, 간 조직의 손상도 관찰되었다. 반대로, AML12세포에서 USP2a를 knockdown 시킨 군에서는 세포의 생존 지표인 p-Akt 가 증가하였다. 또한, AML12 세포에 USP2a 억제제를 처리하였을 때에도 파이롭토시스를 억제 하는 것으로 나타났다. 본 연구결과를 종합하면, USP2a를 소포체 스트레스가 동반되는 지방간, 또는 지방간염에서의 조절자로 도출하였고, 또한 USP2a의 새로운 역할을 발견하였다. USP2a는 filamin A를 안정화 시키는 것으로 나타났으며, SOC 채널의 발현 증가를 매개하여 파이롭토시스를 유도한다. 나아가 본 연구 결과는 비알코올성 지방간 질환의 치료 개발함에 있어서 파이롭토시스를 방어 하는 새로운 타깃으로서의 가능성과, 세포 신호 경로를 제시할 수 있다.

Inhibitory effect of microRNA-762 on pyroptotic cell death of mesenchymal stem cell after transplantation in ischemic heart

이창연 Graduate School, Yonsei University 2018 국내박사

The high death rate of cells transplanted into damaged hearts due to exposure to harsh conditions, such as hypoxia and high reactive oxygen species (ROS) concentrations, hampers the efficacy of stem cell-based therapy. Preventing cell death after transplantation is an essential requirement for using cell therapy to treat damaged hearts. Thus, the long-term survival of transplanted cells is a major goal in optimizing cell therapeutic applications. In addition to necrosis, apoptosis, and anoikis, pyroptosis has recently been recognized as a form of programmed cell death in the myocardium. Pyroptosis is mediated by cell lysis and the release of inflammatory cytokines, such as interleukin (IL)-1β and IL-18. Furthermore, cysteine-dependent aspartate-specific proteases 1 (caspases 1) are sequentially cleaved by pyroptosis-mediated cell death. Suppressing pyroptosis to improve transplanted stem cell survival in the infarcted myocardium has not been well studied. Thus, we inhibited pyroptosis to increase the survival rate of transplanted cells in the damaged myocardium. In the present study, IL-1β staining demonstrated that pyroptosis occurred in hearts with ischemia-reperfusion (I/R) injury. In addition, the expression of F4/80, a specific macrophage marker, was increased in the damaged myocardium, thus indicating macrophage recruitment. Next, increased pyroptosis-specific gene expression levels were found in RAW264.7 cells treated with lipopolysaccharides (LPS) and interferon (IFN)-γ. These data show that M1 macrophages are specifically involved in pyroptosis in hearts with I/R injury. Furthermore, specific microRNAs (miRs) have been identified to inhibit pyroptosis as well as improve the survival of stem cells transplanted into damaged hearts. miRs were screened by differentially expressed gene (DEG) analysis, and miRNA-762, which inhibits IL-1β expression by binding to its 3’ untranslated region (UTR), was identified. Significantly decreased pyroptosis-related gene and protein expression levels were detected in mesenchymal stem cells (MSCs) transfected with miR-762. Finally, cardiac fibrosis was ameliorated by transplanting miR-762-transfected MSCs into hearts with I/R injury. In conclusion, pyroptosis is an essential mechanism that induces inflammation and cell death. In addition, inhibiting the pyroptosis factor IL-1β by transfecting miR-762 into MSCs could be used in cell therapy for treating damaged hearts.