Alteration of Xanthophyll Cycle by Silencing of Thioredoxin m Gene (OsTrxm) in Rice (Oryza sativa) Plants

Yu, Miao 부산대학교 2013 국내석사

벼 (Oryza sativa L.)의 WT Japonica type Dongjin-byeo (DJ) 개체 와 thioredoxin m RNA interference 돌연변이 개체(Ostrxm RNAi)를 이용해서 thioredoxin m이 xanthophyll 회로를 조절하는 것을 연구했다. 강한 광선 하에서 WT와 Ostrxm RNAi 식물체에서의 zeaxanthin (Zea)의 축적량은 비슷하다. 하지만 3 시간 동안 암처리 한 후에는 Ostrxm RNAi의 Zea epoxidation의 속도가 WT 개체보다 많이 느려진 것을 확인하였다. Zea이 antheraxanthin (Ant)으로 변하는 단계는 Ant이 violaxanthin (Vio)으로 변하는 단계에 비해 더 억제되었다. Reactive oxygen species (ROS)에 대한 조직 화학적 분석을 한 결과, 강한 광선 하에서 hydrogen peroxide (H2O2)와 superoxide (O2•-)가 WT 개체보다 Ostrxm RNAi의 잎에서 더 많이 축적되었다는 것을 알 수 있었다. 100, 200, 300 mM의 농도범위에서 H2O2를 처리한 결과 300 mM의 농도에서 in vitro Zea epoxidation의 속도가 느려진다는 것을 확인하였다. 강한 빛으로 조사한 시간을 연장한 것과 Zea epoxidation를 억제한 것이 정비례가 되었다. 이 것이 Ostrxm RNAi 식물체에서만 발견되고 WT에서는 발견하지 않았다. Trx m이 없는 Ostrxm RNAi 식물체에서는 antioxidant 효소를 비활성화시킨 후 ROS를 많이 축적하기 때문에 Zea epoxidation를 억제하는 기능성이 굉장히 높은 것으로 보인다. The possible regulation of xanthophyll cycle by thioredoxin m was studied using rice (Oryza sativa) wild type (WT) and its thioredoxin m RNA interference mutant plants (Ostrxm RNAi). During illumination of high light, the rate of zeaxanthin (Zea) accumulation was similar between the two plants, but the rate of its epoxidation in darkness for 3 h in Ostrxm RNAi was much slower than that of WT. Interestingly, the epoxidation step from Zea to antheraxanthin (Ant) was more significantly depressed than that of Ant to violaxanthin (Vio). Histochemical assays of reactive oxygen species revealed that both of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2•-) accumulated more in the leaves of Ostrxm RNAi compared with those of WT. During high-light illumination, increasing the time of HL-illumination lead to accumulated more ROS. Treatment of H2O2 up to 300 mM could reduce the rate of in vitro Zea epoxidation. Increasing the time of per-illumination lead to increase the percentage of decreasing of Zea in direct proportion. It was observed in Ostrxm RNAi, but not in WT. The possible inhibition of Zea epoxidation by the accumulated ROS was suggested to result from the blockage of activation process of antioxidant enzymes in Ostrxm RNAi plants.

유전자 편집 전분화능줄기세포의 테트라사이클린-조절 시스템이 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포로의 분화 과정 중 보이는 유전자 침묵(gene silencing)에 관한 연구

최명훈 차의과학대학교 일반대학원 2024 국내석사

유도만능줄기세포(iPSC)는 체세포를 재프로그래밍해 배아와 유사한 전분화 능력을 갖는 세포로, 재생의학 및 세포치료 분야에서 획기적인 돌파구를 제공하고 있다. iPSC는 조혈모세포(HSC), 내피세포(EC), 신경전구세포(NPC) 등 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있어, 유전자 편집 및 맞춤형 세포 치료제 개발에 중요한 플랫폼으로 주목받고 있다. 그러나 유도만능줄기세포를 분화시키는 과정에서 도입된 형질전환 유전자가 발현되지 않는 유전자 침묵(transgene silencing) 현상은 세포 치료제의 효능과 안전성에 큰 도전 과제로 작용한다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 AAVS1 safe harbor locus에서 유전자 편집을 수행한 유도만능줄기세포를 다양한 세포 계통으로 분화시키고, 분화 과정에서 발생하는 유전자 침묵 현상을 분석하였다. 특히, 테트라사이클린 유도성 시스템을 형질도입한 유도만능줄기세포에서 분화 후 특정 시점에 유전자가 침묵되는 현상을 확인하였으며, 이러한 침묵 현상이 세포 유형 및 분화 경로에 따라 달라지는 것을 관찰하였다. 이를 해결하기 위해 소디움 뷰티레이트(sodium butyrate) 및 아자시티딘(azacitidine)과 같은 후성유전학적 저분자 억제제를 처리하여 유전자 침묵을 완화하고, 분화된 세포에서 안정적인 유전자 발현을 유지하는 전략을 탐구하였다. 이 연구는 유도만능줄기세포의 유전자 편집 및 분화 과정에서 발생하는 후성유전학적 변화와 유전자 발현 패턴을 심층적으로 분석하고, 유전자 침묵을 극복하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 이러한 접근은 유전자 편집 유도만능줄기세포 기반의 세포 치료제 개발 및 임상 적용에서 신뢰성과 효율성을 높이는 데 기여할 것으로 기대된다. 나아가, 본 연구는 후성유전학적 조절 기법을 활용해 유전자 발현을 장기적으로 유지하고, iPSC 기반 맞춤형 치료제 개발을 가속화하는데 중요한 기반을 마련한다. 핵심되는 말: 유전자 편집, 테트라사이클린 유동성 시스템, 유전자 침묵, 유도만능줄기세포, 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포, 소디움 뷰티레이트, 아자시티딘 Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized the fields of regenerative medicine and cell therapy by providing a virtually unlimited source of cells capable of differentiating into various lineages, including hematopoietic stem cells (HSCs), endothelial cells (ECs), and neural progenitor cells (NPCs). iPSCs play a pivotal role as platforms for gene editing and the development of personalized cell-based therapies. However, transgene silencing during differentiation remains a significant challenge, potentially compromising the efficacy and safety of cell therapies. In this study, we utilized the CRISPR/Cas9 system to perform gene editing at the AAVS1 safe harbor locus in iPSCs and analyzed transgene silencing during their differentiation into various cell lineages. Notably, we observed transgene silencing in iPSCs with a tetracycline-inducible system following differentiation, with suppression patterns varying depending on cell type and differentiation pathways. To address this issue, we investigated the use of epigenetic small-molecule inhibitors such as sodium butyrate and azacitidine to mitigate gene silencing and maintain stable transgene expression in differentiated cells. This study provides a comprehensive analysis of epigenetic changes and gene expression patterns during the differentiation of gene-edited iPSCs, offering new insights into overcoming transgene silencing. Our findings are expected to enhance the reliability and efficiency of gene-edited iPSC-based cell therapies in clinical applications. Furthermore, this research lays the foundation for long-term maintenance of transgene expression through epigenetic regulation, accelerating the development of personalized iPSC-based therapeutics for a wide range of diseases. Key words: Gene editing, tetracycline-inducible system, transgene silencing, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, endothelial cells, neural progenitor cells, sodium butyrate, azacitidine

Investigation on Therapeutic Nucleic Acids Delivery System Using Fusion Peptide-based Self-assembled Complex for Gene Therapy

Yeong Chae Ryu 인천대학교 대학원 2024 국내박사

Gene therapy is a transformative approach that introduces therapeutic nucleic acids, including DNA and RNA, to address genetic anomalies responsible for intractable diseases at their molecular foundation. The FDA’s recent endorsement of short interfering RNA treatments, the ascendance of messenger RNA vaccines amidst the COVID-19 pandemic, and the advancements in CRISPR/Cas9 gene editing technology are notable not just for earning Nobel distinctions but also for their immense prospective market value. Such potential is fueling intensive research efforts in these domains. For successful gene therapy strategies, such as gene silencing or gene editing, functional nucleic acids must navigate various intracellular obstacles to reach their target cells effectively. Entry into the cell necessitates crossing the cell membrane, followed by their release from endosomes/lysosomes into the cytosol. DNA, distinct from RNA, requires further transport into the nucleus. Nucleic acids, given their size and the negative charge stemming from their phosphate backbone and phosphodiester bonds, inherently display hydrophilic properties. These characteristic challenges their ability to interact with the cell’s lipid bilayer membrane. For RNA-based approaches, there’s an added emphasis on the need for safety-enhancing technologies. In light of these challenges, there’s a pressing need to develop technologies that ensure the efficient and secure intracellular delivery of these functional nucleic acids. In this research, while examining the elements of the gene delivery system, the focus was placed on two innovative approaches for gene silencing and gene mutation. These approaches employed fusion methodologies with peptides characterized as non-viral vectors and utilized system strategies rooted in self-assembled complexes. In the first study, a novel small RNA (sRNA)/fusion peptide complex was devised, incorporating a fusion peptide that merges two distinct cell-penetrating peptides (CPPs) for the efficient and safe intracellular delivery of sRNA, leveraging the RNA interference mechanism to initiate gene silencing. Each of these peptides effectively traverses the cell membrane through unique mechanisms. While prior research predominantly utilized a skin permeating and cell entering (SPACE) peptide centered on its covalent association with siRNA, standalone cationic peptides encountered limitations in nucleic acid complex formation and delivery efficacy. Addressing these challenges, our team devised a fusion peptide that combines the SPACE peptide with a cationic oligoarginine sequence. This innovation facilitated the development of self-assembled complexes, grounded in electrostatic interactions with sRNA. As the result, the sRNA/fusion peptide complex demonstrated superior efficiency in complex formation compared to standalone cationic peptides. This enhanced performance can be attributed to the utilization of multiple non-covalent interactions, encompassing electrostatic, hydrophobic, and hydrogen bonds. In a serum environment, the complex not only bolstered the stability of sRNA but also outperformed both standalone peptide complexes and commercial liposomes in terms of sRNA delivery to various cell lines, including HeLa, HDFn, and RAW 264.7. Specifically, in HeLa and RAW 264.7 cells, the complex managed to suppress the target gene’s mRNA expression by 61.3% and 66.2%, respectively, showing results on par with Lipofectamine. Investigations into the cellular uptake pathway of the complex revealed lipid-mediated endocytosis as the predominant mechanism. Furthermore, in vivo tests substantiated the complex’s increased stability post-local injection, alongside notable downregulation of the target gene expression. In the second study, our objective was to efficiently deliver large plasmid DNA to facilitate the expression of the CRISPR genome editing tool. To this end, a peptide-assisted lipoplex (PAL) was established as a novel complex using a lipoplex with a fusion peptide that integrates a nuclear localization signal (NLS) and CPP. However, commercial liposomes faced challenges in efficiently encapsulating larger plasmids. Their inability to neutralize the pronounced negative charge of DNA culminated in compromised stability and reduced efficiency in nuclear entry of these complexes. It is also noteworthy that while electroporation is a prevalent method for delivering large plasmids, it frequently induces cellular damage, underscoring the pressing need for more benign alternatives. This PAL system notably enhanced the ability to neutralize the negative charge of the plasmid, resulting in a more stable complex formation. When benchmarked against electroporation, PAL achieved a 2-fold and 1.6-fold increase in delivery efficiency for 9,283 bp and 29,350 bp plasmids, respectively. Furthermore, it elevated cell viability and activity by an impressive 29-fold. Across diverse cell lines, PAL outperformed conventional lipoplexes, delivering plasmids with 2- to 4.4-fold greater efficiency. In an in vivo mouse study, the expression of cells with the PAL-introduced plasmid was maintained for up to 3 days. Impressively, when PAL encapsulated a Cas9 plasmid targeting overactive cancer genes, including the CRISPR RNA, it achieved a mutation efficiency of up to 44.1% in the targeted genes. When used synergistically with chemotherapy, this approach hindered tumor growth in a mouse tumor model. In essence, our work pioneers a fusion peptide-centric complex, offering a promising avenue in gene therapy delivery that balances both efficacy and safety. In summary, our research successfully pioneered two distinct systems: (1) an sRNA/fusion peptide complex for gene silencing, and (2) a fusion peptide-assisted lipid complex tailored for the delivery of large plasmids. Merging high efficiency with safety, these systems have demonstrated exceptional capabilities in gene silencing and gene editing through the effective delivery of small RNA and large plasmids, respectively. These achievements underscore the promising potential of advanced gene delivery platforms, setting the stage for potential treatments of a wide range of genetic disorders in the coming years. 유전자 치료는 치료적 효능을 가진 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 외부에서 주입하여 난치병의 원인이 되는 유전적 결함을 분자 수준에서 근본적으로 치료할 수 있는 방법이다. 최근 FDA 승인을 획득한 짧은 간섭 RNA 치료제, COVID-19 팬데믹으로 인해 널리 알려진 mRNA 백신, 그리고 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술은 모두 노벨상을 수상했을 뿐 아니라 미래의 거대한 유전자 치료제 시장의 잠재력을 가지고 있어 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 유전자 침묵이나 유전자 편집과 같은 유전자 치료 전략을 실행하는 기능적 핵산은 목표 세포에 전달되어 효과를 나타내기 위해 여러 세포 내 장벽을 통과해야 한다. 세포 내로의 진입을 위해서는 세포막을 통과하고, 세포 내에서는 엔도좀/리소좀에서 세포기질로 방출되어야 하며, DNA의 경우 RNA와는 다르게 핵 내로까지 전달되어야 한다. 그러나 핵산은 대형 분자로, 뉴클레오티드의 인산 골격과 인산다이에스터 결합 사이의 인산기로 인해 강한 음전하를 가진다. 이러한 특성은 핵산이 친수성을 갖게 하며 인지질 이중층 구조를 가진 세포막과의 상호작용을 방해한다. 또한 RNA의 경우 세포 내에서 분해에 취약하므로 안정성을 향상시킬 수 있는 기술이 필요하다. 이러한 도전을 극복하기 위해 기능적 핵산의 효율적이며 안전한 세포 내 전달을 지원하는 기술 개발을 필요로 하게 되었다. 본 연구에서는 이러한 유전자 전달 시스템의 구성 요소를 고려하여, 비바이러스성 벡터로 분류되는 펩타이드의 융합 전략과 자기조립 복합체를 이용한 제형 전략을 활용하여 유전자 침묵 및 유전자 편집을 위한 두 가지의 새로운 시스템을 중점적으로 연구하였다. 첫 번째 연구에서는 RNA 간섭 메커니즘을 활용하여 유전자 침묵을 유도하는 짧은 RNA (siRNA, shRNA)의 효율적이고 안전한 세포 내 전달을 목표로, 고유한 메커니즘을 통해 세포막을 효과적으로 투과할 수 있는 두 종류의 세포 투과성 펩타이드를 융합한 혁신적인 융합 펩타이드를 개발하였다. 기존 연구에서 단일 SPACE (skin permeating and cell entering) 펩타이드는 짧은 간섭 RNA와의 공유 결합을 중심으로 활용되었으며, 단독으로 사용된 양이온성 펩타이드는 핵산과의 복합체 형성 및 전달 효율에 한계가 있었다. 이에 따라 본 연구에서는 SPACE 펩타이드와 양이온성 올리고아르기닌 서열을 융합한 새로운 융합 펩타이드를 설계하여, 짧은 RNA와의 전기적 상호작용을 기반으로 한 자기조립 복합체를 생성하였다. 실험 결과, 짧은 RNA/융합 펩타이드 복합체는 전기적 상호작용 및 소수성 상호작용, 수소 결합 등의 비공유 결합을 활용하여 기존의 단독 양이온성 펩타이드보다 향상된 복합체 형성 효율을 보였다. 복합체는 혈청 환경에서 짧은 RNA의 안정성을 증가시키고 HeLa, HDFn, 그리고 RAW 264.7 등의 다양한 세포주에서 단독 펩타이드 복합체나 상용 리포좀보다 짧은 RNA의 전달 효율을 향상시켰다. HeLa와 RAW 264.7 세포에서 복합체는 표적 유전자의 mRNA 발현을 각각 61.3%와 66.2% 감소시켜, 리포펙타민과 유사한 효과를 나타냈다. 세포 내에서의 복합체 이입 메커니즘은 지질 중재 세포 내 흡수로 확인되었고, in vivo 실험에서는 국소적으로 주입된 복합체의 향상된 안정성 및 표적 유전자의 발현 저하를 확인하였다. 두 번째 연구에서는 CRISPR/Cas9 유전자 가위의 효율적인 발현을 통한 유전자 편집을 가능하게 하는 대형 플라스미드 DNA의 전달을 목표로, 핵 위치 신호 (peptide nuclear localization signal; NLS)와 세포 투과성 펩타이드를 융합한 융합 펩타이드와 리포플렉스를 조합한 복합체를 개발하였다. 상용 리포좀은 대형 플라스미드의 패키징에 한계를 보이며, DNA의 강한 음전하를 충분히 중화하지 못해 복합체의 안정성과 핵 내 투과 효율이 저하되었다. 또한 대형 플라스미드 전달에 주로 사용되는 전기천공법은 세포 손상을 유발하기 때문에 이에 대한 대체 전략의 필요성이 대두되었다. 따라서 본 연구에서는 SV40 NLS와 양이온성 올리고아르기닌 서열을 융합하여 리포플렉스에 조합한 펩타이드 보조 리포플렉스 (Peptide-assisted lipoplex; PAL)를 개발하였다. PAL은 플라스미드의 음전하 중화 능력을 향상시켰으며, 복합체 형성과 안정성 또한 강화하였다. 전기천공법에 비해 PAL은 9,283 bp 및 29,350 bp의 대형 플라스미드의 세포 전달 효율을 각각 2배 및 1.6배 증가시켰으며, 세포 생존율과 활성도를 29배 향상시켰다. 다양한 세포주에서 PAL은 기존 리포플렉스 대비 2배에서 4.4배 향상된 대형 플라스미드 전달 효율을 나타내었다. In vivo 마우스 모델에서는 3일 동안 대형 플라스미드 발현 세포를 유지시켰다. 특히, 과발현되는 암 관련 유전자를 표적으로 하는 CRISPR RNA가 삽입된 Cas9 플라스미드를 포함한 PAL의 전달은 최대 44.1%의 표적 유전자 변이 효율을 보였으며, 화학요법과 결합한 효과로 in vivo 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제하였다. 실험 결과를 통해, 본 연구의 융합 펩타이드 기반 자기조립 복합체는 유전자 치료용 핵산 전달 시스템으로서 효율성과 안전성을 겸비한 새로운 접근법을 제시하였다. 종합적으로 본 연구를 통해 제시된 (1) 짧은 RNA/융합 펩타이드 나노복합체 기반 유전자 침묵 시스템 및 (2) 융합 펩타이드 보조 지질복합체를 활용한 대형 플라스미드 전달 시스템이 성공적으로 개발되었다. 이 두 시스템은 고효율과 안전성을 결합하여 짧은 RNA 및 대형 플라스미드의 전달을 통해 각각 유전자 침묵과 유전자 편집에 탁월한 성능을 보였다. 이러한 결과는 첨단 유전자 전달 플랫폼으로의 응용 가능성을 크게 높여주어 미래에 다양한 유전적 질환 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대되었다.

벼 키다리병균 Fusarium fujikuroi의 병원형별 무성포자 형성 조절 유전자 및 병 발생 관련 유전자의 기능 연구

이상원 순천향대학교 일반대학원 2024 국내박사

우리나라 주요 작물인 벼에 키다리병(Bakanae disease)을 유발하여 심각한 경제적 손실을 초래하는 식물병원균인 Fusarium fujikuroi 는 전형적인 키다리 증상을 유발하는 키다리 병원형(elongation pathotype)과 오히려 줄기를 말려 죽이는 줄기마름 병원형(stunting pathotype)의 두 집단으로 나뉜다. 이는 F. fujikuroi 가 생성하는 이차대사산물의 종류에 따른 것으로 키다리형 균주는 gibberellin(식물 생장 호르몬), 줄기마름형 균주는 fumonisin(곰팡이독소)을 각각 병원성 인자로 가지고 있다. 본 연구에서는 F. fujikuroi 의 위와 같은 두 가지 병원형별 대표균주 B14(줄기마름형)와 B20(키다리형)을 대상으로 무성포자 형성 조절 유전자 및 병 발생 관련 유전자 기능 분석을 수행함으로써 두 병원형 집단에서 나타나는 차이를 규명하고자 하였다. 먼저, 무성포자 형성 조절 유전자가 F. fujikuroi 에서 삭제되면 무성포자 형성 능력과 병원성에 변화가 발생하였다. 예를 들어, 두 균주 모두 abaA 유전자가 삭제되면 macroconidia 와 microconidia 둘 다 전혀 형성하지 못하였다. 병원성 측면에서 흥미로운 사실은 F. fujikuroi B20 유래 laeA 유전자 삭제 형질전환체가 B14 처럼 줄기마름 증상을 유발하였다는 것이다. 이러한 결과는 F. fujikuroi B20 의 경우 평상시 LaeA 가 fumonisin gene cluster 인근 부위를 후성유전학적으로 조절하여 발현이 억제되어 있다가 laeA 유전자가 삭제되면 fumonisin 생합성 유전자 발현이 활성화될 것이라는 추정을 가능하게 한다. 다음으로 병 발생 관련 유전자의 기능 분석에서는 여러 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있는 유전자 침묵(gene silencing)의 활용을 시도하였으며, F. fujikuroi B14 의 식물 세포벽 분해 효소 여러 개를 동시에 억제하였을 때 유의미한 병원성의 감소를 확인하였다. 본 연구 결과가 F. fujikuroi 두 병원형별 균주의 병리학적, 유전학적 특성을 깊이 이해하는데 도움이 되기를 바란다.

Salmonella enterica serovar Typhimurium과 Candida albicans의 DNA 결합 단백질 변형에 따른 병원성 조절

구효정 강원대학교 대학원 2021 국내석사

piRNA에 의한 축삭 재생 억제 메커니즘 규명

유의현 한림대학교 일반대학원 2025 국내석사

piRNA는 전사 및 전사후 기전을 통해 유전자 발현을 조절하며, PIWI 단백질과 결합하여 작동하는 소형 비암호화 RNA이다. 주로 생식세포에서 연구되어 왔으나, 최근 신경 기능과 재생에서도 중요한 역할을 한다는 증거들이 제시되고 있으며, 예쁜꼬마선충에서는 신경축삭재생을 억제한다고 알려졌다. 그러나 piRNA가 어떻게 신경세포에서 신경축삭재생을 억제하는지 그 상세한 분자 기전은 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 내재성 piRNA가 신경축삭재생의 핵심 촉진 인자인 dlk-1의 전사후 조절을 통해 예쁜꼬마선충의 신경축삭재생을 억제할 것이라는 가설을 세웠다. dlk-1 유전자를 표적할 것으로 예상되는 내재성 piRNA인 21ur-189와 21ur-997을 동시에 발현시킨 결과, 신경재생능력 평가 모델인 β-스펙트린 결핍 돌연변이 조건에서 GABA성 신경세포의 신경축삭재생이 유의하게 감소함을 확인하였다. 그러나 내재성 piRNA는 적절한 cis-조절 요소를 활용하지 못해 신경세포에서의 발현이 제한적이었을 것이며, 이로 인해 그 역할을 충분히 확인하는 데 한계가 있었을 것으로 추정된다. 이에 신경세포 내에서 piRNA의 조절 기전을 규명하기 위해, 낮은 piRNA 발현 수준을 극복하고자 노력하였다. 이를 위해 신경세포 특이적 전사체 데이터에 대한 종합적 분석을 통해 신경세포에서 발현이 높은 piRNA 클러스터를 발굴하고, 신경세포에서 piRNA 기능 연구를 위한 발현 도구를 개발하였다. 이 중 하나의 클러스터를 이용해서 신경 유전자들을 표적으로 piRNAi를 활용한 유전자 침묵을 시험하였다. 그 결과, piRNA 매개 유전자 발현 억제가 표적 유전자의 발현 수준에 따라 달라짐을 관찰하였다. 높은 수준으로 발현되는 unc-119의 경우 억제 효과가 제한적으로 나타난 반면, 낮은 수준으로 발현되는 dlk-1은 결손 돌연변이와 유사할 정도로 거의 완전한 억제를 보였다. 본 연구는 piRNA가 신경축삭재생을 억제함을 규명하였다. 특히 dlk-1을 표적할 수 있는 내재성 piRNA인 21ur-189와 21ur-997이 GABA성 신경세포의 신경축삭재생을 억제하는 것을 관찰하여, PIWI-piRNA 경로가 낮은 수준으로 발현되는 유전자를 억제할 수 있음을 시사하였다. 또한, 신경세포 발현이 높은 piRNA 클러스터를 발굴하여 신경세포에서 piRNA 발현을 높일 수 있는 유용한 도구를 개발하였다. 이는 향후 신경세포 내 piRNA를 통한 유전자 침묵의 효율성을 높이는 데 기여할 수 있으며, 신경질환 치료의 잠재적 가능성을 제시하였다. 본 연구의 결과는 신경세포 내 유전자 발현 조절에서 소형 RNA 경로의 역할에 대한 새로운 통찰을 제공하며, PIWI-piRNA 경로의 분자 기전 연구 전략 및 신경축삭재생 조절 전략 개발의 기반을 마련한다. PIWI-interacting RNAs (piRNAs) are small non-coding RNAs that regulate gene expression through both transcriptional and post-transcriptional mechanisms, primarily via interactions with PIWI proteins. Although piRNAs have been extensively studied in germline cells, emerging evidence highlights their critical roles in neuronal function and regeneration. In C. elegans, piRNAs are known to inhibit axon regeneration. However, the specific molecular mechanisms by which piRNAs mediate this inhibition and the genes they regulate remain unclear. In this study, it is hypothesized that endogenous piRNAs inhibit axon regeneration in C. elegans through post-transcriptional regulation of dlk-1, a key regulator of axon regeneration. Co-expression of endogenous piRNAs, 21ur-189 and 21ur-997, predicted to target dlk-1, significantly reduced axon regeneration in GABAergic neurons under β-spectrin-deficient conditions, an established model for assessing axon regeneration capacity. However, the limited expression of endogenous piRNAs in neurons, possibly due to insufficient utilization of cis-elements, might have constrained the ability to fully evaluate their role. To elucidate the regulatory mechanisms of piRNAs in neurons, efforts were made to overcome their low expression levels. A comprehensive analysis of neuron-specific transcriptome data identified novel neuronal piRNA clusters, and expression tools were developed to study piRNA function in neurons. Using one of these clusters, piRNAi-mediated gene silencing targeting neuronal genes were tested. Notably, piRNA-mediated gene silencing was found to be influenced by the expression level of the target genes. While the highly expressed unc-119 showed limited suppression, the lowly expressed dlk-1 exhibited nearly complete inhibition comparable to null mutations. This study demonstrates that piRNAs suppress axon regeneration in neurons. Specifically endogenous piRNAs 21ur-189 and 21ur-997, which target dlk-1, inhibit axon regeneration in GABAergic neurons, highlighting the ability of the PIWI-piRNA pathway to effectively regulate lowly expressed genes. Additionally, neuronally enriched piRNA clusters were identified, and tools to enhance piRNA expression in neurons were developed, potentially improving the efficiency of piRNA-mediated gene silencing and offering therapeutic applications. These findings provide novel insights into small RNA-mediated gene regulation in neurons and establish a foundation for investigating molecular mechanisms of the PIWI-piRNA pathway and developing strategies to modulate axon regeneration.

Targeted Treatment of Cancers Linked with BRCA1 Mutations Based on Double-Strand Breaks Induced by CRISPR/Cas9 and on Gene Silencing of Ku70 and/or Rad51

구심정 경희대학교 대학원 2023 국내석사

CRISPR/Cas9 시스템은 제3세대 유전자 가위로 알려져 있으며, DNA 절단 및 유전자 편집 분야에서 혁신을 이루어낸 기술이다. CRISPR/Cas9 시스템은 목표로 하는 유전자의 특정한 DNA 서열을 인식하는 sgRNA(single-guide RNA)와 Cas9 핵산분해효소를 이용하여 표적 유전자의 이중가닥절단(DSB, double-strand break)를 유도한다. 하지만 세포 내에서 CRISPR/Cas9 시스템이 돌연변이가 일어난 특정 서열을 인식하고 잘라내도 이중가닥절단은 Ku70이 관여하는 비상동말단결합(Non-homologous End Joining, NHEJ)과 Rad51이 관여하는 상동재조합(Homologous Recombination, HR) 기작을 통하여 복구될 수 있다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 돌연변이 BRCA1 유전자에 특이적인 이중가닥절단과 Ku70 및 Rad51 침묵화(silencing)를 조합하였다. shRNA는 Ku70와 Rad51 각각의 mRNA에 상보적으로 설계되어 이중가닥절단의 복구를 막아 세포 사멸을 유도하게끔 한다. BRCA1 유전자의 돌연변이가 높은 유방암 발병률과 관련이 있음을 고려했을 때, 본 연구가 돌연변이 BRCA1 유전자를 가진 유방암 세포에 특이적인 새로운 치료법에 대한 접근이 되기를 희망한다. CRISPR/Cas9 system is known as a third-generation genetic scissors and as an innovation in the fields of DNA cleavage and gene editing. In general, CRISPR/Cas9 system leads to a double-strand break (DSB) of the target gene by Cas9 nuclease of which the cleavage site of the target gene is recognized by sgRNA (single-guide RNA). In cells, however, although CRISPR/Cas9 system can be used to specifically recognize and break mutated genes of interest, the resulting DSB may be repaired by Ku70-based non-homologous end joining (NHEJ) and/or Rad51-based homologous recombination (HR). In this study, mutated BRCA1-specific CRISPR/Cas9-induced DSB was combined with gene silencing of Ku70 and/or Rad51, for which the shRNA sequences were designed to be complementary to the mRNAs of Ku70 and Rad51, respectively. in order to prevent DSB from being repaired for DSB-induced cell death. We hope that this approach will lead to methods development of a novel targeted treatment of breast cancer cells only with BRCA1 mutation, in consideration of high breast cancer incidence rate linked with the gene mutation.

ATF4-Mediated Cysteine Metabolism Is Associated with c-MYC mRNA Translation through AGO2 S-Sulfhydration

이지원 강릉원주대학교 일반대학원 2023 국내석사

Cancer metabolic reprogramming is one of the hallmarks of cancer. A typical example is the aerobic glycolysis, known as the Warburg effect, which is promoted to meet high demand for growth and survival of cancer cells. However, glucose is not sufficiently present in the tumor microenvironment, therefore cancer cells must rewire their metabolism for rapid adaptation to limited presence of glucose. Here, I report that glucose deprivation shifts metabolism toward the cysteine metabolism by activating transcription factor 4 (ATF4) which is known to coordinate signals from metabolic stress such as amino acid scarcity. I observed that ATF4 expression is induced under the low level of glucose and promotes the upregulation of cysteine metabolic enzymes, 3-mecaptopyruvate sulfurtransferase (MPST) and Solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11; also known as xCT, cystine/glutamate transporter), for adapting to energy stress possibly by MPST-mediated pyruvate production. Interestingly, MPST has been known to produce hydrogen sulfide (H2S) as a by-product in conversion of 3-mercaptopyruvate to pyruvate. However, very little is known about how MPST-H2S axis influences growth and migration of cancer cells under metabolic stress. In this study, I focused on the aspect of H2S produced by MPST and investigated its involvement in acquiring cancer traits such as migration. Micro-RNAs (miRNAs) are functional small RNA molecules that silence gene expression at post-transcriptional level. Although many genes involved in cellular metabolism are targeted by miRNAs, it has not been intensively studied whether altered metabolic processes influence miRNA-mediated gene expression resulting in cancer progression. I report here that H2S generated through cysteine metabolism influenced c-MYC, proto-oncogene, mRNA translation and induced cancer cell migration. Mechanistically, H2S induced S-sulfhydration of AGO2, a central player in miRNA-induced gene silencing. I observed that S-sulfhydrated AGO2 is translocated into the nucleus which may cause reduced interaction of AGO2 and mature miRNA in the cytoplasm. As a proof of concept, c-MYC, a target gene of let-7b miRNA, was upregulated at post-transcriptional level in the condition where AGO2 sulfhydration is induced, eventually promoting cancer cell migration. These findings suggest a novel mechanism by which increased cysteine metabolism upregulates c-MYC mRNA translation by modulating AGO2 function and such has potential as a therapeutic target in cancer. 암 대사 재프로그래밍 (Cancer metabolic reprogramming)은 암 특징들 (hallmarks of cancer) 중 하나이다. 대표적인 예로 와버그 효과 (Warburg effect)라고 알려진 호기성 해당과정 (aerobic glycolysis)은 암세포의 성장과 생존에 유리하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 포도당 (Glucose)은 종양 미세 환경 (Tumor microenvironment)내에 충분히 존재하지 않기 때문에, 암세포는 제한된 포도당 환경에 빠르게 적응하기 위해 세포의 대사과정을 변화시킨다. 본 연구에서는 포도당 결핍 상황에서 아미노산 결핍과 같은 대사 스트레스의 신호를 인지하는 전사 인자인 Activating transcription factor 4 (ATF4)에 의해 시스테인 대사로 전환됨을 확인하였다. 포도당 결핍 시 ATF4 발현이 증가하고 시스테인 대사 효소인 3-Mecaptopyruvate sulfurtransferase (MPST)와 Solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11 ; 또는 xCT) 을 상향조절을 확인하였고 이는 MPST-매개 피루브산 (pyruvate)을 통해 대사 스트레스에 적응함을 암시한다. MPST는 3-mecaptopyruvate를 pyruvate로 전환함으로써 부산물로 황화수소 (Hydrogen sulfide; H2S)를 생성하는 것으로 알려져 있다. 하지만 대사 스트레스 하에서 MPST-H2S가 암세포의 성장과 이동에 어떻게 영향을 미치는지는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는, MPST에 의해 생성된 H2S에 초점을 맞추고 세포 이동성과 같은 암 특성의 변화를 확인하였다. Micro-RNAs (miRNAs)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 침묵시키는 기능을 하는 작은 RNA 분자이다. 세포 대사에 관여하는 많은 유전자들이 miRNA의 표적이 되지만, 변경된 대사 과정이 miRNA-매개 유전자 발현에 영향을 주어 암 진행을 유도한다는 연구는 부족하다. 본 논문에서는 시스테인 대사를 통해 생성된 H2S가 종양유전자인 c-MYC mRNA 번역에 영향을 미치고, 이로 인해 세포 이동성이 촉진됨을 관찰하였다. 분자적 기작으로는, H2S는 miRNA-유도 유전자 침묵 (miRNA-induced gene silencing; RISC)의 중심 역할을 하는 AGO2의 황-황화 (S-sulfhydration)를 유도하고, 황-황화된 AGO2는 세포질에서 핵으로 이동하여 AGO2와 miRNA와의 결합력을 감소시킨다. 이로 인해 AGO2 황-황화가 유도되는 조건에서 let-7b miRNA의 표적유전자인 c-MYC mRNA의 번역은 상향조절되고 결국 암 세포 이동을 촉진한다. 이러한 발견은 증가된 시스테인 대사가 AGO2 기능을 조정하여 c-MYC mRNA의 번역을 상향 조절하는 새로운 메커니즘을 제시하고 이것은 암세포 치료 표적으로서의 가능성을 지니고 있다.

shRNA-directed silencing of remorin genes by U6 promoter in relation to nodule and Arbuscular mycorrhiza formation in Medicago truncatula

김군보 서울대학교 대학원 2009 국내박사

Plant Protection from Viral Infection through the Application of Double-Stranded RNA in Nicotiana Benthamiana

윤정연 서울대학교 대학원 2021 국내석사

RNA interference (RNAi) is a regulatory mechanism of gene expression mediated by small RNAs. By using the RNAi technique, exogenous double-stranded RNA (dsRNA) designed to target mRNA, suppresses target gene expression levels in plants. In this study, we adopted the RNAi mechanism as a tool to protect plants from viruses. We designed and synthesized several dsRNAs targeting the pepper mottle virus (PepMoV) genes, helper component-proteinase (HC-Pro) and nuclear inclusion b (NIb). When used on Nicotiana benthamiana plants, these dsRNAs protected the plant against viral infection over a specific period. By optimizing dsRNA and virus injection time, the protection efficiency of dsRNA by targeting virus genes could be maximized. It seems that exogenous dsRNA-derived RNA-induced silencing complex was able to defend the host against viral infection instantly. Furthermore, each dsRNA designed to target different regions within a transcript had varying levels of effects on virus survival in the host plants. When targeting the middle part of both the NIb and HC-Pro genes using the dsRNAs, the highest viral growth inhibitory effect was observed. An RLM-5′ RACE was performed using plant leaves infected with PepMoV after dsRNA treatment and it was observed that most of the mRNA cleavages occurred close to the 3′ part within the dsRNA target position on the mRNA. These results suggest that the dsRNA tool can be used as a plant vaccine platform for crop protection. RNA간섭은 small RNA에 의해 유전자의 발현이 조절되는 현상이다. mRNA를 표적하는 double-stranded RNA (dsRNA) 의 처리로 RNA 간섭 현상을 일으킬 수 있으므로, 외래합성 dsRNA는 식물체 내 표적 유전자의 발현 수준을 억제하기 위해 사용된다. 본 연구에서는 바이러스로부터 식물을 보호하기 위해 RNA 간섭 현상을 이용한다. Pepper mottle virus (PepMoV)의 helper-component-proteinase (HC-pro) 유전자와 nuclear inclusion b (NIb) 유전자를 대상으로, 이를 표적하는 여러 dsRNA를 디자인하고 합성했다. Nicotiana Benthamiana에 PepMoV와 PepMoV 표적 dsRNA를 함께 처리했을 때, dsRNA가 특정 기간 동안 바이러스의 감염으로부터 식물체를 보호했다. dsRNA와 바이러스 처리 기간을 최적화함으로써 dsRNA의 식물 보호 효율을 극대화하였다. 식물체에 선처리된 외래합성 dsRNA로부터 비롯된 RNA induced silencing complex의 생성이 바이러스의 감염으로부터 식물체를 즉각적으로 방어할 수 있었던 것으로 보인다. 또한, 동일 유전자 내의 서로 다른 구간을 대상으로 디자인된 각 dsRNA는, 동일 유전자를 표적하더라도 바이러스 증식에 미치는 영향의 수준이 서로 달랐다. HC-pro와 NIb 유전자의 중간 구간을 표적하는 dsRNA의 처리 시, 가장 높은 바이러스 증식 억제 효과가 관찰되었다. dsRNA 선처리 후 PepMoV를 감염시킨 식물 잎을 사용하여 RLM-5′ RACE를 수행한 결과, mRNA의 3′부근에서 대부분의 절단이 발생한 것으로 보인다. 본 연구 결과는 RNA 간섭 현상을 일으키는 dsRNA가 농작물 보호를 위한 식물 백신 플랫폼으로써 사용될 수 있음을 시사한다.