공복혈당과 죽상경화증과의 인과성 연구 : two-sample mendelian randomization analysis

전수현 연세대학교 보건대학원 2021 국내석사

배경 및 목적 : 세계 4대 만성질환 중 하나로 지정된 당뇨병은 많은 합병증을 동반하는 위험한 질병으로 여겨지고 있다. 당뇨병 합병증의 직접적 원인으로 작용하는 죽상경화증은 세포가 지속적인 고혈당 상태에 노출되었을 때 발생이 촉진된다. 기존 관찰 연구에서 당뇨병을 가진 사람들은 그렇지 않은 사람들에 비해 약 2배~4배 정도 죽상경화증이 일어날 확률이 높았다. 하지만 당뇨병이 없는 정상인 집단에서 공복혈당이 죽상경화증에 미치는 영향 유무에 관해서는 상대적으로 논란이 많다. 그래서 이번 연구에서 두 가지 표본을 통한 멘델리언 무작위할당 분석 방법을 이용하여 정상인 집단에서 공복혈당과 죽상경화증과의 인과성 여부를 알아보고자 하였다. 대상 및 방법 : MR-Base 플랫폼을 이용하여 당뇨병이 없는 정상인 유럽인 58,074명으로부터 공복혈당 관련 유전자 도구 변수들을 추출하였고, 추출된 도구변수들을 이용하여 멘델리언 무작위할당 분석을 수행하였다. 공복혈당과 죽상경화증과의 인과성 여부를 좀 더 명확히 규명하기 위해, 동일한 MR 분석 방법으로 당뇨병과 죽상경화증과의 인과성 여부도 알아보았다. 주요 MR 분석 방법으로 역분산 추정법 (Inverse Variance Weighted, IVW)을 이용하였으며, MR-Egger Regression, Weighted Median, Weighted Mode 분석법으로도 알아보았다. 민감성 분석으로 Single SNP 분석법, Leave-one-out 분석법을 이용하였다. 또한 최신 멘델리언 분석 방법인 Radial MR을 수행하여, 유전자 도구 변수들 중 이상치를 가지는 유전자 도구 변수 유무를 살펴보았고, 이상치를 갖는 유전자 도구 변수를 제거한 후, Radial MR 결과를 확인해 보았다. 연구결과 : 역분산 추정법(IVW) 결과를 통해 당뇨병이 없는 유럽인 정상인 집단에서 공복혈당과 죽상경화증과의 유의한 연관성은 보이지 않았다(P>0.05). 공복혈당과 대동맥 죽상경화증과의 연관성 분석 결과는 OR=0.874, 95% CI 0.565-1.350, P=0.545 으로 음의 관련성을 보였고, 공복혈당과 말초 죽상경화증과의 연관성 결과는 OR=0.771, 95% CI -0.940-1.524, P=0.455으로 음의 관련성을 보였다. Radial MR을 수행하였을 때, 공복혈당과 대동맥 죽상경화증과의 관련성 연구에서 4개, 공복혈당과 말초 죽상경화증과의 관련성 연구에서 3개의 이상치를 갖는 유전자 도구 변수들이 발견되어, 이들을 제거한 후 Radial IVW 값을 살펴보았다. 공복혈당과 대동맥 죽상경화증과의 Radial IVW 값이 β=-0.116, P=0.416, 공복혈당과 말초 죽상경화증과의 Radial IVW 값이 β=-0.314, P=0.294 로 모두 P>0.05로 나와 정상인 집단에서 공복혈당과 죽상경화증과는 유의하지 않은 연관성을 가짐을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 결론 : 당뇨병이 없는 정상인 유럽인들에게서 공복혈당과 죽상경화증은 유의한 인과적 관련성을 보이지 않았다. 이는 죽상경화증은 공복혈당 하나의 요소만이 아닌 식습관, 신체활동, 음주, 흡연 등으로 인한 후천적 요인들과 개인의 선천적 요인 등 다양한 요소들의 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다. Background and purpose: Diabetes, one of the main chronic diseases globally is well-known for its diverse complications like cardiovascular, blood vessel, renal, eye diseases. Continuous hyperglycemic status for a long time is regarded as the main cause of Atherosclerosis, the direct cause of Diabetes complications. The causal association between fasting blood glucose and atherosclerosis has been studied a lot and many researches proved that they have positive association in diabetic patients. However, fasting blood glucose influence on promoting atherosclerosis in non-diabetic individuals has been a controversy issue and is not verified clearly yet. Many researches have tried to investigate the relationship of the twos by biological and biomolecular method using animal experiments, but it was hard to find the researches on the effect of fasting blood glucose on atherosclerosis among non-diabetic population using genetic methods like one-sample or two-sample mendelian randomization method. So we determined to investigate the causal relationship between fasting blood glucose and atherosclerosis in non-diabetic individuals by using Two-Sample mendelian randomization analysis through MR-Base Platform. Methods: We used the latest and large scaled GWAS summary data in MR-Base GWAS repository to perform two-sample mendelian randomization. To clarify the influence of fasting blood glucose in non-diabetic individuals on atherosclerosis, we investigated the effect of diabetes (sustained hyperglycemia status) on atherosclerosis in advance through two-sample mendelian randomization analysis. We used an exposure GWAS data conducted by FinnGen Biobank and published in 2020 for Type 2 diabetes. Another exposure data was conducted by MAGIC consortium and published in 2012 for fasting blood glucose in non-diabetic individuals. Total 10 Genetic instruments were extracted for Type 2 diabetes from 95,030 individuals of European ancestry and total 22 genetic instruments for fasting blood glucose were extracted from 58,074 non-diabetic individuals of European ancestry. And to draw more general and objective conclusion, we determined to look for the influence of fasting blood glucose on atherosclerosis of different lesions. So we selected 2 GWAS data as outcome data, the one on Large Artery Atherosclerosis and the other one on Peripheral Atherosclerosis. GWAS Data for the trait Large Artery Atherosclerosis was conducted by MEGASTROKE consortium and was published in 2018. And GWAS Data for the trait Peripheral Atherosclerosis is from FinnGen Biobank and was published in June, 2020. All the participants for the outcome, atherosclerosis are individuals of European ancestry. We implemented Two-Sample Mendelian Randomization analysis by using MR-Base Platform and investigated the Inverse Variance Weighted, the most robust method and also other MR Analysis, MR-Egger regression, Weighted Median and Weighted Mode. And We conducted Sensitivity Analysis, Single SNP Analysis and Leave-one-out Analysis. And we performed the latest MR method, Radial MR to detect outlier genetic instruments and checked the MR results after removing outlier SNPs if the outlier genetic instruments existed in the study. Results: We found that there is no significant association between fasting blood glucose and atherosclerosis in non-diabetic individuals based on the IVW method. (IVW of Fasting Blood Glucose and Large Artery Atherosclerosis : OR=0.874, 95% CI 0.565-1.350, P=0.545. IVW of Fasting Blood Glucose and Peripheral Atherosclerosis : OR=0.771, 95% CI -0.940-1.524, P=0.455). When we performed Radial MR method, we found that there are 4 outlier SNPs for the trait of Large Arthery Atherosclerosis and 3 outlier SNPs for the trait Peripheral Atherosclerosis. We looked for the MR Results again after removing these outlier genetic instruments, we also found that there is no significant effect of fasting blood glucose on atherosclerosis, too. (Radial MR IVW of Fasting Blood Glucose and Large Artery Atherosclerosis : β=-0.116, P=0.416. Radial MR IVW of Fasting Blood Glucose and Peripheral Atherosclerosis : β=-0.314, P=0.294) Conclusion: We can make a conclusion that there is no significant influence of fasting blood glucose on atherosclerosis in non-diabetic individuals of European ancestry. This finding shows that atherosclerosis is affected by not only single factor of fasting blood glucose but also acquired factors like dietary habit, physical activity, smoking, alcohol habit and personal heredity factors. And it is considered that atherosclerosis is preventable enough when we are in normal status of glucose level.

비만 성인에서 대사증후군과 죽상경화증의 예측인자로서 초음파를 이용한 복부 내장지방두께의 유용성

김종섭 경북대학교 일반대학원 2007 국내박사

본 연구는 비만 성인에서 초음파를 이용한 내장지방두께가 대사증후군 관련인자를 포함한 죽상경화증 위험인자와 상관관계가 있는지 알아보고, 대사증후군 및 죽상경화증 유병의 예측인자로 유용한지 규명해 보고자 하였다. 경북대학교 병원 건강증진센터에 내원한 검사자중, 체질량지수 25 kg/m2 이상의 비만 성인 200명(남자 109명, 여자 91명)을 연구대상으로 하였다. 제대 바로 위에서 호흡이나 압박에 의한 왜곡 없이 복부 초음파를 시행하여 내장지방두께, 피하지방두께, 내장지방/피하지방두께비의 세 가지 지표를 얻었다. 또한 경동맥 초음파를 시행하여 경동맥 내중막두께를 측정하고 죽상경화판 동반여부를 관찰하였다. 동시에 총콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 공복 혈당, 혈압 및 체질량지수를 측정하였다. 복부 초음파로 측정한 세 가지 지표 중 내장지방두께가 남녀 모두에서 죽상경화증 위험인자와 가장 좋은 상관관계를 보였다. 내장지방두께는 남자에서 나이, 체질량지수, 수축기 및 이완기 혈압, 공복 혈당, 중성지방, HDL 콜레스테롤, 경동맥 내중막두께와 유의한 상관관계를 보였으며, 여자에서는 나이, 체질량지수, 수축기 혈압, 공복 혈당, 총콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중성지방, HDL 콜레스테롤, 경동맥 내중막두께와 유의한 상관관계를 보였다. 대사증후군 동반여부에 따른 내장지방두께는 대사증후군으로 진단된 군에서 그렇지 않은 군에 비해 내장지방두께가 남녀 모두에서 유의하게 높았으며, 다중 로지스틱 회귀분석에서 내장지방두께는 남녀 모두에서 대사증후군 유병에 관여하는 독립적 결정인자로 나타났다. 경동맥의 죽상경화증 동반여부에 따른 내장지방두께도 죽상경화증을 동반한 군에서 없었던 군에 비해 남녀 모두에서 유의하게 높았으며, 다중 로지스틱 회귀분석에서 내장지방두께는 남자에서 죽상경화증 유병에 관여하는 독립적 결정인자로 나타났다. 또한 대사증후군과 경동맥 죽상경화증의 예측을 위한 내장지방두께의 적절한 임계 수치는 남자 7.25cm, 여자 5.85cm 이었다. 결론적으로 비만 성인에서 초음파를 이용한 내장지방두께는 대사증후군 관련인자를 포함한 죽상경화증 위험인자와 유의한 상관관계를 보이고, 또한 대사증후군과 남자에서 죽상경화증 유병의 예측인자로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. This study was undertaken to investigate that visceral fat thickness using ultrasonography is correlated with atherosclerotic risk factors including components of metabolic syndrome, and can be used as a predictor for presence of metabolic syndrome and atherosclerosis in obese adults. Total 200 obese(BMI≥25 kg/㎡) subjects(109 men and 91 women) who visited the health promotion center in Kyungpook national university hospital were recruited to this study. An ultrasonographic evaluation of abdomen just above the umbilicus was conducted to obtain three ultrasonographic indexes of visceral fat thickness(VFT), subcutaneous fat thickness(SFT), visceral to subcutaneous fat thickness ratio(VSR) and the measurements were done without distortion by respiration and compression. Also, an ultrasonographic evaluation of carotid artery was conducted to evaluate intima-media thickness(IMT) and to determine the presence of atherosclerotic plaque. Concurrently serum total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceride, fasting serum glucose, blood pressure and body mass index(BMI) were measured. Of the three ultrasonographic indexes, VFT was most closely correlated with atherosclerotic risk factors in men and women. In the male subjects, VFT was correlated with age, BMI, systolic and diastolic blood pressure, fasting serum glucose, triglyceride, HDL-cholesterol and carotid IMT. In the female subjects, VFT was correlated with age, BMI, systolic blood pressure, fasting serum glucose, total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, HDL-cholesterol and carotid IMT. VFT was significantly higher in the subjects with metabolic syndrome than in those without it in men and women. On multiple logistic regression analysis, VFT was an independent determinant for metabolic syndrome in men and women. VFT was also significantly higher in the male and female subjects with carotid atherosclerosis in those without it. On multiple logistic regression analysis, VFT was an independent determinant for carotid atherosclerosis in men. In addition, VFT of 7.25 cm and 5.85 cm in men and women, respectively, was established as cutoff value for predicting the presence of metabolic syndrome and carotid atherosclerosis. In conclusion, VFT using ultrasonography is significantly correlated with atherosclerotic risk factors including components of metabolic syndrome in obese adults. Also, VFT using ultrasonography can be used as a predictor for presence of metabolic syndrome in obese adults and atherosclerosis in obese male adults.

Newer biomarker-based prediction of atherosclerosis risk

이혁희 Graduate School, Yonsei University 2024 국내박사

서론: 안지오포이에틴-1은 혈관내피세포의 Tie-2 수용체와 결합하여 혈관의 안정성과 항상성을 증대하며, 안지오포이에틴-2는 위 작용을 억제한다. 이러한 분자생물학적 기전 상 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-1 및 수용성 Tie-2는 죽상경화증 예측 바이오마커로 활용될 잠재력이 있다. 우리는 본 연구에서 (1) 안지오포이에틴 연관 바이오마커(안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-1 및 수용성 Tie-2) 연구를 위한 코호트를 구축하고, (2) 해당 바이오마커들의 기본 특성을 파악하며, (3) 해당 바이오마커들이 죽상경화증 위험도 예측에 도움이 될 수 있는지 확인하고, (4) 해당 바이오마커들을 활용한 죽상경화증 위험도 예측모형을 개발하고자 하였다. 연구방법: 2021년부터 2023년 사이 CMERC 및 CMERC-HI 코호트로부터 총 924명의 대상자가 모집되었으며, 검진을 통해 대상자들의 전통적 심혈관 위험인자(나이, 성별, 현재흡연, 수축기혈압, 혈압강하제 복용, 당뇨병, 총콜레스테롤, 고밀도지단백콜레스테롤 및 지질강하제 복용), 혈중 안지오포이에틴 연관 바이오마커 농도 및 관상동맥 석회화지수 등의 정보를 수집하였다. 죽상경화증은 중증 관상동맥 죽상경화증(관상동맥 석회화지수 >400)과 관상동맥 죽상경화증(관상동맥 석회화지수 >0)의 두 가지 지표로 정의되었다. 죽상경화증 예측 로지스틱 회귀모형의 성능은 C-지수, 호스머-레메쇼 카이제곱 통계치 및 일치도 그림 등의 방법으로 평가하였으며, 안지오포이에틴 연관 바이오마커에 의한 예측능 향상은 ΔC-지수, 연속형 순재분류향상 및 통합식별향상 등으로 평가하였다. 최종 개발된 죽상경화증 위험도 예측모형에 대해서는 내적 검증 및 홀드아웃 검증을 시행하였다. 연구결과: 총 924명의 대상자(나이 중위수, 62세; 60.5% 여성) 중 중증 관상동맥 죽상경화증은 60명(6.5%), 관상동맥 죽상경화증은 390명(42.2%) 에서 존재하였다. 안지오포이에틴 연관 바이오마커들은 서로 미약한 상관관계를 보였으며, 전통적 심혈관 위험인자와는 유의한 연관성을 보이지 않았다. 해당 바이오마커들은 전통적 심혈관 위험인자 기반 회귀모형의 중증 관상동맥 죽상경화증 위험도 예측력(ΔC-지수, 0.019-0.030; 연속형 순재분류향상, 0.46-0.53; 통합식별향상, 0.037-0.061)과 관상동맥 죽상경화증 위험도 예측력(ΔC-지수, 0.007-0.014; 연속형 순재분류향상, 0.18-0.20; 통합식별향상, 0.011-0.023)을 모두 향상시켰다. 최종 개발된 안지오포이에틴 기반 죽상경화증 위험도 예측모형은 내적 검증에서 우수한 식별력을 보였으며(C-지수 0.793-0.849), 홀드아웃 검증에서도 준수한 식별력을 보였다(C-지수 0.678-0.791). 일치도 그림 상 모형의 예측 위험도는 실제 위험도와 전반적으로 잘 일치하였다. 간편한 임상 적용을 위해 추가로 개발한 죽상경화증 위험도 점수 역시 좋은 식별력을 보였다(C-지수 0.790-0.837). 결론: 안지오포이에틴 연관 바이오마커들은 전통적 심혈관 위험인자 기반 회귀모형의 죽상경화증 위험도 예측력을 유의하게 향상시켰으며, 최종 개발된 안지오포이에틴 기반 죽상경화증 위험도 예측모형은 검증 결과 우수한 성능을 보였다. 본 연구에서 개발한 예측모형은 심혈관질환 일차예방을 위한 고위험 인구 선별 및 관상동맥 석회화지수 0인 대상자의 위험도 감시에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 안지오포이에틴 연관 바이오마커들이 임상 심혈관질환 사건 예측에도 활용될 수 있을지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다. Background: Angiopoietin-1 and its receptor, tunica interna endothelial cell kinase 2 (Tie-2), maintain endothelial integrity and homeostasis, while Angiopoietin-2 counteracts these effects. Given their biological actions, Angiopoietin-2, Angiopoietin-1, and soluble Tie-2 may have the potential to serve as predictive biomarkers for subclinical atherosclerosis. In this prospective ancillary study of the Cardiovascular and Metabolic Diseases Etiology Research Center (CMERC) and CMERC High-Risk (CMERC-HI) cohorts, we aimed to (1) construct a biomarker subcohort for the exploration of Angiopoietin-related biomarkers (i.e., Angiopoietin-2, Angiopoietin-1, and soluble Tie-2); (2) delineate the baseline characteristics of these biomarkers; (3) examine whether these biomarkers improve risk prediction for subclinical atherosclerosis beyond traditional risk factors; and (4) develop and validate subclinical atherosclerosis risk prediction models using these biomarkers. Methods: We enrolled a total of 924 participants from the CMERC and CMERC-HI cohorts between 2021 and 2023. Data on traditional risk factors, including age, sex, current smoking, systolic blood pressure, blood pressure-lowering drug use, diabetes, total and high-density lipoprotein cholesterol levels, and lipid-lowering drug use, were collected at baseline. Serum levels of Angiopoietin-related biomarkers were measured using enzyme-linked immunosorbent assay from the blood samples collected at baseline. The coronary artery calcium (CAC) was measured by cardiac computed tomography; the CAC score was calculated using the Agatston method. The primary measures of subclinical atherosclerosis were severe coronary atherosclerosis (defined as a CAC score >400) and coronary atherosclerosis (defined as a CAC score >0). The predictive performance of the models was evaluated using the Harrell’s C-index, Hosmer-Lemeshow chi-square statistic, and calibration plot. The additive utility of Angiopoietin-related biomarkers beyond traditional risk factors was assessed using the ΔC-index, continuous net reclassification improvement (cNRI), and integrated discrimination improvement (IDI). We developed subclinical atherosclerosis risk prediction models incorporating Angiopoietin-related biomarkers (Angiopoietin-based prediction models) and performed internal and holdout validation. Results: Of the 924 participants (median age, 62 years; 60.5% female), severe coronary atherosclerosis (CAC score >400) and coronary atherosclerosis (CAC score >0) were present in 60 (6.5%) and 390 (42.2%) participants, respectively. Angiopoietin-related biomarkers showed a poor correlation with each other and weak or no association with traditional risk factors. Angiopoietin-related biomarkers significantly improved risk discrimination and stratification for both severe coronary atherosclerosis (ΔC-index, 0.019-0.030; cNRI, 0.46-0.53; IDI, 0.037-0.061) and coronary atherosclerosis (ΔC-index, 0.007-0.014; cNRI, 0.18-0.20; IDI, 0.011-0.023) when added to traditional risk factor-based models. The Angiopoietin-based prediction models showed good discrimination in internal validation (optimism-corrected C-index, 0.793-0.849) and decent discrimination in holdout validation (C-index, 0.678-0.791). The predicted probabilities were in good agreement with the observed probabilities. Integer risk scores for subclinical atherosclerosis were also developed and showed satisfactory performance (C-index, 0.790-0.837). Conclusion: Angiopoietin-related biomarkers significantly improved risk prediction for subclinical atherosclerosis when added to traditional risk factor-based models. Angiopoietin-based prediction models, as well as integer risk scores, showed good predictive performance. The newly developed prediction models are expected to be utilized for identifying high-risk populations for the primary prevention of cardiovascular disease (CVD) and for surveilling individuals with a CAC score of 0. Whether Angiopoietin-related biomarkers improve risk prediction for clinical CVD events needs to be determined in future studies.

Protective Effects of the Aqueous Extract of Portulaca oleracea on Diabetes and Atherosclerosis : 마치현 물추출물이 당뇨병과 죽상경화증의 억제에 미치는 효능

이안숙 원광대학교 한의학전문대학원 2009 국내박사

죽상경화증은 동맥에 서서히 진행되는 염증성 병변으로 심혈관 질환의 주 원인이다. 국내에서도 서구화되면서, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증과 같은 질환이 증가되고 이로 인해 심혈관 질환에 의한 사망률이 증가되고 있어 죽상경화증의 병리기전과 치료에 대한 연구는 매우 중요한 의미가 있다. 당뇨병은 유전적, 환경적, 대사적 요인에 의해 췌장의 β-세포에서 인슐린 분비감소 또는 말초조직의 인슐린 저항에 의한 고혈당이 나타난다. 또한 고혈압, 이상지질혈증 등의 대사 이상이 동반되며 이로 인해 혈관의 정상적 기능이 손상되고 죽상경화증이 쉽게 올 수 있다. 당뇨병성 합병증으로 전신혈관으로 동맥경화에 의한 이상을 초래하고 심장과 신장을 망가뜨려 결국 협심증, 심근경색증과 같은 심혈관질환이나 신부전을 일으키게 된다. 마치현(Portulaca oleracea L.)은 예전부터 전세계적으로 민간에서 약재로 활용되어 왔으며, 방부제, 항염증제제, 진경제, 구충제, 살균제, 피부진정제, 해독제로 사용되었고, 그 외 근육이완활성과 항암효과, 항산화 효과에 대한 연구도 보고되고 있다. 본 연구에서는 마치현의 국내외 문헌에 기재된 효능을 바탕으로 민간에서 당뇨병에 널리 사용하고 있는 점에 착안하여, 당뇨병과 당뇨병성 합병증을 일으키는 죽상경화증에 대한 마치현 물추출물의 약리적 효과를 세포와 병태동물모델을 통해 실험한 결과 유의성 있는 효과를 얻었기에 보고하는 바이다. CHAPTER I. 제2형 당뇨모델인 db/db mice에서 마치현 물 추출물의 항당뇨 효과 이 연구에서는 제 2형 당뇨모델인 db/db 마우스에서 마치현 물추출물 (AP)의 투여가 고혈당과 당뇨병성 혈관 합병증 및 당뇨병성 신증을 포함한 당뇨병의 발병 진행을 억제해 주는 효능을 알아보고자 하였다. 6주령의 C57BL/6J-db/db 수컷 마우스와 C57BL/6J (wild type) 수컷 마우스를 2주동안 적응시킨 후 평균 혈당이 같도록 각 군을 배정하였고, 군의 분리는 정상군(wild type 마우스+물 투여), 당뇨대조군(db/db 마우스+물 투여), 양성대조군(db/db 마우스 + Rosiglitazone 투여) 및 실험군(db/db 마우스+마치현 물추출물 투여)으로 나누었다. 모든 군에서 10주간 standard AIN-76 diet를 하였고, 실험군에 마치현 물추출물을 300 mg/kg/day의 농도로 투여하고, 양성대조군에는 PPAR-γ 길항제로서 항 당뇨병약으로 쓰이고 있는 Rosiglitazone을 10 mg/kg/day의 용량으로 각군 모두 10주 동안 구강 투여하였다. 실험기간동안 정상군에 비해 당뇨대조군에서 혈압, 혈당, 혈장 내 LDL 콜레스테롤, 중성 지질 및 크레아티닌 농도가 현저하게 증가된 것을 관찰 할 수 있었다. 그러나, 마치현을 투여함으로써 유의성있는 감소효과를 나타내었다. 또한, 당뇨대조군에서 현저하게 감소한 혈장 내 HDL-콜레스테롤, 인슐린 및 알부민의 농도가 마치현 투여에 의하여 유의성있게 증가하였다. 18주령의 당뇨대조군으로부터 분리한 흉부 대동맥에서 acetylcholine에 대한 혈관이완 효과는 정상군에 비해 현저하게 감소하였으나, 마치현 투여에 의해 현저하게 개선되었다. 그리고, Sodium nitropruside에 대한 혈관이완 효과 또한 마치현 투여에 의하여 유의성있게 개선되었다. 최근 세포접착분자의 발현이 혈관합병증의 발견의 시작이 되며 죽상경화증의 발전에도 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이러한 혈관염증에 관여하는 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 과 같은 부착 인자와 콜라겐 분해 효소인 MMP-2의 발현이 당뇨대조군의 대동맥에서 현저하게 증가하였다가 마치현을 투여한 결과, 유의성있게 감소하였다. 또한 조직면역염색법을 이용하여 혈관조직에서의 혈관 수축 인자인 ET-1의 발현을 측정한 결과, 당뇨대조군에서의 발현이 현저하게 증가하였고, 마치현의 투여로 인해 유의성있게 감소하였다. 췌장에서 인슐린과 글루카곤의 발현을 측정하고자 면역형광염색법을 이용하여 관찰한 결과, 정상군에 비하여 당뇨대조군에서 β-cell의 파괴로 인하여 인슐린의 발현이 현저히 감소하였고, 마치현 투여군에서 유의성있게 회복되었다. 이와 반대로, 글루카곤의 발현량은 정상군에 비하여 당뇨대조군에서 현저하게 증가하였고, 마치현 투여군에서 유의성있게 감소하였다. 본 연구는 또한 마치현 물추출물이 당뇨병성 신증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 신장기능과 신장내의 단백발현의 변화를 분석한 결과, 10주간의 실험기간 중 당뇨대조군에서 섭취한 물양과 요량이 크게 증가하였다가, 마치현 투여에 의하여 현저하게 감소하였다. 이와 반대로, 요중 삼투질 농도는 당뇨대조군에서 현저한 감소를 보였고, 마치현 투여로 인해 유의성있는 증가를 보였다. 뿐만 아니라, 마치현의 투여는 신장의 기능개선을 의미하는 크레아티닌 청소율의 수치를 유의성있게 감소시켜 주었다. 당뇨병성 신증의 발생 또는 진행에 관여하는 것으로 알려진 최종당화산물 (advanced glycation end products: AGEs)의 생성을 신장피질에서 면역염색법으로 분석한 결과, 당뇨대조군에서 정상군에 비하여 최종당화산물이 현저하게 증가하였으며, 마치현 투여군에서는 유의성 있게 감소하였다. 또한, 최종당화산물은 조직 섬유화를 일으키는 전환성장인자 (transforming growth factor : TGF)-β1 와 같은 여러 종류의 사이토카인을 과발현하여 합병증을 유발하는데, 신장피질에서 ELISA와 면역염색을 이용하여 TGF-β1의 발현을 측정한 결과, 당뇨대조군에서 정상군에 비하여 TGF-β1의 발현이 증가하였다가, 마치현 투여에 의하여 유의성있는 감소효과를 보여주었다. 그리고, 최근 논문에서 염증반응은 당뇨병성 신증의 병리기전에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 신장조직에서 western blot과 면역염색을 이용해 ICAM-1의 발현을 측정한 결과, 당뇨대조군에서 정상군에 비해 현저한 발현증가를 보여주었고, 마치현 투여군에서 유의성있는 감소효과를 보여주었다. 또한, 염증 매개 인자인 NF-kB p65의 활성은 당뇨대조군에서 현저하게 증가하였고 마치현을 투여함으로 인해 이를 유의성있게 감소시켰다. 이와 같은 결과로 볼 때 제 2형 당뇨병 동물 모델인 db/db 마우스에서 마치현은 혈당강하효과, 췌장의 인슐린 분비 촉진, 항염증작용, 혈관내피세포 기능개선, 신장 기능개선효과를 나타낼 뿐 아니라 이상지질혈증을 억제하여 당뇨병성 혈관합병증 및 당뇨병성 신증의 발생 또는 진행을 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이것은 마치현이 항당뇨작용을 지니는 것으로 사료된다. CHAPTER II. 혈관내피세포에서 마치현 물추출물의 혈관 염증 반응 억제효과 최근 죽상경화증과 같은 혈관질환으로 혈관에서의 염증반응에 대한 관심이 높아지고 있다. 혈관 내피세포에서의 염증기작에서 특이한 것은 유착분자인 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 등의 과발현이 관찰된다. 따라서 이러한 염증기작에 의한 혈관의 손상은 각종 동맥경화증이나 심부전과 같은 질환에 결정적 요인이 될 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 마치현 물추출물(AP)이 사람 혈관 내피세포(human umbilical vein endothelial cells)에서 종양 괴사 인자(TNF-α)로 인한 혈관염증반응에 미치는 효과를 연구하였다. 혈관내피세포에서 TNF-α 자극으로 인하여 유착분자인 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 의 발현이 증가하였으나 마치현 물추출물 처리에 의하여 유착분자들의 발현이 감소하였다. 단핵구와 혈관 내피세포의 부착에 미치는 마치현의 효과를 측정한 결과, TNF-α는 혈관 내피 세포를 활성화시켜서 HL-60 단핵구의 부착을 현저하게 증가시켰으나, 마치현 물추출물 처리 후 단핵구의 부착이 농도의존적으로 감소되었다. 또한 혈관내피세포에 TNF-α를 처리한 결과, proinflammatory cytokine 인 MCP-1, IL-8 mRNA 발현이 현저하게 증가하였으나, 마치현 물추출물에 의해 농도의존적으로 감소되었다. TNF-α 에 의해 VCAM-1 mRNA 발현 역시 현저한 증가를 보였고, 마치현 처리에 의해 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다. NF-kB 활성을 EMSA를 사용하여 분석한 결과 TNF-α 자극에 의하여 NF-kB 활성도가 증가하였다가, 마치현 물추출물의 처리에 의해 감소하는 경향을 보였다. 또한, 마치현 물추출물은 TNF-α에 의해 유도된 IkB-α의 인산화를 억제함으로써 NF-kB의 활성을 억제하였다. 면역형광염색을 이용하여 NF-kB p65의 핵으로의 이동을 관찰한 결과, 혈관내피세포를 TNF-α로 자극할 때 핵으로 이동되는 NF-kB p65의 양이 증가되었으나, 마치현 전처리 후 농도 의존적으로 NF-kB p65의 이동량이 감소하였다. 게다가 마치현 물추출물은 TNF-α로 인한 활성산소종의 생성을 농도의존적으로 유의성있게 감소시켰다. 본 연구결과에서, 마치현 물추출물은 NF-kB의 활성화를 억제하고, ROS의 생성을 감소시키며, 세포 유착 인자의 발현 억제 및 단핵구와 혈관 내피 세포 간의 유착 또한 억제함으로써 항혈관염증 작용을 나타내는 것으로 사료된다. CHAPTER III. Apolipoprotein E-Knockout 마우스에서 마치현 물추출물의 죽상경화증 억제 효과 본 연구에서는 죽상경화가 유발되는 전형적인 생체모델인 apolipoprotein E knockout mouse에서 마치현 물추출물(AP)이 죽상경화증의 발병을 억제시키는 효능을 보고자 하였다. 6주령의 C57BL/6J 유래 ApoE-/- 수컷 마우스와 C57BL/6J (wild type) 수컷 마우스를 2주동안 적응시킨 후 평균 체중이 같도록 각 군을 배정하였고, 군의 분리는 정상군(wild type 마우스+물 투여), 대조군(ApoE-/- 마우스+물 투여), 양성대조군(ApoE-/- 마우스+captopril 투여) 및 실험군(ApoE-/- 마우스+마치현 물추출물 투여)으로 나누었다. 모든 군에서 11주간 standard AIN-76 diet를 하였고, 실험군에 마치현 물추출물을 300 mg/kg/day의 농도로 투여하였고, 양성대조군에는 죽상경화증의 진행을 예방하는데 관여하는 ACE inhibitor인 captopril을 15 mg/kg/day의 용량으로 각군 모두 11주 동안 구강 투여하였다. 11주의 실험기간동안 대조군은 정상군에 비해, 현저한 혈압상승 및 혈당상승을 보였고, 마치현 투여에 의해 유의성있게 감소하였다. 또한 혈장 내 blood urea nitrogen (BUN), GOT, GPT, 총 콜레스테롤, 중성지질, LDL-콜레스테롤의 수치가 정상군에 비해 대조군에서 현저하게 증가하였다가, 마치현 투여로 인해 유의성있는 감소효과를 보였다. 그리고 혈장 내 albumin과 total protein 농도는 정상군에 비해 대조군에서 현저하게 감소하였다가 마치현 투여군에서 유의성있게 증가하였다. 19주령의 대조군으로부터 분리한 흉부 대동맥에서 acetylcholine에 대한 혈관이완 효과는 정상군에 비해 현저하게 감소하였으나, 마치현 투여에 의해 현저하게 개선되었다. 그리고, Sodium nitropruside에 대한 혈관이완 효과 또한 마치현 투여에 의하여 유의성있게 개선되었다. 또한, 면역염색을 이용하여 혈관조직에서 혈관수축 인자인 ET-1과 혈관염증 인자인 VCAM-1의 발현을 분석한 결과, 대조군에서 정상군에 비해 현저한 발현증가를 보이고, 마치현 투여군에서 유의성있는 발현감소를 보였다. 또, 혈관의 죽상경화병변에서 대식세포의 침윤을 확인하기 위하여 MOMA-2의 발현정도를 관찰한 결과, 대조군에서 발현이 크게 증가되었고, 마치현 투여군에서 현저하게 감소되었다. 산화스트레스의 표지자인 nitrotyrosine의 발현정도를 관찰한 결과, 정상군에 비해 대조군에서 현저히 증가하는 것을 보였고, 마치현 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 혈관의 죽상경화병변 내에서 지질을 관찰하기 위해 Oil Red O 염색을 시행한 결과, 대조군에서 강한 염색정도를 나타내었고 마치현 투여군에서 약한 염색정도를 보였다. 죽상경화병변을 조직학적으로 비교해 볼 때, 죽상반 형성의 빈도는 대조군에 비하여 약물투여군 모두에서 매우 낮은 경향을 볼 수 있었다. 따라서, Apolipoprotein E knockout 마우스에서 마치현은 혈관염증감소, 혈관내피세포 기능 개선, 산화스트레스에 의한 손상 개선 및 이상지질대사의 저해를 통한 죽상경화 병변의 진행을 억제하거나 지체시킴을 알 수 있었다. 결과적으로, 본 연구에서 마치현은 앞서 설명한 여러 기전으로 인하여 세포 내 혈관 염증 생성 과정을 억제하였으며, 병태동물모델에서 당뇨병과 죽상경화증 발병의 억제효과를 가지는 것으로 사료된다. CHAPTER Ⅰ Type 2 diabetes is associated with significantly accelerated rates of micro-and macrovascular complications such as atherosclerosis and diabetic nephropathy. In the present study, we investigated the protective effect of the aqueous extract of Portulaca oleracea (AP) on diabetes and diabetic complications in type 2 diabetic db/db mice. The mice were treated with AP (300 mg/kg/day, p.o.) for 10 weeks to examine the long-term effects on metabolic abnormalities and diabetic nephropathy as well as diabetic vascular complications. As a results, we found that AP treatment markedly lowered blood glucose, plasma triglyceride, plasma level of low density lipoprotein (LDL)-cholesterol, systolic blood pressure, and plasma creatinine in diabetic db/db mice. Furthermore, AP significantly increased plasma level of high density lipoprotein (HDL)-cholesterol, plasma insulin level, and urinary osmolality level. We also found that treatment with AP significantly decreased a marked increases of water intake, urine volume and creatinine clearance (Ccr) in diabetic db/db mice. Moreover, the insulin immunoreactivity of the pancreatic islets remarkably increased in AP treated db/db mice compared with untreated db/db mice. In contrast, glucagon immunoreactivity of the pancreatic islets markedly decreased in AP treated db/db mice compared with untreated db/db mice. The impairment of acetylcholine (ACh)- and sodium nitroprusside (SNP)-induced vascular relaxation of aortic rings were ameliorated by AP treatment in diabetic db/db mice. This study also showed that overexpressions of vascular cellular adhesion molecule (VCAM)-1, intercellular cell adhesion molecule (ICAM)-1, E-selectin, matrix metalloproteinase (MMP)-2 and endothelin (ET)-1 were observed in aortic tissues of untreated db/db mice, which were significantly suppressed by treatment with AP. In immunohistological study, the renal expressions of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), advanced glycation end products (AGE), and intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 markedly increased in the renal cortex of untreated db/db mice. In contrast, AP treatment significantly reduced these expression in db/db mice. Furthermore, activity and expression of NF-κB p65 in renal tissues remarkably increased in untreated db/db mice, which were significantly attenuated by AP treatment. Taken together, AP suppressed hyperglycemia and diabetic vascular inflammation, and prevented the development of diabetic nephropathy in db/db mice. In conclusion, this study demonstrated that AP prevent a development of diabetes and its complications. CHAPTER Ⅱ Vascular inflammation plays a key role in the pathogenesis and progression of atherosclerosis, a main complication of diabetes. The present study investigated whether an aqueous extract of Portulaca oleracea (AP) prevents TNF-α-induced vascular inflammatory process in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)s. Our results showed that stimulation of TNF-α leads to over-expression of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1, intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 and E-selectin. However, AP significantly suppressed TNF-α-induced over-expression of these adhesion molecules in a dose-dependent manner. In addition, pretreatment with AP dose-dependently reduced an increase of the adhesion of HL-60 cells to TNF-α-induced HUVECs. Furthermore, we observed that stimulation of TNF-α significantly increased the intracellular reactive oxygen species (ROS) production in HUVECs. However, pretreatment with AP markedly blocked TNF-α-induced ROS production in a dose-dependent manner. The western blot and immunofluorescence analysis represented that AP inhibits the translocation of the NF-kB p65 to the nucleus. In addition, AP suppressed the TNF-α-induced degradation of IkBa and attenuated the TNF-α-induced NF-kB-DNA binding in HUVECs. AP also effectively reduced TNF-α-induced the mRNA expressions of monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 and interleukin (IL)-8 in a dose-dependent manner. Taken together, AP prevents vascular inflammatory process through the inhibition of intracellular ROS production and NF-kB activation as well as reduction of adhesion molecule expression in TNF-α-induced HUVECs. These results suggested that AP might have a potential therapeutic effect by inhibiting vascular inflammation process on vascular diseases such as atherosclerosis. CHAPTER Ⅲ The purpose of the present study was to investigate the antiatherosclerotic efficacy of AP in an animal model that more closely represents the human atherosclerotic condition, the apolipoprotein Edeficient (ApoE^(-/-)) mice. Male homozygous apoE-deficient mice and corresponding wild-type mice (C57BL/6J mice), 6 weeks of age, were fed a normal chow diet for 13 weeks. After a 2 week adaptation period, apoE-deficient mice were divided into three (control, AP-treated and captopril-treated) groups. Mice consumed water alone, captopril (10 mg/kg/day), or an aqueous extract of AP (300 mg/kg/day) in drinking water for 11 weeks. The acetylcholine (ACh)- and sodium nitroprusside (SNP)-induced vascular relaxation of aortic rings significantly attenuated in the untreated ApoE^(-/-) mice. However, an impaired vasorelaxation was markedly recovered by treatment with AP. In addition, the levels of systolic blood pressure and blood glucose were significantly decreased by treatment with AP. The biochemical analysis indicated that administration of AP significantly reduced levels of total cholesterol, low density lipoprotein (LDL)- cholesterol, and blood urea nitrogen. Furthermore, the expressions of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), endothelin-1 (ET-1), monocyte macrophage marker-2 (MOMA-2), and nitrotyrosine in the aorta were measured by immunohistochemistry and western blot analysis. Immunohistochemical analysis showed significant reduction of VCAM-1 and ET-1 expression in the aortic endothelial layer by AP treatment. Similarly, AP inhibited nitrotyrosine expression in the atherosclerotic plaque area. Moreover, there was significantly attenuated accumulation of macrophages by reduction of MOMA-2 expression. Analysis using Oil red O staining revealed that AP markedly reduced the aortic lipid deposition. Histological examination also represented a significant increase in the size of atherosclerotic plaque in the aorta from untreated ApoE^(-/-) mice. In contrast, treatment with AP remarkably reduced the size of atherosclerotic plaque in the aortic intima. In this study, we observed that treatment with AP regressed the atherosclerotic lesions by inhibiting aortic lipid accumulation, vascular oxidative stress and vascular inflammation. In conclusion, inhibition of the atherosclerotic lesion and lipid deposition in the aorta by treatment with AP was correlated with its inhibitory actions on vascular oxidative stress, vascular inflammatory response, dyslipidemia and the production of adhesive molecules. Therefore, these results suggest that AP not only inhibits atherosclerotic lesion formation, but also regresses atherosclerosis.

제2형 당뇨병 환자에서 경동맥 내중막 두께에 미치는 죽상경화증 위험인자의 분석 및 항혈소판제 치료 효과

정상수 연세대학교 대학원 2002 국내석사

연구배경: 고해상도 B-mode 초음파를 이용하여 경동맥 내중막 두께와 죽상경화반을 측정하여 죽상경화증의 여러 가지 위험요인과의 연관성을 규명하고 치료시 경동맥 내중막 두께와 죽상경화반의 변화를 분석하여 대혈관 합병증을 유발하는 죽상경화증을 조기에 진단하고 치료하는데 기여하고자 한다. 방법: 경동맥 초음파를 시행한 535명의 한국인 제2형 당뇨병 환자를 대상으로 하여 내중막 두께와 죽상경화반를 측정 하였고, 동맥경화증과 관련된 위험인자와 치료 1년 후의 변화를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 결과: 1) 대상 환자의 평균 연령은 60.31±0.3세이고, 남자는 233명 여자는 302명 이었으며, 내중막 두께는 0.83±0.24mm, 평균 죽상경화반의 수는 0.74±1.40개 이였다. 2) 내중막 두께는 연령, 체질량 지수, 당뇨병 유병기간, 흡연기간, 수축기 혈압, C-peptide, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤과 유의한 상관관계를 보였으며, 죽상경화반은 연령, 당뇨병 유병기간, 당화 혈색소, 수축기 혈압, HDL-콜레스테롤, 섬유소원과 유의한 상관관계를 보였다. 3) 다중회귀분석에서 내중막 두께를 결정하는 독립적인 위험인자는 연령, 체질량 지수, 수축기 혈압, 성별, 고밀도 콜레스테롤이며, 죽상경화반을 결정하는 독립된 위험인자는 당뇨병의 유병기간, 연령, 섬유소원 임을 알 수 있었다. 4) 60세 이상 고 연령 군이 60세 이하의 연령 군보다 내중막 두께가 의미 있게 두꺼운 것으로 나타났고, 남자가 여자 보다 의미 있게 두꺼운 것으로 나타났다. 죽상경화반은 60세 이상의 고 연령군이 60세 이하의 연령 군보다 더 많은 것으로 나타났고, 남자가 여자보다 더 많은 것으로 나타났다. 5) 당뇨병 환자의 경동맥 내중막 두께와 죽상경화반은 추적 관찰에서 고혈압과 고지혈증의 동반 유무에 관계없이 변화를 보이지 않았다. 6) 항혈소판제의 12개월 간의 사용으로 내중막 두께가 의미 있게 감소 되었다(1.07±0.29 vs. 0.96±0.28mm, p=0.01). 결론: 제2형 당뇨병 환자에서 경동맥 내중막 두께는 죽상경화증의 위험인자로 알려진 연령, 당뇨병 유병기간, 체질량 지수, 흡연기간, 수축기 혈압, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤과 유의한 상관관계를 보였고, 죽상경화반은 죽상경화증의 위험 인자인 연령, 당뇨병 유병기간, 수축기 혈압, HDL-콜레스테롤, 섬유소원과 유의한 상관관계를 보여 죽상경화증의 조기 진단에 사용될 수 있음을 보여 준다. 또한 항혈소판제의 사용은 죽상경화증의 위험인자와 관련 있다고 밝혀진 두꺼워진 내중막 두께를 감소 시키므로 죽상경화증의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다. Background: Measurement of ultrasonographic carotid intima-media thickness(IMT) and plaque is a useful, noninvasive method to detect early atherosclerotic lesions. In this study we analyzed the association of mean IMT and plaque with cardiovascular risk factors in Korean type 2 diabetes mellitus and investigated change in mean IMT and plaque numbers with antiplatelete treatment for 12 months. Methods: A high-resolution B-mode carotid ultrasonographic examination was performed on in 535 Korean type 2 diabetes mellitus patients to measure mean IMT and plaque. Blood pressure, plasma glucose, HbA1c, c-peptide, total cholesterol, triglyceride, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol level were measured after fasting for 12 hours. Mean IMT and plaque numbers were checked at baseline and after 12 months. Result: Mean IMT was 0.83±0.24mm and plaque numbers were 0.74±1.40. Mean IMT was positively correlate with age, duration of DM, pack years of smoking, sex, and LDL-cholesterol. The number of plaques positively correlates with age, duration of DM, pack years of smoking, sex, and fibrinogen. After antiplatelete treatment for 12 months, mean IMT at baseline and 12 months was 1.07±0.29 vs. 0.96±0.28mm(p = 0.01), but the number of plaques did not change. Conclusion: Mean IMT that was positively correlate with age, duration of DM, pack years of smoking, sex, and LDL-cholesterol that were associated with traditional atherosclerotic risk factors. Antiplatelete treatment can be used for decreasing mean IMT, suggesting that it may be a useful for control of atherosclerosis.

제2형 당뇨병 환자에서 고밀도지단백콜레스테롤 농도와 조기 죽상경화증 및 인슐린 저항성과의 관계

김혜진 연세대학교 대학원 2002 국내석사

당뇨병 환자에서 죽상경화증은 당뇨병이 없는 경우보다 발생빈도가 2~4배 높고, 뇌졸중, 심근경색, 돌연사 등에 의한 사망의 주요한 원인이 되고 있다. 제2형 당뇨병은 비만, 고혈압, 이상지혈증 등 심혈관계 위험 인자들과 관련이 있다고 알려져 있으며, 인슐린 저항성이 그 근간을 이루는 것으로 제시되고 있다. 인슐린 저항성과 관련된 이상지혈증은 고중성지방혈증과 저농도의 고밀도지단백콜레스테롤(HDL cholesterol) 및 작고 조밀한 저밀도지단백(LDL)이 특징으로, 이상지혈증은 죽상경화증과 심혈관 질환을 증가시키는 주요 요인 중 하나로 생각된다. 이상지단백혈증 가운데에서도 고밀도지단백콜레스테롤에 대한 관심이 높아지고 있고, 여러 연구에서 고밀도지단백콜레스테롤이 죽상경화증과 심혈관 질환의 강력한 예측인자로 나타났다. 그러나 나이, 흡연, 혈압, 체질량지수, non-HDL cholesterol에 대해 교정 후, 고밀도지단백콜레스테롤과 심혈관 질환과의 유의한 상관관계가 없다고 보고된 경우도 있었으며, 나라나 민족에 따라 차이를 보이는 경우도 있었다. 국내에서도 최근 경동맥 내중막 두께와 동맥경화증 위험인자 사이의 관계가 연구되었으나 연구자마다 다양한 결과를 보고하고 있다. 고해상도 B-mode 초음파를 이용한 경동맥 내중막두께의 측정은 비침습적인 검사방법으로서 반복적인 시행이 용이하고 조기 죽상동맥경화의 추적 관찰에 유용하게 사용된다. 한편, 인슐린 저항성의 지표로서, 단시간 인슐린 내성 검사가 개발되어 인슐린 저항성에 대한 직접 평가법으로 인정받고 있다. 이에 본 연구에서는 우리나라 제2형 당뇨병 환자를 대상으로, 경동맥 내중막두께 측정과 단시간 인슐린 내성 검사를 이용하여, 이상지혈증, 특히 고밀도지단백콜레스테롤 농도와 조기 죽상경화증과의 관계 및 인슐린 저항성과의 관계를 알아보고자 하였다. 연세의대 세브란스병원 당뇨병센터에 내원한 30세 이상의 제2형 당뇨병 환자 1762명을 대상으로 하여 통계분석한 결과는 다음과 같다. 1. 경동맥 내중막 두께가 혈청 고밀도지단백콜레스테롤, 중성지방/고밀도 지단백콜레스테롤 비율, 총콜레스테롤/고밀도지단백콜레스테롤 비율과 유의한 상관관계를 보였으며, 다중회귀분석을 통하여 혈청 총콜레스테롤, 중성지방, 나이, 성별, 체질량지수, 당화혈색소, 수축기 및 이완기 혈압을 보정한 후에도 고밀도지단백콜레스테롤과 경동맥 내중막두께간에 독립적인 연관성을 보였다. 2. 지질대사치와 인슐린 저항성 지표인 Kitt와의 상관관계를 알아본 결과, 중성지방, 중성지방/고밀도지단백콜레스테롤 비가 Kitt 와 유의한 상관관계를 보였고, 혈청 고밀도지단백콜레스테롤치는 유의한 연관성이 없었으며, 다중회귀분석을 한 후 중성지방이 Kitt와 독립적인 연관성을 보였다. 이상의 결과로 고밀도지단백이 조기 죽상경화증에 중요한 영향을 미칠것으로 사료되며, 본 연구에서는 인슐린 저항성과 유의한 연관성을 보이지 않았으나, 향후 고밀도지단백콜레스테롤의 혈중 농도 개선이 죽상경화증 및 심혈관계 질환 예방 및 치료, 인슐린 저항성 변화 등에 미치는 효과에 대한 전향적인 연구가 필요할 것으로 생각한다. The occurrence of coronary heart disease and other manifestations of atherosclerotic vascular disease is substantially increased in diabetic patients. Type 2 DM is known to be associated with several adverse cardiovascular risk factors, including hypertension, obesity, hyperinsulinemia, albuminuria, and serum lipid and lipoprotein abnormalities, characterized mainly by elevated serum total triglycerides and decreased high-density lipoprotein(HDL) cholesterol and elevated small dense low-density lipoprotein(LDL) cholesterol. Dyslipidemia is believed to be a major source of this increased risk of atherosclerosis and cardiovascular disease. The independent, inverse relation between levels of HDL cholesterol and coronary heart disease has been reported in many epidemiologic studies. But, in several studies, the association of HDL cholesterol and coronary disease lost statistical significance after adjustment for age, smoking, blood pressure, body mass index, and levels of non-HDL cholesterol. In Korea, there have been several reports of different results. Measurement of carotid intima-media thickness(IMT) by high-resolution B-mode ultrasonography is useful, non-invasive method to detect early atherosclerotic vascular disease. Insulin resistance can be assessed by short insulin tolerance test, in which, the rate constant for plasma glucose disappearance(Kitt) is calculated. The purpose of this study was to investigate correlation of HDL cholesterol with early atherosclerosis and insulin resistance in type 2 diabetic patients by IMT and short insulin tolerance test. The study involved 1762 type 2 diabetic patients older than 30 years who visited severance hospital Yonsei University. Height, weight, waist, hip circurmference, blood pressure, glucose, HbA1c, lipid profiles were measured and IMT was checked by high resolution B-mode ultrasonography and short insulin tolerance test was performed. Followings are results. 1. Carotid IMT was significantly correlated with HDL cholesterol, triglyceride/HDL cholesterol ratio, total cholesterol/HDL cholesterol ratio. On multiple regression analyses with respect to mean IMT of carotid artery, only HDL cholesterol was independent variable associated with mean IMT. 2. Kitt was significantly correlated with triglyceride, triglyceride/HDL cholesterol ratio, but not with HDL cholesterol. Multiple regression analyses showed that triglyceride was independently associated with Kitt. The above results suggest that HDL cholesterol plays an important role in the early atherosclerosis. But in this study, there is no correlation between HDL cholesterol and insulin resistance. Future prospective studies including effects of improved HDL cholesterol on atherosclerosis and cardiovascular disease, insuln resistance will be necessary.

Single nucleotide polymorphism of human engothelial nitric oxide synthase gene among Korean patients with athe

김형석 전남대학교 2002 국내박사

Background and purpose: Atherosclerosis is a multifactorial disease. So far, polymorphic DNA sequence variations have been described as associated with atherosclerotic disease. Atherogenesis is a systemic process, but atherosclerotic disease tends to occur focally, typically in certain predisposed regions. Nitric oxide (NO) plays a key role in the aspect of vascular regulation of atherosclerosis. The endothelial nitric oxide synthase (eNOS) synthesized NO and is regulated by the eNOS gene. The aims of this study were to investigate whether the genetic variations of the eNOS gene are associated with atherosclerosis in Korean patients, and then to find whether or not these have a genetic susceptibility to make a distinction from the predisposed anatomical sites. Materials and methods; We studied to find the eNOS polymrphism using direct sequencing between exon 6 and 7 from 142 consecutive Korean patients with coronary atherosclerosis or atherothrombotic ischemic stroke and compared with 60 controls. Results; We identified the 3 genetic variations. All variations are single nucleotide polymorphisms including two previously reported polymorphisms (C774→T and G894→T) and one newly identified polymorphism (IVS6+240A→G). There were no consistent association between the eNOS polymorphisms and atherosclerosis except G894→T polymorphism. The frequencies of the G894→T polymorphism with a dominant effect on the eNOS gene was significantly higher in the coronary atherosclerosis group than in the control group, but it was not associated with disease severity or other clinical risk factors The genotype and allele frequency for G894→T polymorphism in the Korean population differ markedly from the Caucasian population. There was no significant difference in the genotype and allele frequency between the atherosclerotic ischemic stroke and the control group. Conclusions; The G894→T polymorphim on the eNOS gene associated with coronary atherosclerosis, but this polymorphism could play a small part of genetic risk factor to atherosclerosis in Korean. The polymorphisms of the eNOS may be less important genetic factors making a distinction between coronary and atherothrombotic ischemic stroke. 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism)은 DNA 염기서열의 개인적인 차이점 중에서 단일 염기의 차이를 일컫는 용어로써, 돌연변이와 달리 훨씬 풍부하면서 다양한 변이를 보이며, 인간 질병 발생연구에 다양하게 이용되고 있다. 그러나, 단일염기다형성은 민족적·인종적 차이가 크기 때문에, 한국인에 맞는 형태의 다형성을 파악하고, 구축하여야 한다. 본 연구에서는 복잡한 특질을 가지는 죽상동맥경화증의 발생에 관여하는 인자 중, 최근 대두되고 있는 혈관내피 산화질소 합성효소 유전자의 변이와 죽상동맥경화증과의 관련성을 확인해 보고자 하였다. 전남대 병원에서 치료 중인 환자 중, 관상동맥 및 뇌혈관 질환에 명확한 죽상동맥경화증이 있는 것으로 증명된 142명 (관상동맥질환: 87명, 허혈성 뇌졸중: 54명)을 환자군으로 하였으며, 50세 이상의 환자 중 관상동맥질환이나 뇌혈관 질환의 증거가 없는 60명을 대조군으로 하였다. 혈관내피 산화질소 합성효소 유전자 다형성은, 백색인종에서 변이가 알려진 exon 6번부터 exon 7번 사이의 염기서열을 분석대상으로 하였다. 환자의 말초혈액에서 DNA를 분리한 후에, 중합효소 연쇄반응과 ABI Prism 310 자동화 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열을 분석 후, Genebank accession number: D26607과 비교하여, 다형성을 찾고자 하였다. 202명의 연구 대상 중, 175명 (86.6%)에서 염기서열 분석이 가능하였다. Exon 6번, intron 6번, exon 7번에서 각 각 1개씩의 염기변이가 관찰되었으며, 연기 변이의 형태는 모두 단일염기다형성이었다. Exon 6번의 염기변이 (774C→T)는 아미노산의 변이를 초래하지 않으며, 유전자형 (CC, TT)의 빈도는 환자군과 대조군에서 통계학적 차이를 보이지 않았다 Exon 7번의 염기변이 (894G→T)는 아미노산의 변이 (Codon 298, Glu→Asp)를 초래하며, 특히 혼합형 (GT)과 돌연변이 단일형 유전자형 (TT)은 관상동맥 환자군과 대조군에서 유의한 빈도 차이를 보였다 (p=0.046). G894→T 다형성은 대조군 7.4% (혼합형 7.4%, 돌연변이 단일형 0.0%), 전체 환자군 16.3% (혼합형 14.9%, 돌연변이 단일형 17%)을 보였는데, 이러한 빈도는 백색인종과 큰 차이를 보였다. 그러나, G894→T 다형성과 잘 알려진 죽상동맥경화증의 일반적인 위험인자와의 연관성, 그리고 질환이 발생한 관상동맥 혈관의 수를 통하여 본 질병의 중증도와는 관련이 없었다. Intron 6번의 염기변이는 서양인에서는 보고되지 않는, 한국인에서 처음 발견된 것이나, 본 연구에서는 환자군과 대조군에서 유의한 통계학적 빈도 차이는 없었다. 또한, 본 연구에서 관찰된 다형성이 관상동맥과 뇌혈관을 침범하는 죽상동맥경화증의 발생을 구별 할 수 있는 인자로의 유용성은 없었다. 이상의 성적을 종합하면, 혈관내피 산화효소 합성효소 유전자의 G894→T 다형성은 죽상동맥경화증의 발생에 관여하는 것으로 보이지만, 낮은 빈도와 일반적인 죽상동맥경화증의 위험 인자 및 질병의 중증도와 연관성이 없는 점으로 미루어 볼 때 한국인에서 그 역할은 적을 것으로 생각된다. Intron 6번의 다형성과 동맥경화증의 발생과의 관련은 없었지만, 기능적 역할에 대한 연구나 다른 질환과의 관련성은 더 시행되어야 할 것이다 또한, 본 연구의 결과에서처럼, 유전자에서 관찰되는 단일염기다형성은 인종간에 그 형태 및 빈도에서 큰 차이를 보이기 때문에, 한국인에 적합한 다형성의 발견 및 결과의 축적은 필수적인 것으로 사료된다.

The anti-atherosclerotic effect of anakinra, a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, in apolipoprotein E-knockout mice

구유정 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Introduction Accumulated evidence suggest that interleukin (IL)-1β plays a substantial role in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to evaluate the effect of anakinra, a recombinant human IL-1 receptor antagonist, on the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout (ApoE–/–) mice. Materials and Methods Forty 8-week-old male ApoE–/– mice were fed a standard chow diet for 4 weeks followed by a atherogenic diet (35 kcal% fat, 1.25% cholesterol, and 0.5% sodium cholic acid) for 12 weeks and divided into 4 groups: control (saline), anakinra 10 mg/kg, 25 mg/kg, and 50 mg/kg (n = 10 in each group). En face analyses of aortic arches were compared for size of atheromatous plaques in each group. In vitro study, inflammatory genes and signaling pathways were evaluated in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), rat aortic smooth muscle cells (RAOSMCs), and 3T3-L1 adipocytes. Results In light of atherosclerosis, chronic treatment of anakinra significantly reduced the plaque sizes in the aortic arch by 30.6% and 25.2% at the 25 mg/kg and 50 mg/kg doses (both P <0.05, compared with vehicle treated group) and decreased serum triglyceride level compared to control group in ApoE–/– mice. In HUVECs and RAOSMCs, anakinra suppressed mRNA expressions of IL-1β and IL-6 compared to control group (all P <0.05). Anakinra significantly reduced metalloproteinase-9 mRNA expression in RAOSMCs. In addition, anakinra inhibited cellular migration capability measured by the wound-healing assay in RAOSMCs (57% reduction compared to the control group, P <0.001). Anakinra effected on the phosphorylation of NF-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, respectively (P <0.05). In terms of fat metabolism, anakinra group exhibited a tendency of lower CD 68+ macrophage infiltration in visceral adipose tissue. In 3T3-L1 adipocytes, anakinra reduced the mRNA expressions of NLRP3 inflammasome and monocyte chemoattractant protein-1 compared with control group (all P <0.05). Conclusion IL-1 blockade with anakinra significantly reduced atherosclerotic plaque formation in ApoE–/– mice. Additionally, inflammatory genes and vascular remodeling were ameliorated by anakinra in endothelial cells, smooth muscle cells, and adipocytes. Taken together, anakinra could be a part of complementary treatment strategies to reduce the remained residual cardiovascular risk despite on standard regimens. 서론: 만성적인 염증이 죽상동맥경화증의 발생 및 진행에 미치는 영향은 널리 알려져 있다. 현재까지 죽상동맥경화증의 예방과 치료에는 주로 스타틴, 에제티미브, 프로-단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형 (pro-protein convertase subtilisin/kexin type 9) 저해제 계열의 지질강하제가 주로 사용이 되어 왔다. 죽상동맥경화증의 주요 기전인 만성 염증을 효과적으로 억제하는 것이 지질강하제만으로는 극복하지 못하는 한계를 극복해 나갈 수 있을 것이다. 특히, 최근에는 죽상동맥경화증 발생 및 진행에 인터루킨(Interleukin, IL)-1β가 중요한 역할을 한다는 연구 결과들이 축적되고 있는데, 이는 대식세포에서 분비하는 대표적인 전염증성 사이토카인으로서 열, 사이토카인 합성 증가, 백혈구의 응집, 섬유아세포의 활성화 및 내막세포 유전자를 조절하는 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 연구의 목적은 죽상동맥경화증 동물 모델인 아포지단백 E-결핍 (ApoE-/-) 마우스에서 재조합 인간 IL-1 수용체 길항제인 아나킨라(anakinra)이 죽상동맥경화증의 진행에 미치는 영향 및 그 기전을 규명하고, 향후 임상적인 유용성을 평가하고자 하는 것이다. 연구방법: 8주령 수컷 ApoE-/- 마우스 40마리에 4주간 일반식이(standard chow diet)를 섭취시키고, 이후 12주간 동맥경화유발 식이(atherogenic diet; 35 kcal% 지방, 1.25% 콜레스테롤, and 0.5% 담즙산)를 섭취하여 죽상동맥경화증 동물 모델을 확립하였다. 대조군(생리식염수), 아나킨라 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50mg/kg 군으로 각 군당 10마리씩 배정하였다. En face 분석을 통해 대동맥궁의 동맥경화반의 크기를 비교하였다. 아나킨라의 동맥경화증 발생 및 진행에 관여하는 기전을 확인하기 위해, 인간제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC), 쥐의 대동맥평활근세포(rat aortic smooth muscle cell, RAOSMC), 3T3-L1 지방세포에 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharide, LPS)와 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α를 처리하여 염증유발모델을 구축하였다. 이 세포주에 다양한 농도의 아나킨라를 처리한 후 IL-1β, NLRP3 인플라마좀의 발현, 염증성 유전자 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 또한, 아나킨라의 세포내 신호 전달을 매개하는 기전을 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)으로 핵인자 κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB) 및 미토겐 활성화단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 경로 단백질 발현을 확인하였다. 하위 한편, 죽상동맥경화 진행에 주요한 역할을 하는 세포 이동에 대한 아나킨라의 역할을 확인하기 위해 RAOSMC에서 상처 치유 분석 (wound healing assay)를 시행하였다. 결과: 아나킨라의 장기 투약은 ApoE-/- 마우스의 대동맥궁에서 동맥경화반의 유의한 감소를 보여주었고, 혈청 중성지방의 감소 역시 뚜렷하였다. 아나킨라 투약 ApoE-/-군의 내장지방 내 CD68양성 대식세포의 발현이 대조군에 비해 감소되는 경향을 확인하였다. HUVEC에서 아나킨라 투약군에서 IL-1β와 염증성 사이토카인인 IL-6 감소가 뚜렷하게 관찰되었다. RAOSMC에서 아나킨라 투약군에서 NLRP3 인플라마좀, IL-1β, IL-6 감소 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase-9) 발현 또한 유의한 감소를 보였다. 3T3-L1 지방세포에서 아나킨라 투여 후 NLRP3 인플라마좀과 단핵세포화학유인물질단백질-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)의 유의한 감소를 확인하였다. 아나킨라로 처리한 RAOSMC에서, LPS와 TNF-α로 유발된 p38 과 p65 의 인산화가 강력히 억제됨에 따라, 아나킨라가 NF-κB의 핵 전위 감소와 MAPK 억제를 통해 항염증반응을 보인다는 것을 확인하였다. 상처 치유 분석을 통해 아나킨라는 죽상동맥경화증 진행에 중요한 역할을 하는 세포 이동 (cell migration)에 대해 유의한 억제 효과를 보여주었다. 결론: 아나킨라를 통한 IL-1 차단은 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화반의 형성을 유의하게 감소시켰다. 또한 HUVEC, RAOSMC, 3T3-L1 세포에서 염증성 유전자의 발현을 억제하였으며, RAOSMC의 세포 이동을 억제하여 혈관 재형성에 영향을 주었다. 결론적으로 아나킨라는 기존 표준 치료의 한계인 잔존 심혈관질환의 위험성에 대해 기전적 치료 기반 전략으로서의 가능성을 보여주었다.

An experimental study on inhibitory effects of GamiSilsoSan on the atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits : 고콜레스테롤증 토끼의 죽상동맥경화증에 대한 가미실소산의 실험적 연구

신상습 동국대학교 대학원 2000 국내박사

최근 한의학의 전통이론인 어혈이론과 활혈화어약물의 효과를 현대적으로 구명하기 위하여 많은 노력이 경주되고 있다. 현재 한국에서도 음식문화의 서구화로 각종 혈관계 질환이 사망의 주된 원인이 되고 있는 현실에서 이러한 질환에 대한 한의학적 치료방법의 모색과 치료제제의 작용기전에 대한 해석은 오늘날의 한의학에 필요한 과제의 하나라고 할 수 있다. 혈액중의 지방은 우리 몸의 신진대사에 필요한 성분이며, 콜레스테롤은 우리 몸속에서 세포막을 구성하며 부신피질호르몬과 성호르몬을 만드는 재료로써 건강을 유지 증진시키는데 중요한 작용을 한다. 그러나 그 농도가 높아질 때에는 고지혈증을 일으키고 나아가 고혈압, 흡연과 함께 죽상동맥경화증의 중요한 위험인자가 되는 것이다. 이러한 고콜레스테롤혈증으로 인한 죽상동맥경화증은 주로 콜레스테롤이 많이 있는 동물성 지방의 과잉 섭취로 발생되며, 한의학에서는 흉비, 痰證, 心悸, 眩暈, 眞心痛, 頭痛, 中風 등의 유발인자로 귀속시키고 있으며, 고콜레스테롤혈증을 유발하는 원인으로 氣滯血瘀, 痰濁, 瘀血 등과 腎虛, 脾腎虧虛, 肝腎陰虛, 脾胃濕熱 등을 언급하여 장부의 정기가 허쇠한 상태에서 음식부절이나 肥甘厚味한 음식을 지나치게 섭취하거나, 好坐好靜이나 칠정노상 등의 病機에 의한 正虛邪實症으로 변증할 수 있다. 이에 고콜레스테롤혈증으로 인한 죽상동맥경화증이 기체혈어 및 담탁 등으로 인한 것으로 보고, 이에 다용되고 있는 활혈화어지제증 가미실소산을 활용하여 Kurosawa, Kusanagi- Hypercholesterolemic rabbit인 고콜레스테롤혈증모형의 죽상동맥경화병변의 진전에 대한 억제효과를 연구하였다. 대조군과 가미실소산군으로 나누어 혈액화학, 병리학적 죽상동맥 경화 변화를 측정한 결과, 대조군에서 4주(30.43%)와 8주(47.48%)사이에 죽상동맥의 경화영역이 증가되었으며, 가미실소산이 처리된 그룹에서는 4주(22.65%)와 8주(23.23%)에 있어서 죽상동맥경화병변의 증가 현상은 줄었다. Low-density lipoprotein(LDL) oxidation의 변화에서는 가미실소산군이 8주-14주에서 LDL 항산화효과가 나타났으며, 특히 8, 10주에서는 34.5, 33.6(min)으로 더욱 유의성있게 나타났다. 그러므로 가미실소산은 KHC rabbits의 고콜레스레롤혈증을 개선시킨 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 가미실소산이 고콜레스레롤혈증 모델 토끼에 있어서 죽상동맥경화를 야기하는 죽종성판형성의 억제효과가 있는 것으로 보인다. 그러므로 가미실소산은 죽상동맥경화와 간정맥 혈전증 등으로 야기 될 수 있는 허혈성 경색 및 동맥경화증 등의 치료와 예방에 임상적으로 활용이 가능한 것으로 사료된다.

전신성 죽상동맥경화증 예측에 대한 목동맥 죽상동맥경화증과 심장내 석회화의 비교

김형우 동국대학교 2011 국내석사

Background: Thickened carotid intima-media or a carotid plaque represents carotid atherosclerosis. Intracardiac calcification (ICC) is a marker of atherosclerosis. It is unknown which of these localized atherosclerosis is better to predict generalized atherosclerosis. Subjects and Methods: This study comprised 282 patients (mean age, 58.2±10.7 years; female 45.4%) who underwent diagnostic coronary arteriography (CAG). Patients underwent carotid ultrasonography, transthoracic echocardiography, and measurements of brachial-ankle pulse wave velocity (baPWV) and ankle-brachial pressure index (ABI) before CAG. Significant atherosclerosis were defined as follows: coronary artery stenosis ≥50% (coronary artery disease, CAD); carotid intima-media thickness >75th percentile, determined from data of healthy adults, or carotid plaque (carotid atherosclerosis, CA); aortic valve calcification (AVC) or mitral annulus calcification (MAC); baPWV >1450 cm/s (high baPWV); ABI <0.90 (peripheral artery disease, PAD). Results: CA was associated with CAD (56.5 vs 29.5%, p<0.001), AVC (57.1 vs 34.3%, p<0.001), high baPWV (69.1 vs 43.7%, p<0.001), and PAD (4.9 vs 0.0%, p=0.025), but not with MAC (51.4 vs 43.8%, p=NS). AVC was associated with CA (73.7 vs 52.4%, p<0.001) and high baPWV (70.1 vs 49.3%, p=0.001), but neither with CAD (49.6 vs 43.4%, p=NS) nor PAD (3.1 vs 2.9%, p=NS). MAC was not associated with CAD, CA, high baPWV, and PAD. Among three findings of atherosclerosis (CAD, high baPWV, and PAD), CA discriminated two or more findings [AUC 0.66 (95% CI, 0.59-0.73; p<0.001)], whereas AVC did not [AUC 0.57 (95% CI, 0.50-0.64; p=0.061)]. Conclusion: These suggest that CA is better than ICC in predicting generalized atherosclerosis. KEY WORDS: Carotid atherosclerosis; Intracardiac calcification; Coronary artery disease; Brachial-ankle pulse wave velocity; Ankle-brachial pressure index.