Linker peptide가 cell penetrating peptide(CPP)-FKBP12 융합단백질의 세포침투 활성에 미치는 영향에 관한 연구

이재욱 한림대학교 대학원 2019 국내석사

세포 침투성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CPP)는 단백질을 포함한 다양한 생체 고분자 물 질을 세포내로 운반 할 수 있는 것으로 알려져 있다. CPP로 알려진 PEP-1은 여러 단백질을 여러 세포주와 조직에 효율적으로 전달할 수 있다. 실제로 PEP-1-FKBP12 융합 단백질은 세포주에 성 공적으로 전달되어 항염증 활성을 나타내었다. 이는 PEP-1-FKBP12가 염증성 질환 치료에 유용 할 수 있음을 시사한다. 치료제를 개발하려는 노력으로 FKBP12를 기반으로 하여 PEP-1-FKBP12 융합 단백질의 형질 도입 효율을 향상 시키려고 노력하였다. 이를 위해 우리는 PEP-1과 FKBP12 단백질 사이에 여러 가지 linker 펩타이드를 삽입했는데, 그 이유는 linker가 안정한 생체 활성을 보이는 재조합 융합 단백질의 생성에 중요성을 보여 주었기 때문이다. 놀랍게도, 어떤 linker 펩 타이드가 사용되는지에 따라 PEP-1-FKBP12의 형질 전환 활성의 현저한 변화가 관찰되었다. 또 한, N- 말단과 C- 말단에서 융합된 Oct4와 FKBP12 단백질의 형질 전환 활성에 대한 linker 펩타 이드의 영향을 시험 하였다. 이는 FKBP12의 말단에 존재하는 다양한 CPP와 최적의 linker에 대 한 조합은 모두 다른 것으로 나타났다. 이러한 결과는 cargo 단백질의 최적의 형질 도입을 위한 적절한 CPP뿐만 아니라 적절한 linker 펩타이드를 선택하는 것이 중요 할 수 있음을 시사한다.

Streptozotocin으로 유도된 1형 당뇨 마우스모델에서 angiopoietin-1 합성단백질의 음경 혈관내피세포 재생 및 발기력 개선 효과

김해영 인하대학교 대학원 2010 국내박사

목적: 당뇨성 발기부전 환자는 심한 음경해면체 내피세포부전을 동반하며, 기존의 경구용 phosphodiesterase-5 억제제에도 치료반응도가 낮아서 새로운 치료법의 개발이 절실하다. Angiopoietin-1 (Ang1)은 안정적인 혈관생성 및 혈관성숙에 관여하며, 최근 개발된 cartilage oligomeric matrix protein (COMP)-Ang1은 기존의 native Ang1에 비해 훨씬 강력하게 혈관생성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 streptozotocin (STZ)으로 유도된 1형 당뇨 마우스모델에서 COMP-Ang1 단백질이 활성산소 발현 및 발기력 개선에 미치는 효과를 평가하였다. 대상 및 방법: 생후 8주된 수컷 마우스 (C57BL/6J)를 대상으로 하였고, 당뇨는 STZ (50 mg/kg)을 5일 연속 복강 내 투여함으로써 유발하였으며, 당뇨 유도 후 8주째에 실험을 진행하였다. 총 4 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였고 (1군, 대조군; 2군, 당뇨군; 3군, 당뇨군 + PBS [20 μl, 2회 투여, days -3 and 0]; 4군, 당뇨군 + COMP-Ang1 단백질 투여군 [5.8 μg/20 μl, 2회 투여, days -3 and 0]; n=18/군), 단백질 투여 후 2주, 4 주째에 음경해면체신경자극 후 발기력을 측정하였다. 음경해면체 조직에서 TUNEL, hydroethidine 염색 및 PECAM-1, phosphohistone H3, phospho-eNOS, nitrotyrosine 에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. iNOS, p47phox, 혈관내피세포 이음부물질 (endothelial cell-cell junction)에 대한 western blot 및 cGMP 양을 측정하였고, vascular permeability test도 시행하였다. 결과: COMP-Ang1은 음경해면체 조직에서 내피세포재생 및 eNOS phosphorylation, cGMP 발현 증가를 유발하였고, 그 결과 해면체신경자극 후 발기력도 투여 후 4주째까지 회복되었다. COMP-Ang1은 iNOS, p47phox, superoxide anion, nitrotyrosine 발현을 현저하게 감소시켰고, 음경 혈관내피세포 및 평활근세포의 apoptosis도 현저하게 감소되었다. 또한 COMP-Ang1은 혈관내피세포 이음부물질 (vascular endothelial-cadherin, zonula occludens-1, occludin, and claudin-5)의 발현을 정상 수준으로 완전하게 회복시켰고, 그 결과 음경 혈관내피세포의 permeability도 현저하게 감소되었다. 결론: 상기 결과로 미루어 볼 때, Ang1 합성단백질을 이용한 음경 혈관내피세포 재생은 당뇨성 발기부전의 근본적인 치료법이 될 것으로 생각된다.

Expression and function of immunotherapeutic recombinant proteins through transient and transgenic plant expression systems

김기범 중앙대학교 대학원 2022 국내박사

The factors to consider in the development of vaccines and antibodies (immunetherapeutic proteins) for cancer treatment are their bio-reactivity, stability and most importantly, a reasonable cost for their mass-production. In general, recombinant immunotherapeutic proteins such as vaccines and antibodies have been produced through host cells such as mammalian cells, fungi, and bacteria. The therapeutics produced in this way have high reactivity and stability, however, there are some limitations in that expensive production costs occur in the process of culturing and purification, and advanced technology is required. However, plants are attractive as a new host that can overcome the limitations of existing therapeutic protein expression hosts. Since they have several advantages such as an cost-effectiveness and easy production systems, ease of storage through seeds, and reduced risk of human pathogenic contamination, unlike conventional hosts. The technology for expression and production in plants based on genetic recombination technology is called ‘plant molecular farming (PMF)’. PMF has been developed to produce highly valuable proteins including recombinant vaccines, antibodies, and enzymes. The first chapter of this study is a review of plant expression systems and their ability to produce recombinant vaccines and antibodies. In this chapter, the detailed information on plant transformation methods, fragment crystallizable (Fc) fusion proteins, and the advantages and limitations of plant-derived immunotherapeutic proteins is included. The second chapter demonstrates the expression of plant-derived colorectal cancer vaccine candidates GA733-Fc and GA733-FcK using transient transformation and validation of the vaccine candidate through various in vitro and in vivo functional analyses. To produce GA733-Fc and GA733-FcK using the transient expression method, I cloned a fusion gene of GA733 and human immunoglobulin G Fc fragment (GA733-Fc), and a KDEL endoplasmic reticulum (ER) retention motif sequence was attached to the C-terminus of Fc to increase protein expression and avoid the plant-specific glycosylation (pEAQ-HT GA733-Fc and pEAQ-HT GA733-FcK). These cloned plasmids were transformed into Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, Ag/GA733-Fc and Ag/GA733-FcK) for infiltration to leaves of Nicotiana benthamiana. In order to temporally and spatially optimize the harvest conditions of infiltrated leaves, I harvested by dividing various conditions [1-10 days post-infiltration (dpi) and leaf positions (top, middle, and base)]. Then, I performed western blot and polymerase chain reaction (PCR) using each dpi harvested leaf and its isolated genomic DNA (gDNA) for optimization target protein expression level. And according to the established conditions, mass produced GA733-Fc and GA733-FcK were successfully purified with high purity using protein A resin. Furthermore, I performed surface plasmon resonance (SPR), and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for in vitro function analysis as vaccine candidates. In addition, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis was performed to confirm a high-mannose type N-glycan structure of GA733-FcK. In this chapter, in vivo generation of GA733-specific antibodies were analyzed in BALB/c mice immunized by GA733-Fc and GA733-FcK. ELISA with sera from the vaccinated mice confirmed that the plant-derived GA733-Fc and GA733-FcK produced both GA733-specific antibodies. These results suggest that GA733-FcK has a higher effect as a vaccine candidate than GA733-Fc in vitro and in vivo as well as increase the expression level in plants. The third chapter demonstrates the expression and function of anti-HER2 VHH-FcK, the recombinant anti-HER2-positive breast cancer llama antibody fused to FcK in the plant expression system compared to the commercial Trastuzumab (Herceptin), anti-HER2-positive breast cancer antibody. Trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer is considered the biggest drawback of Trastuzumab. Thus, I performed various in vitro analyses to compare the function of anti-HER2 VHH-FcK and Trastuzumab (Herceptin) as antibodies against HER2-positive breast cancer cells BT-474 and Trastuzumab resistant mutant cell line BT-474 (BT-474-TR). So SPR was performed to analyze the binding affinity of each antibody to the HER2 protein in protein level. In the result of binding affinity, it was confirmed that Trastuzumab had a significantly higher binding activity to HER2 protein than that of anti-HER2 VHH-FcK. I also performed various biological antibody functional analyses to compare the biological property of anti-HER2 VHH-FcK with Trastuzumab. In MTT assay, it was confirmed that the cell viability of both BT-474 and BT-474-TR cells treated with anti-HER2 VHH-FcK was lower than that of Trastuzumab suggesting that anti-HER2 VHH-FcK has a greater effect as an antibody on the inhibition of cell proliferation, cytotoxicity and growth of BT-474 and BT-474-TR cells than Trastuzumab. Transwell migration assay confirmed that the inhibition of metastasis in vitro was higher than that of trastuzumab when treated with anti-HER2 VHH-FcK. In addition, when anti-HER2 VHH-FcK treated both BT-474 and BT-474-TR cells, the degradation of HER2 protein on the cell surface was confirmed by western blot using cell lysis treated with anti-HER2 VHH-FcK and Trastuzumab. In cell ELISA, it was confirmed that both cell lines treated with anti-HER2 VHH-FcK was bound stronger than that of Trastuzumab. Atomic Force Microscopy (AFM) physically confirmed that the binding probability (%) was higher than that of Trastuzumab. In various in vitro experimental results, it was confirmed that when Trastuzumab was treated to BT-474-TR cell, its function as an antibody was significantly reduced compared to that of BT-474 cell, whereas the anti-cancer activity of anti-HER2 VHH-FcK was maintained at a similar level between BT-474 and BT-474-TR. Therefore, it suggests that plant-derived anti-HER2 VHH-FcK has potential as an alternative treatment that could overcome the limitations of the existing commercial anti-HER2-positive breast cancer antibody, Trastuzumab. Overall, this thesis suggests that colorectal cancer vaccine candidates GA733-Fc, GA733-FcK and anti-HER2 positive breast cancer llama antibody, anti-HER2 VHH-FcK, can be successfully produced through plant expression systems. And the various in vitro and in vivo function results suggest that plant-derived immunotherapeutic proteins can be an alternative solution to overcome the limitations of existing biopharmaceuticals. 일반적으로 백신과 항체와 같은 재조합 치료용 단백질은 동물 세포, 곰팡이, 박테리아 등의 숙주를 통해 생산되고 있다. 이렇게 생산된 단백질은 높은 반응성과 안정성을 갖지만 배양 및 정제 과정에서 고가의 생산비용이 발생하며 고도화된 기술이 필요하다는 한계점이 존재한다. 그러나 최근, 기존 시스템의 한계점에 대응하여 치료용 재조합 단백질 발현을 위한 시스템으로 식물이 많은 가능성을 보이며 각광을 받고 있다. 식물은 기존 생산 플랫폼과 달리, 동물세포 배양에 비해 빠르고 인수공통병원체에 대한 감염 우려가 없어 안전하며 생산 비용이 저렴하며 보관이 용이하다는 다양한 이점을 갖는다. 암세포를 제거하는 결정적인 역할을 하는 것이 T 세포인데, 이 T 세포가 활성 하기 위해서는 종양 관련 항원(TAA)를 인식하는 과정이 필수적이기에 TAA의 선택이 암 백신 개발의 가장 중요하다고 볼 수 있다. 본 연구의 2장에서는 대장암의 백신 치료를 위해 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 관련 항원(TAA)으로 대장암 세포 표면에 과발현 되어있는 당 단백질 GA733을 식물에서 발현하고자 하였다. 대장암에 과발현 되어있는 TAA인 GA733을 이에 본 연구에서는 GA733을 면역글로불린G의 Fc영역과의 결합을 통한 정제의 용이성, 면역반응 증대, Fc 수용체와의 상호작용 등의 장점을 통해 많은 각광을 받고 있는 Fc융합 기술과 접목하였다(GA733-Fc). 뿐만 아니라, 식물에서 생산되는 단백질의 발현 수준을 극대화하고, 투여 시 알러지 반응을 일으킬 수 있는 식물 특이적 당의 생성을 막기 위해 KDEL서열을 부착한 형태인 GA733-FcK를 transient 형질전환 방법을 이용하여 담배식물에서 생산하였다. Transient 형질전환을 위해 사전 연구를 통해 식물에서의 이종 단백질 발현 수준 증진의 우수성이 증명된 콩과 작물 바이러스 기반의 pEAQ-HT를 발현 백터로 사용하였다. 클로닝된 GA733-Fc와 GA733-FcK 유전자 플라스미드는 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환을 통해 매개체로 삼아 담배식물(Nicotiana benthamiana) 잎에 주사기를 이용하여 침윤 시켰다. 침윤된 잎의 목표 단백질 대량생산을 위한 수확 조건을 시간적·공간적으로 최적화하기 위해 다양한 수확 날짜 (1~10일, dpi)와 식물체 잎의 위치(상·중·하위) 별로 수확했다. 목표 단백질 발현 수준을 최적화하기 위해, 각각의 dpi별로 수확한 잎에서 추출한 genomic DNA를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 웨스턴블랏 결과, GA733-Fc와 GA733-FcK는 모두 상위에 위치한 잎에서 침윤된 지 5일차(5 dpi)에 가장 높은 발현 수준을 나타냈다. 이러한 결과는 KDEL과 상부의 잎에서 이종단백질의 발현 수준을 증대시키는 데 관여한다는 것을 시사한다. 이러한 조건을 바탕으로 정제를 수행 하였으며, SPR을 통해 GA733-FcK의 Fc 감마 수용체 I (CD64)간의 결합력이 GA733-Fc보다 높다는 것을 확인하였으며, 효소면역정량법(ELISA)을 통해 GA733-FcK가 동물세포에서 생산된 상업용 GA733-FcM보다 높은 GA733 항체에 결합 반응을 나타내는 것을 확인하였다. 그리고 당 구조를 파악하기 위해 HPLC 분석을 수행하여 GA733-FcK에는 KDEL에 의해 알러지 반응을 유도할 수 있는 식물 특이적 당 구조가 생성되지 않은 high-mannose 형태를 갖는다는 것을 확인하였다. 아울러, in vivo에서의 GA733-Fc와 GA733-FcK는 BALB/c에 정제된 단백질을 접종하여 얻은 혈청을 이용하여 효소면역정량법(ELISA)를 수행 함으로서 식물 유래 GA733-Fc와 GA733-FcK는 GA733 특이적 항체를 모두 생산 할 수 있다는 것을 확인하였다. 그리고 이러한 결과는 GA733-FcK는 생산량의 증대 뿐만 아니라 Fc 융합 단백질과 백신 후보 물질로서 GA733-Fc보다 높은 효과가 있다는 것을 시사한다. 본 연구의 3장은 서구화된 식습관 등으로 인한 여성 발병률 1위인 유방암 중, 20-25%정도에 해당하는 Human Epidermal growth factor Receptor 2 (HER2) 양성 유방암의 항체를 치료효과 증진을 위한 구조 변경 후 식물에서 생산하여 기존 상업용 치료제인 Trastuzumab (Herceptin)에 대체 가능성에 대하여 다루고자 하였다. HER2 양성 유방암의 치료는 종양의 생존, 전이, 증식 등을 촉진하는 역할을 하는 불량한 예후 인자이며, 이에 대한 항체가 주된 치료방법으로 사용되어왔으며, 가장 많이 이용되는 표적치료제가 Trastuzumab이다. 그러나 환자 중 약 50%가 Trastuzumab에 대한 내성을 나타내어 새로운 치료제가 필요한 상황이다. 본 장에서는 식물에서 라마 항체 기반의 새로운 HER2 양성 유방암 항체 'anti-HER2 VHH-FcK'를 발현 및 생산하였으며, Trastuzumab 내성을 갖는 BT-474-TR 세포 에서의 항체 활성 평가를 분석 하였다. SPR을 통해 HER2 단백질과 결합력 비교를 통해 단백질-단백질 상호 작용 단계에서 Trastuzumab이 anti-HER2 VHH-FcK보다 높은 결합력을 보유하고 있다는 것을 확인하였다. 그러나 HER2 양성 유방암 세포 BT-474와 BT-474-TR을 이용한 다양한 항체 활성 평가 (MTT, transwell cell migration, Cell ELISA, cell western blot)을 통해 BT-474에 대한 항체 활성은 anti-HER2 VHH-FcK과 Trastuzumab이 비슷한 수준을 보인 반면, BT-474-TR 세포에 대한 Trastuzumab의 암세포 생존, 전이, 유방암 세포 표면에 과발현 되어있는 HER2 단백질과의 결합 능력 및 이동성 저해 등에 관한 항체 활성이 크게 감소하였으며, anti-HER2 VHH-FcK는 BT-474와 비슷한 활성 수준을 유지하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 원자 힘 현미경(AFM)을 이용하여 물리학적인 결합력의 힘을 분석한 결과, anti-HER2 VHH-FcK는 Trastuzumab과 달리 BT-474와 BT-474-TR 모두에 높은 binding probability를 유지한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 anti-HER2 VHH-FcK는 Trastuzumab 내성 HER2 양성 유방암 세포에서 항체 활성이 유지된다는 것을 의미한다. 종합적으로, 본 논문에서는 식물 발현 시스템을 통해 생산된 대장암 백신 후보물질 GA733-Fc와 GA733-FcK, 그리고 라마 항체 모티브의 HER2 양성 유방암 항체 anti-HER2 VHH-FcK는 성공적으로 생산될 수 있으며, in vitro 환경에서 다양한 항체 활성 실험을 통해 각각의 백신, 항체로서 기능이 확인되어, 기존에 사용 되던 바이오 의약품들의 한계점을 극복할 수 있는 대안이 될 수 있음을 시사한다.

Industry Analysis of Therapeutic Protein Biopharmaceuticals : 치료용 단백질 바이오 의약품 산업분석 연구

조성식 Graduate School of Engineering Yonsei University 2001 국내석사

The therapeutic protein sector of the pharmaceutical industry has grown rapidly since its inception in 1975 due to an increased knowledge of recombinant DNA manufacturing techniques. To date, the major players in the industry have been the biotechnology companies, but some pharmaceutical companies have realized the potential of the protein industry and have entered the market through licensing agreements and collaborations. Therapeutic proteins offer enormous potential and have already imp acted several therapeutic areas, namely cardiovascular, immunological, cancer, hematology, endocrine and viral infections. The market for therapeutic proteins is expected to reach maturity. As patents of existing proteins expire, there will be an increase in competition from generic companies which will lead to lower prices of proteins and hence decrease the growth of the market. The future of the therapeutic protein industry will depend on the success of functional genomics for identification and validation of new therapeutic target proteins. Widespread use of recombinant DNA as a manufacturing technique has been the key driver behind the growth in the global therapeutic protein market to date. Future growth of this industry will be depend on the success of new manufacturing techniques such as trangenics and gene activation therapy. companies 제약산업중 치료단백질분야는 DNA 재조합 제조기술에 대한 지식이 늘면서, 1975년 시작된 이래 급격히 성장했다. 현재까지는 바이오테크놀로지 회사등이 주를 이루었으며, 몇몇 제약회사들이 단백질 시장의 잠재성을 인식하고 라이센싱 계약과 제휴를 통해 시장진입을 했다. 치료용 단백질은 잠재력이 막대하며 cardiovascular, immunological, cancer, hematology , endocrine 및 viral infections등의 분야에 이미 영향을 미쳤다. 치료용 단백질 시장은 이미 성숙되었으며. 기존 단백질들의 특허가 만료됨에 따라 기존회사들의 경쟁이 심화되며 단백질 가격의 하락과 시장의 성장률을 저하하는 추세에 있다. 치료용 단백질 시장의 미래는 게놈연구로부터 단백질 의약품 신약 target을 지속적으로 발굴해 나감에 달려있다. 제조기술로서 재조합 DNA의 다양한 용도는 지금까지 세계치료 단백질 시장의 성장의 주요견인역할을 했고 미래 성장률은 transgenics 또는 gene activation therapy 등의 신 제조기술의 성공에 달려있다.

실크 단백질을 이용한 폐암 치료를 위한 약물전달시스템 개발

조혜연 연세대학교 대학원 2023 국내석사

폐암은 전 세계적으로 남녀 모두에게 흔하게 나타나며 발병률과 사망률이 매우 높은 질병이다. 폐암을 치료하기 위한 가장 효과적인 방법인 절제술은 초기 환자에게만 적용이 가능하고, 방사선 요법은 수술이 불가능한 환자들에게 적용이 가능하지만 주변 세포에 손상을 주어 폐 기능을 저하시킨다. 화학항암제를 이용하는 항암 화학 요법은 정확성이 부족하고 정상세포에도 작용하여 정상조직의 손상을 유발한다는 한계가 있다. 따라서 화학항암제의 문제점을 줄이기 위한 약물전달시스템을 통한 약물 전달이 필요하다. 약물전달시스템은 약물의 초반 급속 방출과 부작용을 줄이고 치료 결과를 개선하기 위해 개발되었다. 약물전달체의 크기, 형태, 재료, 표면 전하와 같은 매개변수를 조절함으로써 폐암 치료에 효과적인 약물전달체를 설계할 수 있다. 본 연구에서는 균일한 크기와 모양, 높은 약물 적재량을 가능하게 하는 탑다운(Top-Down) 방식을 사용하여 직경 3 ㎛의 원반형 입자를 설계하였다. 이 크기와 모양은 정맥 주사 후 2시간 이내에 입자를 폐에 집중적으로 축적시킬 수 있다. 재료로 사용한 실크 단백질(SP)은 실크 피브로인(SF)과 실크 세리신(SS)으로 구성되어 있다. 실크 피브로인은 기계적 특성, 생체 적합성이 우수하며 제어 가능한 생분해성의 특징을 가지고 있다. 실크 세리신은 실크 피브로인을 감싸고 있으며 친수성 아미노산이 다량 함유되어 있고 암세포에 대한 항암 효과를 포함한다. 따라서, 효과적인 폐암 치료를 위한 약물전달시스템으로서 실크 피브로인으로 제작된 마이크로 입자(SF DPPs)와 실크 피브로인과 실크 세리신을 혼합하여 제작한 마이크로 입자(SSSF DPPs)를 제안한다. SF DPPs와 SSSF DPPs는 약 30%의 약물을 적재할 수 있고 충분한 양의 항암제를 폐로 집중적으로 전달할 수 있으며, 적절한 약물 방출을 통해 우수한 치료 효과를 나타낸다. 이러한 효과를 검증하기 위해 화학항암제 도세탁셀(Docetaxel, DTX)을 SF DPPs와 SSSF DPPs에 적재하여 DTX-SF DPPs와 DTX-SSSF DPPs를 제작하고 크기, 형태, 안정성, 약물 방출 및 세포독성을 비교 평가하였다. 이 연구는 약물 방출 속도를 조절하여 약물로 인해 유발되는 부작용을 감소시키고 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 이는 폐암 치료를 위한 약물전달시스템 개발에 대한 가능성을 제시할 것이다.

Phospholipase D1 promotes endocytosis by destabilizing hypoxia-inducible factor -1α

박미희 부산대학교 2012 국내박사

Hypoxia-inducible factor-1? (HIF-1?) is a master regulator that facilitates both oxygen delivery and adaptation to low oxygen by regulation of expression of genes, functioning glucose uptake and metabolism, angiogenesis, erythropoiesis, cell proliferation, and apoptosis. Recently, PLD has been reported to regulate HIF-1? at translation level; however, the other regulations of HIF-1? protein by PLD are not defined. This study shows that HIF-1?-mediated inhibition of endocytosis is reversed by PLD1 via Rab5/7 pathway and PLD1 promotes HIF-1? degradation via the proteasomal pathway. PLD1 and HIF-1? were associated in vivo and in vitro and PLD1 enhanced proline-hydroxylation of HIF-1? by recruitment of PHD2. In addition, PLD1 interacted with VHL and PLD1-mediated hydroxylation of HIF-1? promoted HIF-1? degradation via increasing interaction of HIF-1? and VHL. PLD1 can function as an adaptor protein to promote the degradation of HIF-1?. Moreover, this study showed that downregulation of HIF-1? by PLD1 is oxygen dependent. In conclusion, this study demonstrates that PLD1 is a new regulator of HIF-1? stability and promotes endocytosis via direct interaction with HIF-1?. Phospholipase D (PLD)는 인지질 중 포스파티딜콜린을 특이적으로 가수분해하여 콜린과 포스파티드산을 생성하는 효소로서, 현재 PLD1과 PLD2 2가지의 동위효소가 밝혀져 있다. PLD는 효소활성화를 매개로 세포의 생존, 성장, 소낭 이동, 세포골격 재조직화, 수용체 신호전달 및 암화과정 등 세포 생리현상에 중요한 역할을 한다. 최근 들어 PLD의 효소활성을 통해 이루어지는 기능들에 대한 연구뿐 만 아니라 다양한 단백질과의 결합을 통한 다양한 역할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그럼에도 불구하고 아직 결합단백질로서의 PLD의 역할규명에 관한 연구가 부족한 실정이다. 본 연구는 PLD1가 HIF-1α, VHL 그리고 PHD등 다양한 단백질과의 결합을 통해 EGF의 수용체인 EGFR의 내포작용을 촉진하는 기전을 규명하였다. PLD1은 PHD에 의해 매개되는 HIF-1α의 수산화를 촉진하며 또한 수산화된 HIF-1α와 HIF-1α의 분해단백질인 VHL과의 결합을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 PLD1은 VHL과도 결합하여 HIF-1α 단백질 분해를 촉진한다는 것을 확인하였다. HIF-1α와 결합하는 PLD1의 부위를 동정한 결과 PLD1-PH에 결합하는 것을 확인하였다. PLD1-PH는 HIF-1α의 단백질 발현을 억제하였고, 이러한 사실을 기반으로 암화과정에 PLD1-PH의 영향성을 알아보고자 HT29세포에 PLD1-PH를 지속적으로 발현케 하는 세포주를 만들어 암생성정도를 확인한 결과 PLD1-PH를 발현하는 경우 암의 생성이 억제되는 것을 알게되었다. 이는 PLD1-PH는 HIF-1α과 결합하여 HIF-1α의 단백질 안정성을 억제하고, 이를 통해 세포의 내포작용이 촉진됨으로서 암화과정 억제효과를 나타낸다는 것을 시사한다. 결론적으로 본 연구는 PLD1이 HIF-1α의 단백질안정성을 조절하는 새로운 조절인자로서 작용한다는 점과 HIF-1α의 결합부위인 PLD1-PH가 암형성의 강력한 억제자로 작용할 수 있다는 점을 제시하고 있다. 따라서 본 연구는 PLD의 새로운 기능에 대한 학문적 이해 증진과 더불어 항암치료의 새로운 표적 제시 및 접근방안에 중요한 정보를 제공하는 것으로 사료된다.

Study on expression of adipokines from LDL receptor(^(-/-)) mice by atherosclerosis drug : 동맥경화 치료제에 의한 동맥경화쥐의 지방유래단백질 발현 변화에 대한 연구

변재민 Handong Global University 2004 국내박사

지방 세포는 여러 종류의 지방 유래 단백질 (adipokeine) 을 생산하고 분비하는데 이 중에는 동맥경화 발달에서 중요한 역할을 하는 염증 반응 인자도 포함한다. 지방 세포의 감소는 많은 종류의 adipokine 의 발현 감소와 관련 있고, 이는 지방 세포의 감소를 증진하려는 접근이 비만과 관련된 전-염증반응성 질환 (pro-inflammatory milieu) 을 호전시키는데 유용하다는 연구가 있다. 본 연구에서는 동맥경화 치료제인 lovastatin과 fenofibrate가 동맥경화 쥐의 adipokine에 미치는 영향을 연구하기 위해서, 지질 대사와 관련이 있는 지단백질의 한 종류인 low density lipoprotein의 receptor가 유전공학적으로 제거된 마우스 (LDL-R(-/-) mice) 를 이용하여고지질식을 통하여 동맥경화를 유도한 후, lovastatin과 fenofibrate를 처리한 후의 결과를 고찰했다. 본 실험에서 LDL-R(-/-) mice에 일반 먹이를 먹인 그룹과 고지질식을 먹인 그룹, 고지질식이에 fenofibrate와 lovastatin을 처리한 그룹간에 몸무게와 지방 조직의 무게는 유의한 차이는 보이지 않았다. 이는 지방세포에서 특이적으로 발현하고, 지방세포 생성과 관련이 있는 PPAR-γ 가 그룹간에 차이가 없는 노던 블러팅 결과와 일치한다고 볼 수 있다. 또한, LDL-receptor(-/-) mice에 고지질식으로 인한 동맥경화 유발과 동맥경화 치료제에는 체중 조절이나 지방세포 발달 분화와는 직접적인 관계가 없음을 볼 수 있었다. 염증반응의 중요한 지표인 haptoglobin 의 mRNA 발현은 각 그룹간의 유의한 차이가 보이지 않았고, 이는 동맥경화와 관련된 혈관 내피 세포의 염증 반응에는 지방세포 유래의 haptoglobin이 중요한 역할을 하지 않는다고 것을 알 수 있는 것이다. Adiponectin의 발현은 lovastatin 처리 그룹에서 4배 증가를 보였다. 이는 HMG-coA inhibitor인 lovastatin이 생체 콜레스테롤 생합성 생성을 막아서 혈중 지질환경을 개선시키고, 이것이 adiponnectin 발현의 증가를 보인다고 고찰된다. 혈중 지질은 동맥경화 유발쥐에서 총 콜레스테롤과 중성 지방 수치가 증가했으며 fenofibrate 처리한 군은 이 수치가 괄목할 정도로 떨어졌지만, lovastatin 군에서는 변화가 있지 않았다. 결론적으로 fenofibrate는 PPAR-α 를 자극시킴으로 혈중 지질 개선을 시켜 동맥경화 치료의 효과가 있음을 알 수 있었고, lovastatin은 adiponectin 증가를 통한 염증반응과 대식세포의 활성 저하로 동맥경화 치료 효과가 있음을 본 연구의 결과가 보여주고 있다. Adiocytes produce and secrete a variety of biologically active molecules called adipokine including inflammatory factors, which are well known to play important roles in the atherosclerotic process. Reduction in fat mass, correlates with decrease in the serum levels of many of adipokines, implying that approaches designed to promote fat loss should be useful in attenuating the pro-inflammatory milieu associated with obesity. In order to study the effect of anti-atherosclerotic drugs, lovastatin and fenofibrate, on the adipokine secretion form the fat tissue of atherosclerosis mice, LDL receptor knock-out mice (LDL-R(-/-)) fed high fat diet were used for this study. Total cholesterol (TC) and triacylglicerids (TG) levels were significantly increased in high fat-induced atherosclerosis mice. Herein, it was clarified that the level of Haptoglobin (Hp) expression was little among groups. Although Hp is an important marker of inflammation, it is difficult to conclude Hp from white adipose tissue (WAT) is involved with the regulation of a pro-inflammation process. Peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPAR-γ) expressions were changed neither by high fat-diet induced atherosclerosis nor by drug treatment. This result showed that fenofibrate and lovastatin has no relation to imfalmmation and lipogenesis. Adiponectin mRNA expression level was similar in both high fat-induced atherosclerosis mice and fenofibrate treated high fat-induced atherosclerosis mice. However, the level of adiponectin mRNA expression from the fat of lovastatin treated mice was about 4 times more to than that of normal chow diet group. These data indicate that lovastatin up-regulates adiponectin expression and modulate anti-inflammatory processes. In conclusion, fenofibrate treatment reduces significantly concentrations of TC and TG in serum. Therefore fenofibrate improves atherosclerosis. Lovastatin increased the level of adiponectin mRNA expression in lovastatin treated atherosclerosis mice. This data shows adiponectin has an important role to improve atherosclerosis through modulation inflammation, macrophage inhibit, and endothelial function.

Structure, allosteric regulation, and reaction mechanism of glutamate dehydrogenase

윤혜영 Graduate School, Yonsei University 2002 국내박사

글루탐산 분해효소 (GDH)의 구조 및 분자적 특성을 알아 보기 위하여 다음과 같은 연구들을 수행하였다. 우선 조미료로 많이 이용되고 있으며 Chinese restaurant syndrome을 유발시키는 물질로 잘 알려져 있는 글루탐산나트륨 (MSG)이 뇌조직 내의 GDH에 미치는 영향을 조사하였다. 장기간 MSG 복용에 의한 뇌에 미치는 영향을 알아보기 위해, 1주된 albino 쥐에게 1년간 식수에 MSG를 첨가하여 먹인 그룹과 먹이지 않은 두 그룹으로 나뉘어 실험해 보았다. 쥐의 몸무게와 뇌의 무게, 총 DNA와 RNA양 그리고 단백질 양에는 두 그룹간의 유의한 차이를 보이지 않았으나 뇌의 생 추출물속의 글루탐산 농도를 비교한 결과, MSG를 먹인 그룹에서는 대조군에 비해 2배 정도 높게 나타났다. 또한, 글루탐산 분해효소(GDH)의 mRNA 양은 두 그룹간의 유의한 차이를 보이지 않았으나, western blot 검사를 실시한 결과 효소의 양은 MSG를 먹인 그룹이 현저해 감소한 것으로 보아, GDH 발현에 있어 후전사 조절에 영향을 미치거나 GDH의 분해율을 증가시키는 것으로 보여진다. 이 결과로, 장기간 MSG를 섭취하게 되면 쥐 뇌 속에 존재하는 GDH 활성을 감소시킴으로 글루탐산의 분해가 저하됨을 알 수 있었다. 다음으로, GDH의 구조적, 기능적 조절형태를 심도 있게 연구하기 위해 1557-base-pair의 인간 GDH 유전자를 합성하여 대장균주를 이용해 활성을 지닌 효소로 발현시켰다. 이렇게 발현된 효소는 사람과 소의 조직에서 추출한 효소와 여러 가지 생화학적 측면에서 유사한 양상을 보였다. 자리지정 돌연변이방법을 이용해 이 효소의 Lys130 위치를 다른 아미노산으로 바꾼 돌연체를 이용해 실험해 본 결과, Lys130 위치는 GDH의 기질이나 다른 조효소가 결합하는 곳이 아닌 촉매작용을 일으키는데 관여하는 중요한 곳임을 알게 되었다. 다음으로, 인간 GDH의 알로스테릭 활성제인 ADP와 조효소인 NAD^(+) 결합부위를 규명하기 위해, 각각 이에 해당되는 Tyr187과 Glu279부위에 대해 돌연변이를 일으켜 아미노산의 크기와 소수성, 곁가지의 이온화 정도에 따라 다양한 돌연체들을 만들어 실험해 보았다. GDH의 자연형은 ADP와 반응시키면 3배정도 활성도가 증가된 반면 ADP 결합부위의 각 돌연체 효소들(Tyr187 돌연체)의 활성은 유의한 차를 보이지 않았다. 정지상태의 역학치수를 구한 결과 Tyr187 돌연체 효소들은, 2-oxoglutarate와 NADH에 대한 K_(m) 값에는 유의한 차이를 보이지 않았으나 V_(max) 값에는 자연형에 비해 4배 정도 감소된 결과를 얻었다. Glu279 돌연체 효소들은 NAD^(+) 와 글루탐산에 대해 V_(max) 값은 22 ∼ 28배 정도 감소한 반면 K_(m) 값은 NAD^(+)에 대해서만 20 ∼ 25배 정도 감소하였다. ADP와 NAD^(+) 결합부위를 규명하기 위해 [α-^(32)P]8-azidoadenosine 5'-diphosphate (8N_(3)ADP)와 [^(32)P]nicotinamide 2-azidoadenosine dinucleotide (2N_(3)NAD^(+))를 이용하여 광흡착표지를 실시한 결과 GDH의 자연형에 대한 [α-^(32)P]8N_(3)ADP와 [^(32)P]2N_(3)NAD^(+)의 광흡착 포화도에 대한 K_(d) 값은 25μM과 55μM로 나타났다. 이때, 자연형의 경우에는 ADP와 NAD^(+)를 첨가하면 8N_(3)ADP와 2N_(3)NAD^(+)의 광흡착이 현저히 감소되었으나, Tyr187와 Glu279 돌연체들은 각각 8N_(3)ADP 및 2N_(3)NAD^(+)와 반응하지 않았다. 즉, 인간 GDH 유전자의 돌연변이와 광흡착표지법을 통해 GDH의 Tyr187과 Glu279 위치는 각각 ADP와 NAD^(+)의 염기가 결합하는 부위임을 증명할 수 있었다. 마지막으로, GDH 결핍으로 신경퇴행성 질환이 생긴 환자에게 부족한 GDH를 단백질 차원에서 보충하기위한 새로운 방법을 시도 하였다. 이를 위해서 인간 GDH 유전자에 인간 면역결핍 바이러스에 존재하는 TAT 단백질의 전이 부위를 융합 시켜 TAT-GDH 융합 단백질을 발현시켰다. 이렇게 얻어진 TAT-GDH 융합 단백질을 변성시켜 신경세포 배양액에 분주한 결과 신경세포 내로 잘 침투하였고, 일단 세포 내로 들어가게 되면 변성된 단백질이 다시 제 형태를 갖추게 되어 정상적인 효소 활성을 가지게 되었다. 즉, TAT 잔기를 GDH에 첨부하여도 GDH 활성에는 별 영향을 미치지 않으며, 세포내 독성도 나타내지 않음을 알게 되었다. 이러한 결과는 GDH 결핍으로 인해 야기된 여러 질환을 앓고있는 환자에게 GDH를 직접 전달할 수 있는 새로운 방법을 제시해 주고 있다고 사료된다. Glutamate in the form of its sodium salt (MSG; monosodium glutamate) is a widely used food additive and reported to be a cause of the Chinese restaurant syndrome. To investigate a long-term effect of MSG ingestion on the brain, one-week-old albino rats were kept for 1 year in equal groups with or without MSG in their drinking water. The concentrations of the glutamate in the brain crude extracts of the MSG treated group were 2-fold higher than those of the control group. There were no significant change in body weight, brain weight, and contents of protein, total RNA and DNA in the two groups of rats. The concentration of the enzyme on the western blot analysis was significantly decreased in the MSG treated group, whereas the level of GDH mRNA remained unchanged, suggesting a post-transcriptional control of the expression of GDH or an increased rate of degradation of enzyme protein. These results indicate that the prolonged MSG feeding reduces the activity of GDH and subsequently decreases the catabolism of glutamate in rat brain. To gain a deeper insight into the structural and regulatory basis of GDH, a 1557-base-pair gene that encodes human GDH has been synthesized and expressed in Escherichia coli as a soluble protein. The recombinant enzymes were indistinguishable in its biochemical properties from those isolated from human and bovine tissues. The results from the site-directed mutagenesis of Lys130 site indicate that Lys130 plays an important role in the catalysis of GDH and that Lys130 is an essential residue required for the catalysis of GDH but not for the substrate or coenzyme binding. To identify ADP (allosteric activator) and NAD^(+) (coenzyme) binding sites within human GDH, a series of cassette mutations at Tyr187 and Glu279 positions were constructed for ADP and NAD^(+) binding, respectively. The wild type GDH was activated up to 3-fold by ADP, whereas no significant activation by ADP was observed with the Tyr187 mutant GDH regardless of their size, hydrophobicity, and ionization of the side chains. Studies of the steady-state velocity of Tyr187 mutant enzymes revealed essentially unchanged apparent K_(m) values for 2-oxoglutarate and NADH, but an approximately 4-fold decrease in the respective apparent V_(max) values. The Glu279 mutant proteins showed a 22 ∼ 28-fold decrease in the respective apparent V_(max) values and 20 ∼ 25-fold increase in K_m values for NAD^(+) with essentially unchanged K_(m) values for glutamate. The identification of the ADP and NAD^(+) binding sites was further performed using photoaffinity labeling with [α-^(32)P]8-azidoadenosine 5'-diphosphate (8N_(3)ADP) and [^(32)P] nicotinamide 2-azidoadenosine dinucleotide (2N_(3)NAD^(+)). Saturation of photoinsertion with [α-^(32)P]8N_(30ADP and [^(32)P]2N_(3)NAD^(+) occurred apparent K_(d) values near 25 μM and 55 μM, respectively, for wild type GDH. The photoinsertions of 8N_(3)ADP and 2N_(3)NAD^(+) were significantly decreased by ADP and NAD^(+), respectively. Unlike wild type GDH, none of the mutant enzymes at Tyr187 or Glu279 was able to interact with 8N_(3)ADP and 2N_(3)NAD^(+), respectively. The results with cassette mutagenesis and photoaffinity labeling indicate that the Tyr187 and Glu279 are required for efficient base-binding of ADP and NAD^+ to GDH, respectively. In an effort to replenish the GDH activity in the patients with the GDH deficient neurodegenerative disorders, human GDH was transduced into PC12 cells by fusing with a gene fragment encoding the protein transduction domain of human immunodeficiency virus TAT protein to produce genetic in-frame TAT-GDH fusion protein. The TAT-GDH protein can enter PC12 cells efficiently when added exogenously in culture media. Once inside the cells, the transduced denatured TAT-GDH protein showed a full activity of GDH indicating that the TAT-GDH fusion protein was correctly refolded after delivery into cells and the activities of GDH in the TAT-GDH fusion protein was not affected by the addition of the TAT sequence. TAT-GDH showed no cytotoxicity as determined by the ability to inhibit protein synthesis. These results may suggest new possibilities for direct delivery of GDH into the patients with the GDH-deficient disorders.

Glycoproteomic analysis of therapeutic glycoproteins with sialylated N-glycan linkage isomersusing LC-MS/MS

박치수 중앙대학교 대학원 2025 국내박사

Development of human monoclonal antibody targeting protease activated receptor-1 (PAR-1)

형유림 국민대학교 일반대학원 2025 국내석사