실험적 당뇨병 흰쥐의 적혈구 지질 과산화에 관한 연구

배혜상 이화여자대학교 대학원 1993 국내박사

적혈구 변화는 당뇨병 환자 조직에 국소 허혈(ischemia)과 유동학적인 장애를 일으킨다는 많은 연구가 있다. 당뇨병에서 오는 이러한 혈액학적 장애는 미세혈관의 흐름을 방해하여 당뇨병 합병증에서 중요한 역할을 하며, 특히 당뇨병에서 적혈구는 수명이 감소되고, 과량의 응집, 막 인지질이 비대칭적으로 변화하고 내피세포의 접착성 경향을 증가시킨다. 또 다른 연구에서는 사람에서 in vitro와 in vivo에서 실험하였고 또한 흰쥐와 토끼의 적혈구 연구에서도 막 지질 과산화가 세포 생존을 감소시키고, 막 인지질을 비대칭적으로 변화시키며, 응고성이 항진되고, 내피세포의 접착성이 증가됨이 증명되었다. 그러나 고혈당증이 적혈구를 변화시키는 기전은 잘 알려지지 않았다. 본 연구는 당뇨병쥐에서 고혈당증이 적혈구의 지질 과산화, thiobarbituric acid(TBA) 반응성, 총 인지질 및 콜레스테롤치에 미치는 영향 그리고 당뇨병중에 적혈구에서 지질의 이상을 관찰하고,고혈당증에 인슐린 치료효과를 관찰하기 위해 알록산 투여로 당뇨병이 유발된 당뇨병쥐에서 혈당과 당화 혈색소를 조사하고 당뇨병쥐의 적혈구에서 TBA 반응성으로 형성된 malonyldialdehyde(MDA)를 측정하므로써 막 지질 과산화지질양을 측정하였고 동시에 총 인지질과 콜레스테롤치에 미치는 영향을 측정하고 또한 인지질의 주요성분을 측정하므로써 지질의 이상을 연구하고 인슐린 투여로 당뇨병 치료과정에서 지질 이상이 회복됨을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었기에 보고자 한다. 1. 당뇨병쥐에서 혈당과 당화 혈색소가 현저히 증가되었고(P<0.001), 인슐린 투여로 정상 대조군 치로 감소되었다. 2. 당뇨병쥐의 적혈구에서 TBA의 반응성은 대조군에 비하여 현저히 증가되었고(P<0.001), 인슐린 투여로 정상대조군과 비슷한 치로 되었다. 3. 당뇨병쥐의 적혈구에서 총 콜레스테롤 치는 정상대조군에 비해 감소되었고(P<0.01), 인슐린 투여로 대조군과 비슷하게 증가되었다. 인지질은 당뇨병쥐의 적혈구에서 증가되었고 인슐린 투여로 정상 대조군 수준치이하로 감소되었다. 4. 당뇨병쥐의 적혈구에서 인지질의 주요한 성분인 sphingomyelin(SM)은 대조군에 비해 의의있게 감소되었고 인슐린 투여로 증가되었으며, phosphatidylethanolamine(PE)은 당뇨병쥐의 적혈구에서 증가되었으나 인슐린 투여로 감소되었으며, phosphatidylcholine(PC)은 대조군과 별차이가 없었다. 5. 당뇨병쥐의 적혈구에서 당화 혈색소 치와 TBA반응성 사이에 통계학적으로 의의있는 상관관계가 있었다(r=0.64, P<0.01). 6. 당뇨병쥐의 적혈구에서 당화 혈색소 치와 phospholipid-MDA로 변화된 산물 형성사이에통계학적으로 의의있는 상관관계가 있었다(r=0.52, P<0.01). 이러한 결과는 당뇨병쥐 적혈구에서 혈당의 증가 정도와 MDA의 축적 즉 막 지질 과산화와 밀접한 상관 관계가 있음을 나타냈다. The present study has examined the effect of elevated glucose levels on membrane lipid peroxidation, thiobarbituric acid reactivity, total phospholipid, cholesterol levels, and lipid abnormality and insulin effects in the alloxan induced diabetic rat RBC. The results are as follows: 1. The blood glucose and glycosylayted hemoglobin were significantly higher in the diabetic rats than in the normal control(P<0.001) and decreased to the near normal control levels with insulin treatment. 2. The TBA reactivity of malonyldialdehyde was significantly higher in the diabetic rats than in the control(P<0.001) and returned to the near normal control levels with insulin treatment. 3. The total cholesterol levels were lower in the diabetic rats than in the normal control (P<0.01) and increased to the near control levels with insulin treatment. The total phospholipid levels were higher in the diabetic rats than in the normal control and decreased to the near normal control leves with insulin treatment. 4. The sphingomyelin(SM) was significantly lower in the diabetic rats compared to the control. The phosphatidylethano- lamine(PE) was significantly higher in the diabetic rats compared to the control. There was no significantly different in phosphatidylcholine (PC) level between control and diabetic rats. The abnormality of SM and PE was corrected with insulin treatment. 5. The significant positive correlation was observed between glycosylated hemoglobin and TBA reactivity in the diabetic rats(r=0.64, P<0.01). 6. The significant positive correlation was observed between glycosylated hemoglobin and phospholipid-MDA adduct in the diabetic rats(r=0.52, P<0.01) These data suggest that elevated glucose levels can cause the membrane lipid peroxidation and which may have a role in the increased lipid peroxidation products found in diabetic rats.

赤血球膜 NADase의 4, 4'-Diisothio cyanostilbene-2, 2'-disulfonate에 依한 抑制

김봉국 全南大學校 大學院 1986 국내박사

赤血球膜의 陰이온 輸送을 特異하게 抑制하는 4,4'-diisothiocyanostilbene -2,2’- disulfonate(DIDS)가 家兎赤血球膜의 NADase活性도 抑制함을 究朋하였다. DIDS의 本 NADase에 對한 抑制樣相은 基質인 NAD 에 對하여 非상경적이고 抑制解離定數( Ki ) 는 40μM, 그리고 50% 抑制를 일으키는 농도( I _50 )는 30μM이었다. 이와 같은 DIDS의 抑制作用은 DIDS를 赤血球 浮遊液에 직접 加했을때 뿐만 아니라 赤血球를 DIDS 存在下에 孵置한 後 赤血球를 0.9% NaCl 液으로 잘 洗滌한 경우에도 나타나 DIDS는 赤血球膜 N ADase에 堅固히 結合함을 가리켰다. 家兎赤血球膜NADase는 低濃度(0.2M)의 尿素에 依하여 約 1.6倍 活性化 되었는데 DIDS는 이와같이 尿素로 活性化된 NADase活性도 尿素處理를 받지 아니한 경우와 비슷한 率로 抑制하였다. DIDS는 家兎赤血球膜에서 NADase처럼 活性部位를 膜外面에 가지고 있는 acetylcholinesterase에 對해서는 아무런 영향도 주지 아니하였다. 赤血球膜의 陰이온 輸送은 赤血球膜의 band 3蛋白에 依하여 遂行되고 있기 때문에 以上의 實驗成績으로 미루어 보아 band 3蛋白이 바로 NADase 活性을 나타내는 蛋白이 아닌가 示唆되었다. The activity of NAD glycohydrolase (NADase) in rabbit erythrocyte membrane was markedly inhibited by the potent inhibitor of red cell anion transport, 4, 4'-diisothiocyanostilbene-2, 2'disulfonate (DIDS). The inhibition by DIDS was linear non-competitive with respect to the substrate NAD, with Ki=40 ㎛ and I_50 (concentration to produce 50% inhibition)=30 μM. The NADase inhibition by DIDS could be demonstrated even after DIDS-treated cells had been thoroughly washed with isotonic saline solution, indicating that DIDS tightly binds to the membrane NADase. The NADase of rabbit erythrocyte membrane was activated approximately 1.5-fold by the presence of 0.2 M urea, and the inhibitory effect of DIDS was equally manifested on the urea-activated NADase. The activity of acetylcholinesterase, another ecto-enzyme of erythrocyte membrane, was not affected by DIDS. Since the Band 3 protein of erythrocyte membranes catalyzes the exchange of anions across the plasma membrane, and since DIDS specifically binds to the Band 3 protein, the present results suggest that the Band 3 protein of rabbit erythrocyte membrane displays NADase activity.

牛赤血球膜蛋白의 電氣泳動法에 依한 分析 : 낮은 赤血球 沈降速度와의 關係

박영우 全南大學校 1988 국내박사

소에서 赤血球 沈降速度(ESR)가 낮은 원인을 밝혀보려고 사람과 소의 赤血球를 trypsin으로 부분 消化시킨 다음 ESR의 促進與否를 검색하고, 同時에 赤血球膜 蛋白像의 變化를 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 電氣泳動法으로 分析하여 비교하였다. 소(Holstein 젖소 및 韓牛)의 ESR은 이미 보고되어 있는 바와같이 사람 것에 비하여 1/7정도로 매우 낮았다. 그러나, 赤血球를 미리 trypsin(0.2mg과 0.5mg/㎖)으로 37℃에서 1시간 처리하면 사람과 Holstein 젖소의 ESR은 현저히 促進되었으나, 韓牛에서는 거의 促進되지 아니 하였다. 소 赤血球膜의 蛋白分劃은 大伴로 사람의 것과 비슷하였으나, 사람의 것에서는 存在치 않는 또 하나의 蛋白分劃이 사람의 ban 2와 3 사이에 해당하는 위치에 나타나서, 本 硏究에서는 이 分劃을 band Q라 命名하였다. 이 band Q는 赤血球를 trypsin으로 처리하면 Holstein 젖소의 것에서는 減少하거나 消失되었으나, 韓牛의 것에서는 消失되지 아니하였다. Periodic acid-Schiff(PAS) 염색으로 검색한 赤血球膜의 糖蛋白 分劃像은 사람과 소 間에 큰 差가 認定되었다. 卽, 사람 것의 PAS-1(glycophorin)과 PAS-2(sialoglycoprotein)의 糖蛋白은 젖소와 韓牛에서는 거의 나타나지 않고, 그 代身 電氣泳動像의 原點에 가까운 部位에 强한 PAS 陽性 band가 나타나서, 本 硏究에서는 이를 PAS-B라 命名하였다. 赤血球를 trypsin으로 처리하면 사람 것에서는 PAS-1과 PAS-2 그리고, Holstein 것에서는 PAS-B 糖蛋白 分劃이 消失 내지 減少하였으나, 韓牛 것에서는 PAS-B 分劃이 消失되지 아니하였다. 그러나, 韓牛 것에서도 사람과 Holstein 것에서 처럼 trypsin 처리로 低分子 糖蛋白 分劃이 出現하여 高分子 糖蛋白이 trypsin에 의하여 分解되었음을 알 수 있었다. 以上의 實驗結果로 미루어 보아, 소 赤血球의 낮은 沈降速度는 소 赤血球膜의 band Q 蛋白 分劃과 PAS-B 糖蛋白 分劃의 存在가 한 要因이 될 것으로 示唆되었다. The proteins of the bovine erythrocyte membrane were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate, and their reation to slow sedimentation rate of bovine erythrocytes was investigated by treating the erythrocytes with trypsin. The erythrocyte sedimentation rate of bovine erythrocytes from Holstein and Korean cattle was very slow compared to the hurmn ones (1/7 as rapid as the human ones) as reported previously. However, when human and Holstein erythrocytes were treated for 1 hour at 37℃ with trypsin (0.2 and 0.5mg/㎖), their sedimentation rate was markedly accelerated while the slow sedimentation rate of Korean cattle's erythrocytes did not change. Although the general protein profile of the bovine erythrocyte membrane was almost similar to the human patterns, bovine erythrocyte membranes showed one additional protein band, called band Q in this study, which migrated electrophoretically to the midposition between band 2 and band 3 in human pattern. Treatment of Holstein and human erythrocytes with trypsin caused a decrease or disappearance of the band Q from the erythrocyte membrane. In contrast, no disappearance of band Q was observed in Koean cow's erythrocyte membrane even after trypsin treatment. The glycoprotein profile of the bovine erythrocyte membrane as stained by periodic acid-Schiff reagent revealed a marked difference from human pattern. The PAS-1 (glycophorin) and PAS-2 (sialoglycoprotein) present in human erythrocyte membrane were almost absent from the bovine erythrocyte membrane. Instead, the bovine erytrocyte membranes showed a strong PAS-positive band near the origin of the electrophoregrams, which is called PAS-B in this study. The PAS-B band was decreased after trypsin treatment of Holstein erythrocyte whereas the PAS-B band in Korean cow's erythrocyte membrane did not change after trypsin treatment of the erythrocytes. However, the trypsin treatment of Korean cow's erythrocytes led to the appearance of small molecular weight peptides, indicating that the high molecular weight glycoproteins were degraded by trypsin as in human and Holstein ones. These results suggest that the slow sedimentation rate of bovine erythrocytes is due in part to the presence of band Q protein fraction and PAS-B glycoprotein in the bovine erythrocytes.

赤血球膜脂質含量과 膜透過性과의 關係

안승환 全南大學校 大學院 1980 국내석사

赤血球 0.34M sucrose液에 浮遊시켜 4℃에 保存할 때 赤血球의 methylene blue(MB) 攝取能이 增加하였으며, 이때 赤血球膜의 cholesterol과 燐脂質의 缺損이 隨伴되었다. 赤血球를 0.3M과 0.25M의 sucrose液中에 保存하더라도 赤血球의 MB攝取能은 여전히 增加하였다. 赤血球를 10mM glucose와 20mM Na-phosphate buffer(PH 7.4)를 包含하는 0.3M sucrose媒液에 浮遊시켜 37℃에 孵置시킬 때 赤血球內의 sulfhydryl基 含量에는 變化가 없었다. 사람에 있어서 血淸 cholesterol値와 赤血球의 MB攝取能者間에는 별다른 相關性이 없는 것으로 判明되었다. 赤血球를 0.34M sucrose液中에서 4℃에 保存시킬 때 赤血球의 Na^+流入과 K^+流出은 漸次 減少하였다. 以上의 結果로부터 cholesterol은 赤血球膜의 透過性에는 關聯이 없으며, 單純擴散에 依해 赤血球膜을 透過하는 MB의 膜透過能은 膜의 燐脂質 含量에 따라 變하는 反面, 膜의 carrier蛋白에 依해 運搬되는 Na^+과 K^+의 境遇는 상당한 膜燐脂質量의 變化에 依해서도 그 膜透過能이 影響받지 않음이 示唆되었다. When rabbit erythrocytes were stored in the 0.34M sucrose medium at 4℃, the methylene blue (MB) uptake of erythrocytes increased. Concomitantly, there occurred the loss of cholesterol and phospholipid from erythrocyte membranes. The increase of MB uptake was also found when erythrocytes were stored in the isotonic or hypotonic sucrose medium at 4℃. The erythrocyte sulfhydyl content, which reflects the activity of pentose phosphate pathway, was not affected by incubation of erythrocytes in the 0.30M sucrose medium containing 10mM glucose and 20mM Na-phosphate buffer (PH 7.4) at 37℃. Serum cholesterol was found to have no relation with the MB uptake of human erythrocyte. In contrast to the case of MB uptake, the fluxes of Na^+ and K^+ across the erythrocyte membrane were decreased by storing erythrocytes in the sucrose medium at 4℃. And Na^+, K^+ -ATPase of erythrocytes was partially inactivated during the storage. These results suggest that the increase of the MB uptake of erythrocytes during storage of cells in the sucrose medium at 4℃ can be ascribed to the loss of lipids, especially phospholipid, from the erythrocyte membrane, while the lowered Na^+, K^+ fluxes in the stored erythrocytes is due to the inactivation of carrier proteins for these ions. These results also suggest that cholesterol seem to have no relation with the membrane permeability.

사람 赤血球에서의 Acylcarnitine 生合成과 機能에 關한 生化學的 硏究

정진성 漢陽大學校 大學院 1984 국내박사

Study of erythrocyte membrane using combined AFM-TIRFM technique

배광돈 Graduate School, Yonsei University 2018 국내석사

적혈구는 특별한 세포 골격 구조 (스펙트린 네트워크)로 인해 ~120 일의 수명 동안 좁은 모세 혈관을 쉽게 통과 할 수 있도록 변형 가능하며 안정적이다. 적혈구 세포 골격은 스펙트린, 액틴 복합체 및 안키린 복합체로 구성되어 있으며 육각형 그물구조를 이루고 있다. 그러나 지금까지 적혈구 세포막 구성요소들의 공간적 분포와 역학 및 세포막-세포 골격 간의 상호 작용은 알려지지 않았다. 그러나 온전한 적혈구를 직접 연구하는 것은 적혈구의 주요 세포질 성분인 헤모글로빈의 백그라운드 효과와 효소 반응이 간섭하여 제한된 정보만 얻을 수 있다. 적혈구 세포막 특성을 구체적으로 조사하기 위해서는 온전한 스펙트린 네트워크가 유지되며, 세포질 성분이 없는 모델 적혈구 (“유령 적혈구”)를 개발하는 것이 바람직하다. 원자힘현미경은 생리적인 조건에서 생물학적인 샘플을 공간적으로 분해된 이미지로 얻을 수 있지만 (공간 해상도 ~1 nm), 단지 지형 정보만 제공한다. 반면에 전반사 현미경은 표면 근처 (특히 100 nm 이내)의 형광 표지 된 생물 분자에 대한 정보를 얻을 수 있지만, 공간 분해능은 수백 나노 미터이다. 따라서 본 연구에서 사용 된 원자힘현미경-전반사형미경 상관 기술은 각각의 기술적 한계를 극복하여 표면 근처 세포막 구성 성분의 역학 및 세포막의 형태를 “나노 범위”에서 특성 규명을 가능하게 한다. 본 연구에서는 양친성 폴리-감마-글루타메이트 (APG)를 사용하여 세포막의 용해/재밀봉이 조절 가능하며, 스펙트린 네트워크가 손상되지 않은 “새로운” 유령 적혈구를 만들었다. 새로운 유령 적혈구는 폴리라이신으로 개질 된 유리 표면에서 매우 안정적이며, 평균 높이가 ~110 nm로 소낭성의 형태가 유지되는 것을 확인했다. 이 결과는 일반적으로 유리 표면에서 붕괴되는 기존 유령 적혈구와 달리 새로운 유령 적혈구는 스펙트럼 네트워크가 기계적 지지체로 존재함을 시사한다. 또한, “APG 공극”을 통한 세포질 요소들의 방출은 초기 APG 농도를 변화시킴으로써 조절 할 수 있다. 마지막으로, 원자힘현미경-전반사형미경 상관 기술로 얻은 이미지를 통해 형광 표지 된 APG 분자가 새로운 유령 적혈구에 남아 있다는 것을 확인하였고, 이로써 우리는 세포막에서 “APG 공극”의 특성에 대해 더 탐구 할 수 있을 것이다. 새로운 유령 적혈구는 세포막의 역학과 적혈구의 세포막-세포 골격 상호작용에 대한 상세한 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템으로 사용될 것이다. Erythrocytes are remarkably deformable and sufficiently stable to easily traverse narrow capillaries during their ~120-day lifespan due to their special cytoskeleton structure (known as the spectrin network). The erythrocyte skeleton is a hexagonal meshwork of spectrins (α, β), actin junctional complexes, and ankyrin complexes. To date, the spatial distribution and dynamics of the membrane constituents, and the membrane-cytoskeleton interactions remain mostly unknown. Studying directly the intact erythrocyte, however, provides only limited information on the above questions due to the interfering enzymatic reactions and the background effects of hemoglobins, the major cytoplasmic component of erythrocyte. In order to investigate specifically the membrane behaviours of erythrocyte, it is thus desirable to develop the model erythrocyte with no cytoplasmic elements (also known as “ghost erythrocyte”) but with maintaining the spectrin network intact. Atomic force microscopy (AFM) can be used in obtaining the spatially resolved images of the biological samples in the physiological conditions (spatial resolutions ~ 1 nm), but only the topographic information provided. On the other hand, the total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) can be used in obtaining the information on the fluorescence-labelled biological molecules specifically near the surface (within ~100 nm), but its spatial resolutions only limited to a few hundred nanometers. Therefore, the combined AFM-TIRFM technique used in this work overcomes the limitations of the individual techniques, permitting the studies of the “nanoscopic” characterization of the membrane morphologies and the dynamics of their constituents near the surface. In this study, we developed “novel” ghost erythrocyte with the intact spectrin network using amphiphilic poly-gamma-glutamate (APG) as a controllable membrane rupture/resealing agent. It was found that the novel ghost erythrocytes are highly stable on the poly-lysine coated glass surface, maintaining a vesicular form with the average height of ~110 nm. This result is markedly different from the behaviours of conventional ghost erythrocytes which usually collapse on the glass surface, suggesting the presence of intact spectrin network as a mechanical support in the case of novel ghost erythrocytes. Furthermore, the release of cytoplasmic elements through the so called “APG pore” can be controlled by varying the initial APG concentrations. Finally, the combined AFM-TIRFM images confirm that the fluorescence-labelled APG molecules remain on the novel ghost erythrocytes, thus allowing us to further explore the nature of the “APG pore” on the membrane. From this work, the novel ghost erythrocytes can be used as an excellent model system for the detailed studies of the membrane dynamics and the membrane-cytoskeleton interactions of erythrocyte.

중금속 납에 의한 적혈구 용혈과 혈액응고 촉진 활성과의 상관성에 관한 연구

전소영 서울대학교 대학원 2017 국내석사

중금속 납(Pb)은 환경 중에 널리 존재하는 원소로서, 납에 오염된 음용수를 통해 주로 경구 노출 경로로 인체에 독성을 유발한다. 특히 혈액 내로 들어온 납은 95% 이상이 적혈구에 축적되므로 납의 적혈구 독성은 많은 주목을 받아왔다. 기존에 납에 의한 적혈구 막의 phosphatidylserine(PS) 노출과 이로 인한 혈전 생성 연구가 보고된 바 있다. 그러나 납에 의한 용혈 현상과 혈액 응고 활성의 관한 연구가 현재까지는 진행된 바가 없다. 본 연구에서는 기존 연구 결과를 바탕으로 납에 의한 적혈구의 혈액 응고 촉진 활성이 적혈구 용혈 현상과의 상관성에대해 파악하고자 하였다. 건강한 사람의 혈액으로부터 분리한 적혈구에 납(Lead(Ⅱ) Acetate)을 처리하였을 때 농도 및 시간 의존적으로 hemolysis가 증가하였다. Flow cytometer(FACS)를 이용한 분석에서 용혈 현상이 일어나지 않은 농도에서 농도 의존적으로 PS 노출이 증가하였다. 또한 적혈구에서 PS 발현을 유도 할 수 있는 주요한 원인인 세포 내 칼슘 농도가 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 적혈구의 apoptotic pathway에 의해서도 PS가 노출된다는 보고에 따라 caspase-3 활성을 측정한 결과 PS 노출 최고 농도에서 그 활성이 유의적으로 증가하였다. 납에 의한 적혈구의 모양 변화를 공초점 현미경(confocal)과 주사현미경(SEM)을 이용하여 두드러진 echinocyte 및 spherocyte로의 변화를 관찰하였다. 이 때 confocal을 통해 echinocyte에서 spherocyte로 진행될 때 생성된 microvesicle(MV)을 확인하였다. 납에 의한 MV의 생성 정도와 생성된 MV에서의 PS 발현 정도를 FACS를 이용하여 측정한 결과 고농도 군에서 MV가 생성되었으며 생성된 MV에서는 농도 의존적으로 PS 노출이 증가하였다. 납이 적혈구에 미치는 이러한 변화의 생리학적 중요성을 검토하고자 응고 촉진 활성 측정을 통해 납에 의한 적혈구의 thrombin 생성 증가를 관찰하였다. 이와 같은 생리학적 결과와 용혈현상과의 상관관계를 알아본 결과, 혈액응고 효소인 thrombin 생성량이 저농도에서 고농도까지 농도 의존적으로 유의성을 띄며 증가한 반면 오직 최고 농도에서만 hemolysis가 일어났다. in vitro 실험에서의 납의 효과를 실제로 In vivo 동물실험에서 확인하기 위하여 흰쥐에 납을 정맥 투여한 후에 혈액을 채취하여 적혈구의 PS 노출을 확인 하였다. 또한 납에 의해 유발되는 혈전 생성능을 직접 검토하였다. 그 결과, 납은 적혈구의 PS 노출 및 정맥 혈전 생성을 증가시킴을 확인하였다. 같은 방법으로 채취한 납에 노출된 혈액의 납에 대한 용혈 효과를 확인하고자 hemolysis와 osmotic fragility를 측정하였으며, 두 실험 모두 앞 실험에서 유의적인 증가를 보였던 PS 노출 그리고 혈전 생성과는 다르게 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 결론적으로 납은 저농도와 고농도를 포함한 모든 농도에서부터 세포 내 Ca2+및 caspase-3 증가 경로를 통해 적혈구에서 PS 노출과 MV 생성을 유도하며 이로 인해 적혈구의 응고 촉진 활성이 증가할 수 있음을 확인하였다. 이러한 일련의 반응은 적혈구의 용혈과정과는 독립된 현상임을 확인하였다. 이는 in vitro 실험과 in vivo 실험 모두에서 관찰하였다. 이에 납의 노출은 적혈구의 용혈 현상과 무관하게 혈액 응고 활성을 촉진시키며 이는 납에 의한 혈전 생성 가능성은 용혈 현상과는 독립적인 과정임을 제시한다.

적혈구생성인자 카르바모일화에 대한 아미노산과 알부민의 효과

진규복 계명대학교 2007 국내박사

말기신부전 환자에서 동반되는 빈혈은 시안산에 의한 적혈구생성인자의 활성 저하가 그 원인중의 하나로 알려져 있다. 이에 각종 아미노산, 단백질 특히 알부민을 사용하여, 시안산에 의한 적혈구생성인자에 대한 활성 억제를 방지할 수 있는 가장 효과적인 물질을 검색하고자 본 연구를 수행하였다. 적혈구생성인자와 시안산 혼합액에 20 종의 아미노산 혹은 알부민, 혈색소, globulin을 각각 첨가하여 반응시킨 후 카르바모일화로 인한 적혈구생성인자의 변형을 Western blot으로 확인하였다. 이러한 Western blot을 통한 확인결과를 바탕으로 적혈구생성인자에 대해 자유 아미노기 보존 효과가 높은 아미노산인 Phe, Val, Trp, Thr 및 Lys과 알부민을 적혈구생성인자 및 시안산 혼합액에 첨가하여 6 시간 동안 37 ℃에서 배양한 후 흰쥐에게 주사하여 적혈구생성인자의 활성을 혈색소 양, 적혈구 용적률, 적혈구 수를 통해 검정하였다. 시안산의 농도가 증가하면서 또한 시안산과의 배양시간이 증가함에 따라 적혈구생성인자의 자유 아미노기가 감소하였다. 20 종의 아미노산 중 Phe, Val, Trp, Thr, Lys 그리고 단백질 중에서는 알부민을 첨가하였을 경우에 시안산에 의한 적혈구생성인자의 변형을 막아 주었다. 적혈구생성인자를 혼합하여 흰쥐에게 주입하면 혈색소, 적혈구 용적률, 적혈구 수의 증가를 나타내었으나, 시안산과 적혈구생성인자를 혼합하여 흰쥐에게 주입하면 혈색소, 적혈구 용적률, 적혈수의 증가가 나타나지 않았다. 적혈구생성인자와 시안산 혼합물에 Phe, Val, Trp, Thr, Lys 및 알부민을 각각 첨가 하였을 경우 알부민과 Lys이 시안산에 의한 적혈구생성인자 활성의 감소를 방지하여 혈색소, 적혈구 용적률, 적혈구 수의 증가를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 염기성 아미노산인 Lys과 알부민의 적절한 보충은 적혈구생성인자 활성의 감소를 방지하여 신부전 환자의 빈혈 방지에 일조를 할 수 있을 것으로 생각된다. Patients with chronic renal failure have a hematological complication such as anemia. The anemia in these patients is resulted from inadequate production of erythropoietin in kidney and decreased activity of the erythropoietin. The decreased activity of the erythropoietin is caused the presence of inhibitors for erythropoietin in the plasma of the patients. Recent studies revealed that cyanate, a potential uremic toxin formed spontaneously from urea increases as renal function decreased, is an inhibitor of erythropoietin. Erythropoietin lose its biologic activity by cyanate which is negatively charged. In this study, the protective effects of amino acids which have positively charged amino groups and albumin which binds several toxins were studied. The degree of the erythropoietin structure by cyanate was measured by trinitrobenzenesulphonate reaction and Western blot. The loss of the biological activity of the erythropoietin by cyanate was measured by the injection of the erythropoietin to the rats. The free groups in erythropoietin were decreased under the cyanate with time-dependent and concentration-dependent manner. Phenylalanine, valine, tryptophan, threonine, and lysine among the 20 amino acids prevented the structural modification of the erythropoietin by cyanate under the Western blot analysis. And albumin among the three proteins prevented the structural modification. Lysine and albumin prevented the loss of the biological activity in rats. The results of this study suggest that lysine and albumin may play a protective role against anemia in patients with chronic renal failure.

赤血球膜의 Insulin 結合能

박병주 全南大學校 大學院 1983 국내석사

赤血球膜에 insulin結合能이 있음은 잘 알려진 事實이지만 지금까지 大多數의 硏究에 있어서는 赤血球膜 代身 赤血球自體를 對象으로 하여 insulin 結合能을 測定하였다. 本 硏究에 있어서는 保管에 있어서 赤血球보다 더 安定한 赤血球膜을 insulin結合能 檢査에 使用할 수 있는가를 알고자 사람 赤血球와 이로부터 分離한 赤血球膜의 insulin 結合特性을 比較하였다. 赤血球膜의 insulin 結合能은 反應速度와 最適 pH에 있어서 赤血球의 境遇와 同一하였다. Scatchard分析에 依하여 얻어진 特異的 結合部位이 結合定數와 結合部位의 數는 赤血球와 赤血球膜에서 各各 2.7×10^9M^-1, 4 receptor sites/cell 과 2.3×10^9M^-1, 4 receptor sites/cell로 비슷하였으나 非特異的(low specific) 結合部位의 數는 赤血球의 境遇 53 recepter sites/cell, 赤血球膜에서는 40 receptor sites/cell로 計算되었다. 이와 같은 實驗成績으로 미루어 보아 赤血球膜의 insulin結合能은 原赤血球의 insulin 結合能과 비슷함을 알 수 있으며 赤血球膜의 保存이 赤血球보다 더 安定하므로 赤血球膜이 長期間의 insulin receptor 硏究에 더 適合하리라 示唆되었다. Insulin binding characteristics of isolated human erythrocyte membranes were compared with those of original intact erythrocytes. The erythrocyte membranes shared the same kinetics and pH optima of insulin binding reaction with the original cells. Scatchard analysis of the binding data showed the presence of two major classes of binding sites: high-specific and low-specific binding sites. The association constant (Ka) and number of binding sites of high-specific one were found to be 2.7×10^9M^-1 and 4 sites/cell in erythrocyte, and 2.3×10^9M^-1 and 4 sites / cell in the membrane fraction. The number of low-specific binding sites was slightly decreased in the membrane fraction (40 sites / cell) compared with that of original erythrocytes (53 sites / cell). These results indicate that the insulin binding of erythrocyte membrane is similar to insulin binbing of the original erythrocytes, and suggest that being more stable on storage, erythrocyte membrane may be preferable to whole red cells for long-term insulin receptor studies.

일부지역 노인성 치매 환자군의 임상적 빈혈 요인에 따른 빈혈 유병율의 통계적 분석

황미향 동의대학교 대학원 2020 국내석사

Dementia is defined as a condition that involves memory, linguistic competence, thinking, and temporal and spatial recognition impairments, deterioration in executive ability, and a gradual decline in the cognitive function, interfering with daily or social life. Anemia is a condition causing hypoxia due to insufficient supply of blood necessary for tissues and is manifested as decreased oxygen transfer in blood, as a decreased volume of red blood cells (RBCs), and as hemoglobin concentration variation. Senile anemia is connected with a decrease in RBC production and a the lack of oxygen supply which many cause brain atrophy. This study performed a statistical analysis of the anemia prevalence by the clinical factors for anemia in a population of senile dementia patients in a region of Busan. A retrospective study was conducted using the medical records in the dementia group (N=200) and the control group (N=200) among the patients aged 65-94 who visited H Hospital in Haeundae-gu between November 2018 and February 2020. The control group only took blood test for RBC, Hb, HCT, MCV, MCH, MCHC, and RDW and the group of the patients diagnosed with dementia through CERAD-K took blood test for RBC, Hb, HCT, MCV, MCH, MCHC, and RDW and brain CT. The dementia group (116; 58.0%) was analyzed to have decreased RBC than the control group (81; 40.5%), with a statistically significant difference of 35 patients (17.5%) ( p =0.002). The dementia group was statistically significantly than the control group to have mild Hb (67 [33.5%] and 44 [22.0%], respectively) and moderate Hb (28 [14.0%] and 22 [11.0%]) ( p =0.029). The dementia group (128; 64.0%) was to have low HCT than the control group (91; 45.5%), with a statistically significant difference of 37 patients (18.5%) ( p =0.002). As for the correlation between dementia and anemia, the dementia group (96/200; 48.0%) was more likely to have anemia than the control group (67/200; 33.5%), with a statistically significant difference of 28 patients (14.5%) ( p =0.003). As for anemia by such clinical factors as RBC, Hb, and HCT in the population of senile dementia patients in this study, the dementia group was statistically significantly more likely to have anemia than the control group. Although this study did not the cover the causes of the higher level frequency of anemia in the dementia group, it found correlation between the condition of dementia and anemia and indicated that anemia management could be an important clinical factor in keeping dementia patients healthy. 치매는 뇌 기능 손상으로 인해 기억력, 언어능력, 사고력, 시공간 장애와 더불어 실행능력 저하와 인지기능이 점차적으로 저하되어 일상생활이나 사 회생활에 지장을 주는 것으로 정의된다. 빈혈은 조직에 필요한 산소를 혈액이 충분히 공급하지 못해 저산소증을 야 기 시키는 질환으로 혈액 중 산소 운반능의 감소, 적혈구 부피의 감소를 나 타내고 혈색소 농도의 변화로써 나타난다. 노인의 빈혈은 적혈구 생성 감소 와 연관이 되며 혈액이 모세혈관에 들어가기 어렵기 때문에 뇌에 산소 공급 이 충분하지 못해 뇌의 위축을유발 할 수 있다. 본 연구는 노인성 치매환자에 있어서 빈혈 요인에 따른 일부 지역 빈혈 유 병율을 통계적으로 분석하여 빈혈과 치매와의 상관관계를 연구하고자 하였다. 연구 대상자는 해운대구 소재 한 지역 병원에 2018년 11월부터 2020년 2 월까지 내원한 환자 중 65세∼94세까지 노인 400명을 대상으로 의무기록을 통한 후향적인 연구를 실시하였다. 연구대상 400명은 치매로 진단받은 치매 군 200명과 대조군 200명으로 구분하였다. 대조군에서는 혈액검사 항목인 적혈구(red blood cell, RBC), 헤모글로빈(hemoglobin, Hb), 적혈구 용적율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscula volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소(mean corpuscula hemoglobin, MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 적혈구 용적 분포(red cell distribution width, RDW)를 실시하였고 치매군에서는 신경심리평가인 CERAD-K (Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease Assessment Packet) 진단 방법으로 치매확진을 받은 자로 혈액검사 RBC, Hb, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW와 brain computerized tomography를 실시하였다. 대조군과 치매군의 적혈구를 분석한 결과에서 정상보다 낮은 적혈구 수를 가진 대조군은 81명(40.5%), 치매군은 116명(58.0%)로 분석되었다. 정상보다 낮은 적혈구를 수를 가진 치매군은 대조군보다 35명(17.5%)로 더 많았다. 치 매군과 대조군 두 군간의 정상보다 낮은 적혈구 수가 통계적 유의한 차이를 보였다( p =0.002). 적혈구의 정상 범위는 여성 4.0∼5.4×106/㎕, 남성 4.3∼6.3 ×106/㎕로 평가했다. 대조군과 치매군의 헤모글로빈 농도를 분석한 결과에서 헤모글로빈 농도 가 경도인 대조군은 44명(22.0%), 치매군은 67명(33.5%), 헤모글로빈 농도가 중등도인 대조군은 22명(11.0%), 치매군은 28명(14.0%)로 분석되었다. 치매 군과 대조군 두 군간의 경도의 헤모글로빈의 농도가 통계적으로 유의한 차 이를 보였다( p =0.029). 경도의 헤모글로빈 농도의 정상범위는 여성 11.0 g/㎗ 이상 12.0 g/㎗ 미만, 남성 11.0 g/㎗ 이상 13.0 g/㎗ 미만, 중등도 헤모글로 빈 농도는 여성과 남성에서 8.0 g/㎗ 이상 11.0 g/㎗ 미만으로 평가했다. 중 증의 헤모글로빈 농도는 여성과 남성에서 8.0 미만일 때를 평가했다. 대조군과 치매군의 낮은 적혈구 용적율를 분석한 결과에서 대조군은 91명 (45.5%), 치매군은 128명(64.0%)로 분석되었다. 치매군은 대조군보다 낮은 적혈구 용적율에서 37명(18.5%)의 더 많았다. 치매군과 대조군 두 군간의 낮은 적혈구 용적율이 통계적으로 유의한 차이를 보였다( p <0.001). 적혈구 용적율의 정상 범위는 여성 36% 이상, 남성 39% 이상으로 평가하였다. 대조군 200명 중 빈혈군은 67명(33.5%), 치매군 200명 중 빈혈군은 96명 (48.0%)로 상관관계를 분석한 결과이다. 치매군은 대조군보다 빈혈유병율이 28명(14.5%) 더 많았다. 치매군내 빈혈군과 치매군내 빈혈군 두 군간의 빈 혈유병율은 통계적으로 유의한 차이를 보였다( p =0.003). 따라서 대조군인 일부 지역의 노인 환자를 치매 환자군의 임상적 빈혈 요인 인 적혈구 수, 헤모글로빈, 적혈구 용적율에 따라 빈혈을 분석한 결과 대조군 보다 치매군에서 빈혈 유병율이 통계적으로 유의하게 높게 나타났다. 이 연구에서 치매군의 빈혈 유병율이 높은 원인에 대해서 조사하지 못한 한계는 있지만, 치매질병과 빈혈과의 상호 연계성이 있다는 결과로 빈혈관 리가 치매환자의 건강을 유지하는데 중요한 임상적 요인이 된다는 것을 제 시한다.