Osteogenic Potential of Human Induced Pluripotent Stem Cells and Human Mesenchymal Stem Cells

박시연 동국대학교 2014 국내석사

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow have a potential for cell therapy and tissue engineering. MSCs have already been used for clinical trials because these cells have regeneration and immuno- suppressive properties. A number of studies have confirmed that MSCs cultured in scaffolds can induce osteogenesis in vivo and improve healing of critical-size defects. In addition, engineered stem cells, known as induced pluripotent stem cells (iPSCs), generated from somatic cells by transduction of defined reprogramming factors, typically OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC, open a new avenue to avoid the controversy of using human embryonic stem cells (hESCs). In the present study, we generated of mesodermal cell lineages from hiPSCs following treatment of embryoid bodies (EBs) with retinoic acid. Subsequently, we induced osteogenic differentiation from EBs using osteogenic medium. To avoid the potential safety issues associated with using viruses, we used the hiPSC line by direct delivery of four proteins fused to a cell penetrating peptide in present study. The purpose of this study was to examine the in vitro induction of osteogenesis of hiPSCs (human induced pluripotent stem cells) and in vivo repair of bone defects comparable to that of hBMMSCs (human bone marrow mesenchymal stem cells) and therefore to prove the usefulness of hiPSCs as a cell source for bone regeneration. EBs which were formed from undifferentiated hiPSCs were dissociated into single cells and underwent osteogenic differentiation using the same medium as hBMMSCs for 14 days. The osteogenic marker gene and protein expression including COL1A1, Runx2, and bone sialoprotein (BSP) increased after 7 days and expression level of gene and protein after 14 days was higher than 7 days by RT-qPCR, western blot and immunohistochemistry. Osteogenic differentiation was also demonstrated via alkaline phosphatase staining and mineralization via Alizarin red staining compared to hBMMSCs. Staining results were similar to expressions of osteogenic markers. Osteo-induced hiPSCs were implanted on the critical-size 4mm calvarial defects created in the parietal bone of immunosuppressed rats with fibrin and hydroxyapatite/ß-tricalcium phosphate (HA/ß-TCP) and 4mm long bone segmental defects created in the radius bone of immunosuppressed rats. The healing of defects was evaluated after 8 weeks and 12 weeks of implantation respectively. The rats received daily injections of cyclosporin A to suppress immune responses in rats. In conclusion, despite delayed in vitro osteogenesis, hiPSCs have an in vivo osteogenic potential as good as hBMMSCs. 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 골수에서부터 유래한 줄기세포로 조직공학과 세포치료제로의 가능성을 지니고 있다. 간엽줄기세포는 재생과 면역억제의 특징 때문에 이미 임상실험으로 이용되고 있다. 많은 연구에서 지지체에서 배양한 간엽줄기세포가 생체 내에서 골분화를 유도하고 결손부분의 치유능력을 향상시켜 준다는 것을 밝혀냈다. 또한, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 알려진 조작된 줄기세포는 주로 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC의 리프로그래밍 인자들이 체세포에서 형질도입 되어 만들어진다. 이러한 유도만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell)의 단점을 보안할 수 있는 새로운 길을 열었다. 현재 연구에서, 우리는 retinoic acid를 이용하여 배아유사세포덩어리를 만들어서 사람유도만능줄기세포를 간엽세포 계통의 세포로 만들었다. 또한 골분화 유도 배지를 이용하여 배아유사세포덩어리를 골분화로 유도하였다. 바이러스를 이용하여 만든 사람유도만능줄기세포는 안전성 문제가 제기 될 수 있으므로 이를 피하기 위하여 네 가지 단백질을 세포에 직접적으로 이동시켜서 만든 사람유도만능 줄기세포를 사용하였다. 이 연구의 목적은 in vitro 에서 사람유도만능줄기세포를 이용한 골분화의 유도와 in vivo에서 뼈 절단부분의 조직 재생능력을 사람간엽줄기세포와 비교하고 조사하는 것이다. 이러한 연구를 통해 사람유도만능줄기세포가 골 재생에 사용될 세포 자원으로써의 사용 가능성을 증명하는 것이 이 연구의 목적이다. 분화되지 않은 사람유도만능줄기세포로 만든 배아유사세포덩어리를 단일 세포들로 분리한 후 사람간엽줄기세포와 마찬가지로 골 분화 유도 배지를 이용하여 14일간 골 분화를 유도 하였다. 골 분화가 유도된 사람유도만능줄기세포를 면역억제 쥐의 두정골에 임계크기로 calvarial defect을 준 부위에 fibrin과 hydroxyapatite/ß-tricalcium phosphate (HA/ß-TCP)와 함께 섞어 이식하였다. 또한 면역억제 쥐의 요골에 4mm의 뼈 절단하여 그 부위에 골 분화가 유도된 사람유도만능줄기세포를 fibrin과 함께 섞어 이식하였다. 절단 부분의 치유된 정도는 이식 후 calvarial defect은 8주, 4mm 요골 절단은 12주 이후에 확인하였다. 쥐의 면역반응을 억제 하기 위해 매일 cyclosporin A를 주입하였다. 골 형성 마커인 COL1A1, Runx2, BSP의 유전자와 단백질 발현이 7일 분화 시켰을 때 증가하였고, 14일 분화 시켰을 때는 7일 분화 시켰을 때 보다 발현 level이 더 높았다. 골분화를 유도시킨 사람유도만능 줄기세포는 사람간엽줄기세포와 비교하였을 때 골 형성 마커인 COL1A1, BSP의 in vitro 발현이 상대적으로 더 낮고 지연되는 것으로 보인다. 하지만 골 분화를 유도시킨 사람유도만능줄기세포는 사람간엽줄기세포와 큰 차이를 보이지는 않았다. 또한, Runx2 유전자 발현은 사람간엽줄기 세포보다 사람유도만능줄기세포에서 훨씬 더 높은 level을 나타내었다. 골 분화를 확인 하는 실험으로 또한 alkaline phosphatase staining과 alizarin red staining, mineralization을 통해서도 사람간엽 줄기세포와 비교하여서 실험하였다. 염색 결과는 골 형성 마커의 발현과 비슷한 결과를 나타내었다. In vivo histology는 micro-CT, Goldner’s trichrome staining, 면역조직화학적 염색을 통해 평가하였다. 사람유도만능줄기세포를 이식한 calvarial defects에서 새로운 뼈가 뼈 두께나 trabeculae의 형성으로 보아 사람간엽줄기세포를 이식한 calvarial defects과 비슷한 수준으로 형성되었다. Goldner’s trichrome staining으로 fibrin과 HA+ß-TCP와 함께 이식한 사람유도 만능줄기세포의 골 조직 재생을 확인하였다. 또한, 면역조직화학적 염색을 통해 human nuclear antigen이 새로 생겨난 뼈에서 확인되었고, human cell이 사람만능줄기세포와 사람간엽줄기세포를 이식한 defect부분에서 관찰되었다. 사람유도만능줄기세포와 사람 간엽줄기세포 모두 이식 후 8주 후에 골 조직재생을 확인하였다. Long bone segmental defect에서는 매 3주마다 X-ray를 통해 defect 부분의 재생을 확인하였고, 12주 후 사람유도만능 줄기세포를 이식한 그룹에서도 사람간엽줄기세포를 이식한 그룹과 비슷한 수준으로 segmental defect부분에서 골 재생이 이루어 졌다. 결론적으로, 이 연구에서는 in vitro에서 유도만능줄기세포를 간엽줄기세포로 직접적으로 분화시키고 골 분화를 성공적으로 이루어 냈다. 이러한 결과들은 in vitro에서 사람유도만능 줄기세포를 골세포로 만들 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, in vivo 실험을 통해서 골분화를 유도시킨 사람유도만능줄기세포의 이식은 bone defect을 치유 할 수 있다는 것을 증명하였다. 사람유도만능 줄기세포를 이용한 더 나은 in vivo 골 조직재생을 위해서 사람 유도만능줄기세포 이식에서의 mechanism과 strategy에 대해 더 많은 연구가 이루어 져야 할 것이다. In vitro에서 사람유도 만능줄기세포의 골분화가 사람간엽줄기 세포보다는 지연 되지만 in vivo에서는 사람유도만능줄기세포가 사람간엽줄기세포와 같은 골 조직재생 가능성을 지니고 있다.

유도만능줄기세포의 현재와 전망

김영진 고려대학교 의학전문대학원 2014 국내석사

2006년, 일본의 Yamanaka 교수팀은 4개의 전사인자를 이용하여 섬유아세포(fibroblast)로 부터 직접적으로 만능줄기세포를 생산해냈고, 이를 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 명명하였다. 본 논문에서는 최근까지의 유도만능줄기세포 및 리프로그래밍 기술에 대한 연구들의 리뷰를 통해 유도만능줄기세포의 메커니즘, 현재까지의 연구진행단계 및 한계점을 분석하고 이를 통해 앞으로의 가능성을 전망해 보는 것을 목표로 하였다. 유도만능줄기세포는 자가재생과 분화능에 있어서 배아줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지고 있으며, 윤리적인 문제에서도 자유롭다는 장점이 있다. 하지만 유도만능줄기세포 생산과정에서 유전자의 도입방법, 암 발생 가능성, 그리고 생산 효율 등의 문제점이 완전히 해결되지 않았으며 아직 임상 적용에 한계가 있다. 유도만능줄기세포는 줄기세포연구 분야에 획기적인 발전을 도모하였으며, 이미 실제 연구에 직접 적용되어 질병을 모델링 하는데 효과적으로 사용된 바 있다. 추가적인 연구를 통해 유도만능줄기세포가 가지는 한계점이 개선된다면, 앞으로 후보약물군 검증과 재생의학등 다양한 분야에서 큰 역할을 할 것으로 기대된다.

Development of a novel culture technique and an efficient direct differentiation method of pluripotent stem cells

전길수 건국대학교 대학원 2012 국내박사

Embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have the potential to undergo continuous proliferation (i.e., unlimited self-renewal capacity) and to differentiate into all somatic cell lineages in vitro. These cells are unlimited sources for establishing future regenerative cell therapies. However, techniques for maintaining undifferentiated ES cells and their functional differentiation into insulin-producing cells or mature neurons are inefficient and result in heterogeneous cell populations. Here, we report a newly developed and effective method to culture undifferentiated ES cells and to direct their differentiation toward pancreatic beta cells and mature neruons. Using this method, we observed the effects of the nanopattern substrate of polydimethylsiloxane (PDMS) as a culture substrate that promotes the self-renewal of mouse ES (mES) cells. Moreover, we established directed differentiation protocols to induce non-obese diabetic (NOD)-iPSCs cells toward functional pancreatic beta cells, and cNELL2-overexpressing cells toward lineages expressing increased levels of neuroectodermal markers and resulting in increased mature neuronal differentiation efficiency. First, we determined the effects of the nanopattern substrate of PDMS as a culture substrate that promotes the self-renewal of mES cells, and compared it to commercial plastic culture dishes. Under nanopattern PDMS conditions, we found increased activation of STAT3 and Akt, which are 2 important proteins involved in maintaining the self-renewal of mES cells. Additionally, the substrate-cell interactions enhanced signaling pathways downstream of leukaemia inhibitory factor (LIF) signaling and inhibited spontaneous differentiation, which was concomitant with reduced focal adhesion kinase (FAK) signaling. This reduction in FAK signaling was shown to be important for promoting mES cell self-renewal. Second, the NOD mouse is a classical animal model for autoimmune type 1 diabetes (T1D) that closely mimics the features of human T1D. Thus, the NOD mouse provides an opportunity to test the effectiveness of iPS cells as a therapeutic modality for T1D. To this end, we generated iPS cells from NOD mice and applied directed differentiation protocols to induce NOD-iPS cells toward functional pancreatic beta cells. The NOD-iPS cells showed typical ES cell-like characteristics. The differentiated NOD-iPS cells expressed diverse pancreatic beta cell markers and secreted insulin in response to glucose and KCl stimulation. Furthermore, transplantation of the differentiated NOD-iPS cells into diabetic mice resulted in kidney engraftment. These engrafted cells responded to glucose by secreting insulin, thereby normalizing blood glucose levels. Finally, NELL2 has 6 EGF-like repeat domains, 3 of which contain residues required for Ca2+-binding. Previous study group has shown that cytosolic NELL2 (cNELL2) is an alternatively spliced variant of the rat NELL2 gene. To investigate the functions of cNELL2 in ES cell neuronal differentiation, we generated mES cell lines that overexpressed cNELL2. Overexpression of cNELL2 in mES cells significantly increased cell viability, whereas overexpression of a control vector in mES cells showed no effect on cell viability during neuronal differentiation. Moreover, we found that cNELL2-overexpressing cells showed higher expression levels of the neuroectodermal markers (OTX1, Lmx1b, En1, Wnt1, Sox1, and Nestin) and greater neuronal differentiation efficiency than control-overexpressing mES cells did. Taken together, our data show that nanopattern PDMS contributes to the maintenance of mES cell self-renewal and may be applicable in the large-scale production of homogeneously undifferentiated mES cells. Furthermore, we showed that NOD-iPS cells can provide a useful tool for generating a cellular interaction model of T1D and the investigating genetic susceptibility to autoimmune diseases. Finally, we showed that cNELL2 plays a key role in increasing the proliferation of mES cells during neuronal differentiation and in promoting their differentiation toward neuronal lineages. Therefore, study of ES and iPS cells may have important implications for disease modeling and in regenerative medicine. 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포는 끊임없는 증식 (무한한 자가증식)을 할 수 있으며 모든 체세포로 분화할 수 있는 능력이 있다. 이 세포들은 미래 재생의학적 세포치료를 확립할 수 있는 무한한 원천이다. 그러나, 미분화 줄기세포를 유지하고 인슐린 분비 또는 신경세포와 같은 기능성 세포로의 분화 기술은 비효율 적이며 다양한 세포가 모여있는 결과를 초래한다. 여기서 우리는 미분화 줄기세포의 효율적인 배양과 췌장 베타 세포 및 신경세포로의 효율적인 분화 방법을 개발하였다. 이와 같은 방법을 사용하여 나노패턴 PDMS에서 배아줄기세포의 자가 증식을 촉진시키는 효과를 관찰하였다. 또한 NOD 유도만능 줄기세포로부터 췌장 베타 세포의 분화 및 새로운 유전자인 cNELL2를 과 발현시켜 효율적인 직접 분화 방법을 설립하였다. 우선 나노패턴 PDMS가 배아줄기세포의 자가 증식을 촉진할 수 있는지 결정하기 위하여 일반적인 세포배양 용기와 비교하였다. 그 결과 나노패턴 PDMS를 사용하여 배양한 세포들에서 배아줄기세포의 자가 증식에 중요한 STAT3 와 Akt 단백질의 발현이 증가 하는 것을 확인하였다. 또한 세포와 기질간의 상호작용은 LIF의 하위 신호전달에 관련된 단백질들을 증가시켰으며 FAK 세포신호전달 활성을 줄이면서 자발적인 분화를 억제하는 결과를 확인하였다. 그러므로 FAK 세포 신호전달의 불활성화는 배아줄기세포의 자가증식을 촉진하는데 중요한 인자라고 사료 된다. 둘째, NOD 마우스가 밀접하게 인간의 1형 당뇨병과 유사한 병리적 특징을 나타내며 자가면역 1 형 당뇨병에 대한 고전적인 동물 모델이다. 따라서, NOD 마우스는 1형 당뇨병에 대한 치료 양상으로써 유도만능줄기세포 세포의 효과를 시험 할 수 있는 기회를 제공한다. 이를 위해, 우리는 NOD 마우스로부터 유도만능 줄기세포를 생성하고 확립된 NOD 유도만능 줄기세포를 기능성 췌장 베타 세포로 분화하기 위하여 직접 분화방법을 사용하였다. 확립된 NOD 유도만능 줄기세포는 전형적인 배아줄기세포와 같은 특성을 보여주었다. 분화된 NOD 유도만능 줄기세포는 다양한 췌장 베타 세포 마커를 발현하였고 Glucose와 KCl 자극에 대한 반응으로 인슐린을 분비하였다. 또한, 당뇨병 마우스에 분화된 NOD 유도만능 줄기세포를 신장 이식하였다. 그 결과 이식된 세포는 인슐린을 분비하여 당뇨병 마우스의 혈당 수치를 정상화시키는 결과를 확인하였다. 마지막으로, NELL2은 6개의 EGF와 유사한 반복적인 도메인인과 Ca2+ 잔기에 결합할 수 있는 3개의 잔기를 포함하고 있다. 이전 연구 그룹은 cytosolic NELL2 (cNELL2)가 쥐 NELL2 유전자의 또 다른 alternatively spliced variant에 대하여 보고하였다. 배아줄기세포의 신경 분화에 따른 cNELL2의 기능을 조사하기 위해, 우리는 cNELL2를 과 발현하는 배아줄기세포 주를 확립하였다. 그 결과 cNELL2가 과 발현된 배아줄기세포에서 신경 분화를 유도하는 동안 세포의 생존율이 대조군에 비하여 크게 증가하는 결과를 확인하였다. 더욱이, cNELL2를 과 발현시킨 배아줄기세포에서 neuroectodermal 마커 (OTX1, Lmx1b, En1, Wnt1, Sox1 및 Nestin) 및 신경 분화가 대조군에 비하여 매우 높은 효율을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 종합하면, nanopattern PDMS가 배아줄기세포의 자가증식에 기여하므로 순수한 미분화 배아줄기세포의 대량 생산에 적용가능성이 충분할 것으로 예상된다. 또한, NOD 유도만능 줄기세포는 1형 당뇨병의 세포 수준에서의 연구 및 자가 면역 질환에 따른 유전학적 조사에 유용한 도구가 될 것으로 전망된다. 마지막으로, cNELL2는 신경 분화를 유도하는 동안 배아줄기세포의 증식을 증가시키며 신경 세포로의 분화를 촉진시키는 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 따라서 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포의 연구는 질병 모델 및 재생 의학에 대한 중요한 영향을 미칠 것으로 사료된다.

원료 체세포의 미토콘드리아 기능이 인간유도만능 줄기세포 유래 분화 대식세포의 식작용에 미치는 영향

김빛나라 차의과대학교 일반대학원 2023 국내석사

Recently, advanced stem cell technologies have provided the resources for regenerative medicine. Particularly, human induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived immune cells are expected to replace human-derived primary immune cells, such as T cells, natural killer (NK) cells, and macrophages. The hiPSCs-derived macrophages (iMacs) are considered a renewable source for cell therapy. However, there are problems with their application due to variations in the function of differentiated cells. To overcome the issue, we focused on the correlation between mitochondria function in fibroblasts, which are the origin of hiPSCs, and the phagocytosis of iMacs. We hypothesized that the high functional mitochondria in fibroblast can induce better function of iMacs. For this purpose, we assessed the mitochondrial function in fibroblasts by measuring the metabolic fluxes of mitochondria, and the hiPSCs were generated from fibroblasts having different mitochondrial respiratory functions. Furthermore, to generate the iMacs, we established the modified macrophage differentiation protocol and applied it to hiPSCs. We confirmed surface markers of the iMacs and measured the function of the iMacs with the phagocytosis assay. As a result, we identified that mitochondria in fibroblasts have different metabolic abilities from each other. Generated hiPSCs from fibroblasts displayed pluripotent characteristics and were differentiated into macrophage-like cells. And then, we confirmed that the iMacs have similar properties to macrophages in aspects of protein levels. But each iMac presented different levels of phagocytic function. Finally, we showed that the higher the mitochondria function in the fibroblasts from which hiPSCs were derived, the more enhanced the phagocytic function in the iMacs. In conclusion, our study suggests that the mitochondrial function in fibroblasts affects the functional ability of iMacs. Therefore, we are expected that the mitochondria function test in fibroblasts will contribute to select of high-functional hiPSCs-derived differentiated cells for cell therapy. 최근, 발전한 줄기세포 기술은 재생의학의 주요 자원으로 여겨지고 있으며, 특히 유도만능줄기세포 유래 면역세포는 사람의 체내에 존재하는 여러 면역세포들 (NK세포, T세포, 대식세포)을 대체할 수 있을 거라 기대 되고 있다. 그 중 유도만능줄기세포 유래 대식세포는 세포 치료를 위한 재생 가능한 공급원으로 여겨지고 있지만 분화된 세포 간의 기능적 차이가 있어 치료를 위한 활용에 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 본 실험은 유도만능줄기세포의 기원인 체세포의 미토콘드리아 기능과 유도만능줄기세포 유래 대식세포의 기능 사이의 상관관계에 대해 연구하고자 하였고 체세포의 미토콘드리아 기능이 높을수록 유도만능줄기세포 유래 대식세포의 기능이 높을 것이라 가정하였다. 이를 증명하기 위해, 본 실험은 체세포의 미토콘드리아의 에너지 대사를 측정하여 미토콘드리아 기능을 평가하고 미토콘드리아 에너지 수준이 다른 체세포 6라인을 선별한 후 유도만능줄기세포 6라인을 생성하였다.또한, 유도만능줄기세포 유래 대식세포를 생성하기 위해 대식세포 분화법을 확립하여 유도만능줄기세포 6라인에 적용시켰다. 유도만능줄기세포 유래 대식세포의 분화 및 기능을 평가하기 위해 대식세포 관련 단백질의 발현과 식세포기능을 확인하였다. 그 결과, 같은 종류의 체세포일지라도 미토콘드리아의 에너지 대사 능력이 서로 다름을 확인할 수 있었다. 또한 체세포에서 생성된 유도만능줄기세포가 다분화능을 나타내며 유도만능줄기세포 유래 대식세포가 단백질 수준에서 대식세포와 유사한 특성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 각 유도만능줄기세포 유래 대식세포는 식세포기능에서 뚜렷한 차이를 나타냈으며 유도만능줄기세포의 기원인 체세포의 미토콘드리아 기능이 높을수록 유도만능줄기세포 유래 대식세포가 더 향상된 식세포기능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 본 실험은 체세포의 미토콘드리아 기능이 유도만능줄기세포 유래 대식세포의 기능적 수준에 영향을 미칠 수 있음을 확인할 수 있었고, 따라서 체세포의 미토콘드리아 기능 검사가 세포치료를 위한 고기능성 유도만능줄기세포 유래 분화세포 선택에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

The role of hMAGEA2 on breast cancer and induced pluripotent stem cells : 인간 MAGEA2 유전자가 유방암과 유도만능줄기세포에 미치는 영향에 관한 연구

박송 경북대학교 대학원 2018 국내박사

인간 MAGEA2 유전자는 보통 발생 중인 세포 또는 미분화된 세포에 많이 발현하고 있다고 알려져 있다. 더불어, 다양한 종류의 암세포에서도 강력하게 발현하고 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특성으로 인해 암의 진단 표지 유전자로서의 연구가 많이 이루어지고 있다. 하지만, 인간 MAGEA2 유전자가 암세포에 미치는 분자생물학적인 매커니즘과 기능은 아직까지도 많이 연구되어 지지 않았다. 본 논문에서는 이러한 인간 MAGEA2 유전자가 인간 유방암과 유도만능줄기세포에 미치는 영향을 고찰하였다. 유방암은 많은 여성들이 겪고 있는 질병이며, 암의 전이 잘 일어나는 것으로 알려져 있다. 그래서 유방암의 치료 타겟 유전자를 찾는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 논문에서는 인간 MAGEA2 유전자가 유방암에서 대조군에 비해 많이 발현하고 있다는 것을 Tissue Microarray(TMA)로 규명하였다. 그리고 2가지 유방암세포주(MDA-MB-231, MDA-MB-468)를 활용하여 인간 MAGEA2 유전자의 기능을 검정하였다. 두개의 세포주에서 각각 인간 MAGEA2 유전자를 과발현 시켰을 때, MDA-MB-231 세포주의 경우 세포의 증식력과 콜로니 형성능 그리고 전이능이 유의차 있게 증가된 것을 확인하였다. 또한 면역이 결핍된 누드마우스에 세포주를 이식하였을 때, 암의 형성능이 증가됨을 확인하였다. 하지만, MDA-MB-468 세포주에서는 아무런 표현형의 차이를 확인할 수 없었으며, 그 원인이 기본적인 인간 MAGEA2 유전자가 높게 발현하고 있기 때문이라고 추정하였다. 그래서 과발현이 아닌 knockdown을 하여 인간 MAGEA2 유전자를 감소시켜서 표현형을 확인하였을 때, 세포의 증식력과 콜로니 형성능이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다. 그리고 이러한 표현형을 조절하는 세포신호전달 매커니즘을 단백질 수준에서 확인하였다. 세포의 생존 및 증식을 증가시키는 Akt와 ERk1/2 단백질이 인간 MAGEA2 유전자가 증가되었을 때, 유의차 있게 증가됨을 확인하였으며, 반대로 인간 MAGEA2 유전자가 감소되었을 때, 유의차 있게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼때, 인간 MAGEA2 유전자는 유방암의 생존에 큰 영향을 끼치고 있으며, 훌륭한 치료타겟으로의 가능성이 있다고 사료된다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포를 대체할 수 있는 훌륭한 세포 모델이자 세포치료제로 많은 연구가 되어지고 있다. 윤리적인 문제가 전혀 없으며, 배아줄기세포와 같이 개체를 제외하고 인간의 모든 세포로 분화할 수 있는 것이 특징이다. 이러한 유도만능줄기세포의 만능성 및 분화능을 조절하는 연구들이 세계적으로도 많이 이루어지고 있다. 본 논문에서는 발생 중 또는 미분화 세포에서 많이 발현되어지고 있는 인간 MAGEA2 유전자가 유도만능줄기세포에 미치는 영향을 고찰하였다. 먼저, 인간 MAGEA2 유전자가 과발현된 형질전환생쥐를 제작하고, 초대배양을 통하여 MEF(Mouse embryonic fibroblast)를 추출하여 배양하였다. 초대배양한 MEF에 인위적으로 retrovirus infection을 통하여, 유도만능줄기세포를 제작할 수 있다고 알려진 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 4가지 유전자를 과발현시켜서 유도만능줄기세포를 확립하였다. 확립된 유도만능줄기세포는 passage를 7~8까지 계대배양하여 안정화시킨 후 실험에 이용하였다. 먼저, 세포의 만능성을 여러가지 마커로 확인하였다. 인간 MAGEA2 유전자가 과발현된 유도만능줄기세포의 경우, Alkaline Phosphatase (AP) 염색에서는 큰 차이를 확인할 수 없었지만, 만능성의 마커 유전자의 mRNA 발현 수준과 단백질 발현 수준이 유의차 있게 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, 인간 MAGEA2 유전자가 과발현된 유도만능줄기세포의 경우 세포주기가 현저히 증가하고, 증식력이 증가됨을 확인할 수 있었다. 하지만, Embryoid body(EB) 형성을 통하여 분화능을 관찰하였을 때, 분화능은 인간 MAGEA2 유전자가 증가함에 따라 유의차있게 감소하였고, 3배엽 분화의 마커 유전자들 또한 감소됨을 확인할 수 있었다. 결정적으로 누드 마우스에 유도만능줄기세포를 주입하여 기형종 형성을 관찰하였을때, 인간 MAGEA2 유전자가 과발현된 유도만능줄기세포의 경우 기형종의 크기가 매우 감소되었고, 외배엽과 중배엽의 마커유전자가의 발현이 조직상에서 매우 감소됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 인간 MAGEA2 유전자가 과발현됨에 따라, 유도만능줄기세포의 만능성은 현저히 증가하나 분화능이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 인간 MAGEA2 유전자는 유도만능줄기세포 뿐만 아니라 더 나아가 배아줄기세포의 연구에 응용이 가능하다고 사료된다.

Small Molecules Based Reprogramming of Somatic Cells into Pluripotent Stem Cells

정다희 건국대학교 대학원 2023 국내박사

A technique has been developed to create induced pluripotent stem cells (iPSCs) with characteristics similar to embryonic stem cells (ESCs) by reprogramming adult cells that have completed differentiation. It was expected that iPSCs will be used as cell therapy agents since they can resolve ethical issues associated with the isolation of ESCs and can be created from patient-derived cells. For the production of iPSCs, specific transcription factors (reprogramming factors) have to be introduced into the cells. However, the most common retrovirus or lentivirus method was not suitable for the production of iPSCs for cell therapy because exogenous transcription factors could be integrated into the host cell genome and cause mutations or cancer. Therefore, non-integrated methods that can overcome this have been developed, and among them, chemical reprogramming using small molecule compounds is considered the most ideal method. Chemical reprogramming is a method of controlling the fate of cells using small molecule compounds with epigenetic modifiers or signaling pathway regulator functions of cells. As the number of small molecule compounds is large, various combinations can be applied and the experimental method is simple. Nevertheless, it is reproducible only in the same research team that developed the chemical reprogramming technique for the first time, so active research is not being conducted. In this dissertation, an experiment was conducted with the goal of establishing a more detailed experimental method to solve these problems and applying it to human cells to lay the foundation for making chemically induced pluripotent stem cells (CiPSCs). Chemical reprogramming and the stage of extraembryonic endoderm (XEN), which is only passed through in chemical reprogramming, were described in Chapter 1 along with a variety of reprogramming strategies and their limitations. Chapter 2 describes how to generate CiPSCs in mouse cells. In the process of inducing XEN cells in mouse embryonic fibroblasts using a small molecule compounds cocktail, it was confirmed that other types of cells were also induced along with XEN cells. It was impossible to induce pluripotency in a heterogeneous condition of different cell types, including XEN cells. Therefore, it was revealed that the homogeneity of XEN cells is the key to improving the efficiency of CiPSC induction and chemical reprogramming. I attempted to generate a human XEN cell line in Chapter 3 under the assumption that human cells would require the XEN stage to induce CiPSCs, as with mouse cells. I tried to induce XEN cells by approaching them in various ways, including chemical methods, and human XEN cells were induced in the OCT4-EGFP/NANOG-tdTomato reporting system iPSCs that can screen small molecular compounds required for induction to CiPSCs or increase their efficiency. The method for increasing the homogeneity of XEN cells, which is an intermediate stage for chemical reprogramming, is expected to be a breakthrough for researchers who have not been able to reproduce chemical reprogramming. In addition, human XEN cells constructed from the reporting system iPSCs are expected to be useful tools for screening small molecule compounds for reprogramming. 분화가 완료된 성체 세포를 역분화 하여 배아줄기세포와 유사한 특성을 가지는 유도만능 줄기세포를 만드는 기술이 개발되었다. 유도만능 줄기세포는 배아줄기세포의 분리와 관련된 윤리적 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 환자로부터 분리한 세포에서 제작이 가능하므로 세포치료제로의 사용이 기대되었다. 유도만능 줄기세포의의 제작을 위해서는 역분화 인자라고 하는 특정 전사인자들을 세포 내로 도입해야한다. 하지만, 가장 보편적으로 사용하는 레트로 바이러스 혹은 렌티 바이러스를 사용하는 방법은 숙주세포의 게놈으로 외인성 전사인자가 통합되어 돌연변이나 암을 유발할 수 있는 위험성이 있으므로 세포치료제로의 적용을 위한 유도만능 줄기세포의 제작에는 적합한 방법이 아니었다. 따라서, 이를 극복할 수 있는 비통합 방법들이 개발되었고 그 중, 소분자 화합물을 이용한 화학적 역분화가 가장 이상적인 방법으로 여겨진다. 화학적 역분화는 세포의 후성유전학적 조절이나 신호전달경로 조절 기능을 가진 소분자 화합물을 이용하여 세포의 운명을 조절하는 방법이므로 소분자 화합물의 수가 많은 만큼 다양한 조합의 적용이 가능하며 실험법이 간단하다. 그럼에도 불구하고, 처음 시험법을 개발한 동 연구팀에서만 재현이 가능하여 활발한 연구가 이뤄지지는 않는 추세이다. 본 논문에서는 이러한 문제를 해결할 수 있는 보다 자세한 실험 방법을 확립하고 이를 인간 세포에 적용하여 화학적으로 유도된 유도만능 줄기세포 (chemically induced pluripotent stem cells, CiPSCs) 를 만들기 위한 기반을 다지는 것을 목표로 실험을 진행하였다. 논문의 1장에서는 재프로그래밍의 다양한 기술과 그에 따른 한계점을 설명하고 화학적 역분화와, 화학적 역분화에서 고유하게 거쳐가는 상태인 배체외내배엽 단계에 대해서 설명하였다. 2장에서는 마우스 세포에서 CiPSCs를 확립하는 방법에 대해 설명하였다. 마우스 배아 섬유아세포에 소분자 화합물 칵테일을 사용하여 배체외내배엽 세포를 유도하는 과정에서 배체외내배엽 세포와 함께 다른 유형의 세포도 유도되는 것을 확인하였다. 배체외내배엽 세포를 포함한 여러 형태의 세포가 혼재한 상태에서는 만능성의 유도가 불가능함을 확인하였고 따라서, CiPSCs의 유도와 화학적 역분화의 효율을 높이기 위해 배체외내배엽 세포의 균질성이 핵심이라는 것을 밝혔다. 3장에서는 인간세포에서 CiPSC를 만들기 위해서는 마우스와 마찬가지로 배체외내배엽 단계가 필요할 것이라는 가정하에 배체외내배엽 세포주를 구축하고자 하였다. 화학적 방식을 포함한 여러방식으로 접근하여 배체외내배엽 세포를 유도하고자 하였고, CiPSCs로의 유도에 필요하거나 그 효율을 높일 수 있는 소분자 화합물을 스크리닝 할 수 있도록 OCT4-EGFP/NANOG-tdTomato 리포팅 시스템 유도만능 줄기세포에서 인간 배체외내배엽 세포를 유도하였다. 화학적 역분화를 위해 중간단계인 배체외내배엽 세포의 균질성을 높이기 위한 방법은 화학적 역분화의 재현 실험이 되지 않았던 연구자들에게 돌파구가 될 것으로 기대한다. 또한, 리포팅 시스템 유도만능 줄기세포에서 구축한 인간 배체외내배엽 세포는 역분화를 위한 소분자 화합물의 스크리닝에 유용한 도구로 쓰일 수 있을 것으로 예상한다.

각막부전 토끼 모델에서 유도만능 줄기세포에서 유래된 각막 내피유사세포와 중간엽 줄기세포의 동시주입

정호석 울산대학교 일반대학원 2025 국내박사

Erythroblast differentiation of human endometrium derived induced pluripotent stem cells as a source of autologous transfusion

박주현 Graduate School, Yonsei University 2017 국내박사

연구의 목적과 배경: 재생의학은 최근의 인구의 노령화에 따른 질병의 발생 증가로 인하여 이를 극복하고 완화하기 위한 새로운 치료방법으로 크게 각광받고 있다. 산부인과에서는 수혈의 빈도가 높은데, 자궁절제술 전후 잉여로 자궁내막조직을 쉽게 얻을 수 있는 것이 착안하여 자궁절제술 환자유래 자궁내막세포를 이용하여 유도만능줄기세포주를 제작하고 이를 자가수혈용 혈액을 생산할 수 있도록 조혈모세포 및 적혈구로 분화시킴으로써 자궁내막을 활용한 자가 수혈용 적혈구 생산의 원천기술을 확보하고자 하였다. 연구방법: 30대 후반에서 40대의 양성 부인과 질환으로 자궁절제를 받은 3명의 환자로부터 잉여의 자궁내막 조직을 얻어 연구에 사용하였다. 유도만능줄기세포주는 자궁내막지지세포를 계대 배양하면서 분획을 팽창시킨 후 sox2, oct4, klf4 그리고 c-Myc을 형질주입 시킨 형광발현 역전사바이러스 벡터를 사용하여 유도만능줄기세포주를 제작하였다. 이 과정에서 자궁내막지지세포의 증식을 자극, 역분화의 효율을 높이기 위해 외인성 β 에스트라다이올을 처리하였다. 적혈구 분화유도는 2단계로 나누어 진행하였다. 첫번째 단계에서는 유도만능줄기세포를 생쥐의 골수지지세포 위에 9일간 공동배양을 한 후 두번째 단계에서는 이를 지지세포가 없이 hydrocortisone, stem cell factor (SCF), interleukin-3 (IL-3), recombinant erythropoietin (rEPO) 그리고 poloxamer 188이 첨가된 무혈청 배지를 기본으로 하여 적혈구 분화 실험을 17일간 진행하였다. 배양과정에서 분화의 확인은 유세포분석기를 이용하여 KDR (VEGF-R2), CD235a, CD34, CD43, CD71을 측정하였고, 세포수는 hemocytometer를 사용하여 수기로 산정하였으며, 세포의 형태와 백분율은 말초도말 슬라이드를 제작하여 Wright-Giemsa 염색을 하여 현미경하에서 산정하였다. 결과: 자궁내막지지세포에서 유도만능줄기세포를 제작하는 과정에서 에스트라다이올을 전처리한 그룹이 대조군에 비하여 역분화 효율이 평균 1665%로 증가하였으며, 그 결과에 따라 본 연구의 유도만능줄기세포주 구축과정에서는 0.1um/ml의 농도로 공여세포를 전처리하는 방법을 도입하였다. 구축된 유도만능줄기세포주를 생쥐골수지지세포에 9일간 공동배양한 후 조혈모 전구세포 표지자인 CD43 양성세포를 약 8~13%까지 얻을 수 있음을 확인하였다. 이를 지지세포 없이 적혈구 분화유도 무혈청배지에서 17일간 배양 과정을 통해 약 80%까지 polychromatic 및 orthochromatic normoblast로 분화되는 것을 확인하였다. 결론: 자궁절제술 환자로부터 얻은 잉여 자궁내막지지세포를 고유한 에스트라다이올 처리를 통해 역분화 효율을 증대시킬 수 있었으며, 자궁내막세포로부터 제작된 유도만능줄기세포주로부터 조혈모전구세포로 분화시키고, 이를 다시 적혈구모세포로 성공적인 분화과정을 확립하였다. 이는 무한한 세포원으로서 각광받고 있는 유도만능줄기세포주 구축과정에서 산부인과에서 쉽게 얻을 수 있는 잉여 자궁내막세포를 활용한 연구이며, 이를 통해 수혈 요구가 많은 산부인과 환자를 위해 자가수혈용 확보 기술로서 체외 적혈구 분화 원천기술을 확보하는데 기초 기반 기술을 제공하였다. Purpose and background: With the consistent increase in life-expectancy, the importance of regenerative medicine cannot be over-emphasized. The objective of this study is to pretreat patient derived endometrial cells with exogenous 17-beta estradiol to enhance reprogramming efficiency of endometrial stromal cell derived induced pluripotent stem (iPS) cells. Subsequently, the protocol for committing these cells into hematopoietic and erythroid lineages will be optimized through a two-phase culture system, involving feeder and non-feeder environments. Method: Discarded endometrial tissues were obtained from women receiving hysterectomy in their 4th to 5th decade due to benign uterine conditions. The endometrial cells isolated were expanded to passage 3-4 to allow stromal cells to dominate in the culture environment. PMIG-sox2, oct4, klf4 and c-Myc viral vectors, namely the Yamanaka factors were used to transduce the endometrial stromal cells. The impact of exogenous 17-beta estradiol on the reprogramming efficiencies of different endometrial donor cells were compared at concentrations of 0, 0.1 and 1µM/ml. Directed differentiation of these established iPS cells were conducted in two phases. The first 9 days involved commitment of the iPS cells to hematopoietic fate with robust expansion on murine bone marrow stromal feeder cells (OP-9). The second phase of differentiation involved feeder free conditions composed of hydrocortisone, stem cell factor, interleukin-3, recombinant EPO and poloxamer 188. After 17 days of differentiation in feeder free environment, the expression profiles of KDR (VEGF-R2), CD235a +, CD34 +, CD43 + and CD 71+ were analyzed by flow cytometry and Wright-Giemsa staining for differential counting based on morphology. Results: The treatment of donor endometrial stromal cells with exogenous estradiol at a concentration of 0.1µM/ml resulted in iPS reprogramming efficiency of approximately 166 ± 5% compared with the non-treated control cells set as 100%. As a result of inducing these cells to hematopoietic fate via a 9 day co-culture with murine stromal fibroblasts, yields ranging from 8-13% was observed depending on the donor. Because the potential of these co-cultured cells to further differentiate into erythroblastic fate may not be confined to defined cell surface markers, all of the OP-9 co-cultured cells were transferred to a feeder-free system composed of hydrocortisone, stem cell factor, interleukin-3, recombinant EPO and poloxamer 188 for 17 days, stably yielding over 80% of polychromatic and orthochromatic normoblasts. Therefore, the protocol for a comprehensive induction of erythroid lineage cells starting from human endometrial tissue via iPS cell reprogramming has been fully demonstrated. Conclusion: The treatment of exogenous estradiol, unique to endometrial cells yielded higher reprogramming efficiencies of endometrial derived iPS cells compared naïve endometrial cells. From these iPS cell colonies driven from discarded endometrial cells successful induction of hematopoietic cell fate followed by erythroid differentiation up to orthochromatic normoblasts were achieved in an effort to develop autologous transfusion source.

Studies on OCT4 reporter system to verify pluripotency of pig embryonic stem cells

김승훈 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Pluripotent stem cells are capable of self-renewal and differentiation into various cells. Especially, porcine pluripotent stem cells are useful for the preclinical therapy, transgenic animals, and agricultural usage. These stem cells have two states: naïve and primed. Naïve pluripotent stem cells represented by mouse embryonic stem cells can form chimera after blastocyst injection analysis; therefore, they are naïve. Primed pluripotent stem cells represented by mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells are in the primed state so they do not produce chimera after blastocyst injection analysis. Embryonic stem cell populations are not homogenous, therefore reporter systems are used to clarify the status of stem cells and to isolate the cells. OCT4 plays pivotal roles in maintaining pluripotency during the early embryonic development and in embryonic stem cells. It has a critical role as a central regulator in maintaining pluripotency and self-renewal. There are four conserved regions (Conserved Region 1, CR1; Conserved Region 2, CR2; Conserved Region 3, CR3; and Conserved Region 4, CR4) in the 5 upstream regulatory region of various species. Moreover, OCT4 contains a core promoter and two conserved enhancers, the distal enhancer (DE) and proximal enhancer (PE). There are two elements regulated by retinoic acid exist in the PE region. The loss of occupancy in these elements is called PE1A and PE1B, respectively. An element called DE2A has a sequence similar to that of PE1A and exists in the DE region. A study of a mouse Oct4 upstream region model revealed that the two enhancer regions are activated differently. The DE can activate Oct4 expression in mouse embryonic stem cells, germ cells, and inner cell mass cells, whereas the PE can activate Oct4 expression in mouse epiblast stem cells and epiblasts. It was noting that Oct4-based reporter system has already been developed in other species and is used to distinguish, separate, and identify pluripotent stem cells. It is one of the most necessary parts of studying stem cells and pluripotency, but it is important to emphasize that there is still a lack of information about the porcine OCT4 upstream reporter system. To improve understanding of the porcine OCT4 regulatory region, I identified conserved regions in the porcine OCT4 promoter upstream region by sequence-based comparative analysis using various mammalian genome sequences. The similarity of nucleotide sequences in the 5 upstream region was low among mammalian species. However, the OCT4 promoter and four conserved regulatory regions, including DE and PE elements, had a high similarity. Next, a functional analysis of the porcine OCT4 promoter region was conducted. Luciferase reporter assay indicated that the porcine OCT4 DE and PE were highly activated in mouse embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells, respectively. A comparison analysis of naïve and primed state marker gene expression in a dual-reporter assay showed that the reporter system works well and is applicable. Similar to OCT4 upstream-based reporter systems derived from other species, the porcine OCT4 upstream region-based reporter constructs showed exclusive expression patterns depending on the state of pluripotency. This work provides basic information about the porcine OCT4 upstream region and various porcine OCT4 reporter constructs, which can be applied to study species-specific pluripotency in early embryo development and to find naïve pluripotent stem cells in pigs. Next, I examined the activity and function of pig OCT4 enhancers in porcine reprogramming cells. Dual reporter systems controlled by the upstream regulatory region of OCT4 are widely used to study the mechanism of pluripotency. I examined how this reporter system functions in FGF- or LIF-dependent reprogrammed porcine pluripotent stem cells using the previously established porcine-specific reporter system. Porcine embryonic fibroblasts were co-infected with the pOCT4-∆PE-eGFP (DE-GFP) and pOCT4-∆DE-DsRed2 (PE-RFP) vectors, and GFP and RFP expression was verified during a DOX-dependent reprogramming process. I demonstrated that the changes of the expression of pluripotent marker genes and the porcine OCT4 DE and PE were activated in different expression patterns during the establishment of porcine-induced pluripotent stem cells (iPSCs). Porcine OCT4 upstream region-derived dual reporter systems serve as live naïve/primed pluripotency indicators for porcine induced pluripotent cell establishment. This work demonstrates the applicability of the porcine OCT4 upstream region-derived dual fluorescence reporter system, which may be applied to investigate species-specific pluripotency in porcine stem cells. Finally, I performed functional tests of the previously established porcine-specific OCT4 reporter system in the porcine embryonic stem cells. Porcine embryos were micro-injected with the pOCT4-ΔPE-eGFP (DE-GFP) containing a distal enhancer and core promoter and pOCT4-ΔDE-DsRed2 (PE-RFP) containing a proximal enhancer and core promoter. Embryonic stem cells were established with the blastocysts with porcine OCT4 reporter system. I analyzed mRNA and protein expression of GFP and RFP using quantitative real-time polymerase chain reaction and confocal microscopy. The reporter system was working in pluripotent cells and the expression of GFP and RFP was observed simultaneously in the embryonic stem cells. Comparing the activity of DE and PE with other naïve and primed state pluripotent cells, the porcine embryonic stem cells were close to a primed state, not a naïve state. The expression level of fluorescent genes was reduced after the differentiation of embryonic stem cells. I also analyzed the binding site between porcine OCT4 protein and genome sequences via ChIP-seq of porcine OCT4. Porcine OCT4 ChIP-seq data supported the results of analysis on the upstream regulatory region of porcine OCT4 obtained from the sequence analysis and suggested marker candidates that could be based on further research. This work can be a case of demonstrating the applicability of the porcine OCT4 upstream region-derived dual fluorescence reporter systems, which can be applied to study species-specific pluripotency, in porcine-origin cells. Also, these reporter systems can be used as useful tools for studies of porcine specific pluripotency, porcine early embryo development and embryonic stem cells. 줄기세포는 자기 복제가 가능하며, 다양한 세포로 분화할 수 있다. 특히 돼지의 줄기세포는 인간 질병 모델 및 유전자 변형 동물의 생산에 유용하다. 이러한 줄기세포는 나이브와 프라임드라고 하는 두 가지 상태로 나눌 수 있다. 나이브 상태를 대표하는 생쥐 배아 줄기세포는 배반포 주사 분석 후에 키메라를 형성할 수 있는 반면, 생쥐 후두엽 줄기세포와 인간의 배아줄기세포가 속하는 프라임드 상태의 줄기세포는 배반포 주사 분석 후 키메라를 생성하지 못하는 차이점이 있다. 배아줄기세포의 개체군은 동일하지 않기 때문에 줄기세포의 상태를 분류하고 특정 상태의 세포를 분리하는데 리포터 시스템이 사용된다. 만능성 유전자 OCT4는 초기 포유류 배아 발달 과정과 배아줄기세포에서 중추적인 역할을 하는데, 특히 줄기세포에서는 만능성의 유지와 자기복제에 중요한 중심 조절 인자이다. 다양한 종에서 4개의 보존 구역 (CR1, CR2, CR3, CR4)이 5’ 상위 조절 구역에 존재하는 것이 확인 되었다. OCT4는 코어 프로모터와 두 보존된 인핸서, 원위 인핸서와 근위 인핸서를 가지고 있다. 쥐 OCT4 상위 구역 모델에 대한 연구는 두 인핸서 구역이 다르게 활성된다는 것을 보여주었다. 원위 인핸서 구역은 쥐 배아줄기세포와 생식선 세포, 그리고 내부세포괴에서 Oct4의 발현을 조절할 수 있는 반면, 근위 인핸서 구역은 쥐 배반엽상피 줄기세포와 배반엽상층에서 Oct4의 발현을 조절할 수 있다. Oct4 기반 리포터 시스템은 다른 종에서는 이미 개발되어 만능성 줄기세포를 구별, 분리, 식별하는 데에 사용되고 있다. 줄기세포와 만능성을 연구하는데 가장 필요한 부분 중 하나이지만, 돼지 OCT4 상위 구역 기반 리포터 시스템에 대한 정보는 여전히 부족하다. 따라서 돼지 OCT4 조절 영역에 대한 이해를 높이기 위해 다양한 포유류의 게놈 서열을 이용하여 서열 기반 비교 분석을 통해 돼지 OCT4 프로모터 상위 구역의 보존된 영역을 식별하였다. 여러 포유류의 5’ 상위 구역에서 뉴클레오타이드 염기서열의 유사성은 낮았다. 그러나, OCT4 프로모터와 원위 인핸서 및 근위 인핸서를 포함하는 4개의 보존 조절 구역은 유사성이 높았다. 다음으로, 돼지 OCT4 프로모터 영역에 대한 기능 분석을 수행하였다. 루시퍼레이즈 리포터 분석 결과를 통해 돼지 OCT4 원위 인핸서와 근위 인핸서가 각각 쥐 배아줄기세포와 쥐 배아 암세포에서 높게 활성화됨을 알 수 있었다. 이중 리포터 분석에서 나이브와 프라임드 상태 마커 유전자 발현을 분석한 결과 형광 신호가 높은 발현을 보이는 세포와 낮은 발현을 보이는 세포 간의 마커 유전자 발현 수준이 서로 다르다는 것을 보여주었다. 다른 종에서 만들어진 OCT4 상위 구역 기반 리포터 시스템과 유사하게, 돼지 OCT4 상위 구역 기반 리포터 시스템은 만능성 상태에 따라 배타적인 발현 패턴을 보였다. 이 연구는 돼지 OCT4 상위 조절 구역과 다양한 OCT4 형광 리포터 구조에 대한 기초 정보를 제공하였고, 이 결과는 추후 초기 배아 발달과 돼지 배아줄기세포의 확립에 있어 종 특이적 만능성을 연구하는 데 응용될 수 있다. 이어서, 돼지 리프로그래밍에서 돼지 OCT4 인핸서의 활성과 기능을 조사하였다. 만능성의 주 조절 인자 중 하나인 OCT4의 상위 조절 구역에 의해 조절되는 이중 형광 단백질 리포터 시스템은 만능성의 메커니즘에 관한 연구에 널리 사용된다. 그러므로 이전에 구축한 돼지 특이적 리포터 시스템을 사용하여 이 리포터 시스템이 FGF- 혹은 LIF- 의존적으로 리프로그램된 돼지 만능성 줄기세포에서 기능하는지 분석하였다. 돼지 배아 섬유아세포에 원위 인핸서와 코어 프로모터가 포함된 녹색 형광 단백질 벡터 pOCT4-∆PE-eGFP (DE-GFP)와 근위 인핸서와 코어프로모터가 포함된 적색 형광 단백질 벡터 pOCT4-∆DE-DsRed2 (PE-RFP)를 도입하고, DOX-의존적 리프로그래밍 과정에서 녹색형광단백질과 적색형광단백질의 발현을 확인하였다. 돼지 유도만능줄기세포의 확립과정에서 만능성 마커 유전자의 발현 변화와 동시에 돼지 OCT4 원위 인핸서와 근위 인핸서가 다른 표현 패턴으로 활성화되었음을 확인하였다. 돼지 OCT4 상위 구역 기반 이중 형광 단백질 리포터 시스템은 돼지 유도 만능성 줄기세포의 확립을 위하여 세포가 살아있는 상태로 나이브와 프라임드 만능성을 지시해주는 역할을 한다. 이 연구는 돼지 OCT4 상위 구역 기반 이중 형광 리포터 시스템의 적용 가능성을 입증하며, 이는 돼지 유래 세포에서 종 특이적 만능성의 조사에 응용할 수 있다. 마지막으로, 돼지 배아 줄기세포에서 이전에 구축한 돼지 특이적 OCT4 리포터 시스템의 기능을 분석하였다. 돼지 배아에 원위 인핸서와 코어 프로모터가 포함된 녹색형광단백질 벡터 pOCT4-ΔPE-eGFP (DE-GFP)와 근위 인핸서와 코어 프로모터가 포함된 적색형광단백질 벡터 pOCT4-ΔDE-DsRed2 (PE-RFP)를 미세주입법으로 도입하였다. 이렇게 돼지 OCT4 리포터 시스템을 포함하는 배아에서 발달한 배반포에서 배아줄기세포를 확립하였다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응과 공초점 현미경을 사용하여 녹색형광단백질과 적색형광단백질의 mRNA 및 단백질 발현을 분석하였다. 도입된 리포터 시스템은 만능성을 가지고 있는 세포에서 작동할 수 있고 배아줄기세포에서는 녹색형광단백질과 적색형광단백질의 발현이 동시에 관찰되었다. 원위 인핸서와 근위 인핸서의 발현 수준을 다른 나이브 및 프라임드 상태의 만능성 세포와 비교했을 때, 돼지 배아줄기세포는 나이브 상태가 아니라 프라임드 상태에 가깝다는 것을 확인하였다. 또한 리포터 시스템은 배아줄기세포가 만능성을 잃어버리는 분화 후에 기능이 비활성화 되는 것을 확인하였다. 또한 돼지 OCT4의 ChIP-seq을 통해 돼지 OCT4 단백질과 게놈 시퀀스 간의 결합 위치를 분석하였다. 돼지 OCT4 ChIP-seq 데이터는 시퀀스 분석으로 얻은 돼지 OCT4 상위 조절 구역의 분석 결과를 뒷받침해주었으며, 추후 연구에 기반이 될 수 있는 후보군을 제시하였다. 결과적으로 이 연구는 돼지 OCT4 상위 구역 기반 이중 형광 리포터 시스템의 적용 가능성을 입증하는 사례가 될 수 있으며, 이는 돼지 기원의 세포에서 종 특이적 만능성의 연구에 응용될 수 있다. 또한, 이 리포터 시스템은 돼지 특이적 만능성, 돼지 초기 배아 발달과 배아줄기세포 연구에 유용한 도구로 사용될 수 있다.

유전자 편집 전분화능줄기세포의 테트라사이클린-조절 시스템이 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포로의 분화 과정 중 보이는 유전자 침묵(gene silencing)에 관한 연구

최명훈 차의과학대학교 일반대학원 2024 국내석사

유도만능줄기세포(iPSC)는 체세포를 재프로그래밍해 배아와 유사한 전분화 능력을 갖는 세포로, 재생의학 및 세포치료 분야에서 획기적인 돌파구를 제공하고 있다. iPSC는 조혈모세포(HSC), 내피세포(EC), 신경전구세포(NPC) 등 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있어, 유전자 편집 및 맞춤형 세포 치료제 개발에 중요한 플랫폼으로 주목받고 있다. 그러나 유도만능줄기세포를 분화시키는 과정에서 도입된 형질전환 유전자가 발현되지 않는 유전자 침묵(transgene silencing) 현상은 세포 치료제의 효능과 안전성에 큰 도전 과제로 작용한다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 AAVS1 safe harbor locus에서 유전자 편집을 수행한 유도만능줄기세포를 다양한 세포 계통으로 분화시키고, 분화 과정에서 발생하는 유전자 침묵 현상을 분석하였다. 특히, 테트라사이클린 유도성 시스템을 형질도입한 유도만능줄기세포에서 분화 후 특정 시점에 유전자가 침묵되는 현상을 확인하였으며, 이러한 침묵 현상이 세포 유형 및 분화 경로에 따라 달라지는 것을 관찰하였다. 이를 해결하기 위해 소디움 뷰티레이트(sodium butyrate) 및 아자시티딘(azacitidine)과 같은 후성유전학적 저분자 억제제를 처리하여 유전자 침묵을 완화하고, 분화된 세포에서 안정적인 유전자 발현을 유지하는 전략을 탐구하였다. 이 연구는 유도만능줄기세포의 유전자 편집 및 분화 과정에서 발생하는 후성유전학적 변화와 유전자 발현 패턴을 심층적으로 분석하고, 유전자 침묵을 극복하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 이러한 접근은 유전자 편집 유도만능줄기세포 기반의 세포 치료제 개발 및 임상 적용에서 신뢰성과 효율성을 높이는 데 기여할 것으로 기대된다. 나아가, 본 연구는 후성유전학적 조절 기법을 활용해 유전자 발현을 장기적으로 유지하고, iPSC 기반 맞춤형 치료제 개발을 가속화하는데 중요한 기반을 마련한다. 핵심되는 말: 유전자 편집, 테트라사이클린 유동성 시스템, 유전자 침묵, 유도만능줄기세포, 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포, 소디움 뷰티레이트, 아자시티딘 Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized the fields of regenerative medicine and cell therapy by providing a virtually unlimited source of cells capable of differentiating into various lineages, including hematopoietic stem cells (HSCs), endothelial cells (ECs), and neural progenitor cells (NPCs). iPSCs play a pivotal role as platforms for gene editing and the development of personalized cell-based therapies. However, transgene silencing during differentiation remains a significant challenge, potentially compromising the efficacy and safety of cell therapies. In this study, we utilized the CRISPR/Cas9 system to perform gene editing at the AAVS1 safe harbor locus in iPSCs and analyzed transgene silencing during their differentiation into various cell lineages. Notably, we observed transgene silencing in iPSCs with a tetracycline-inducible system following differentiation, with suppression patterns varying depending on cell type and differentiation pathways. To address this issue, we investigated the use of epigenetic small-molecule inhibitors such as sodium butyrate and azacitidine to mitigate gene silencing and maintain stable transgene expression in differentiated cells. This study provides a comprehensive analysis of epigenetic changes and gene expression patterns during the differentiation of gene-edited iPSCs, offering new insights into overcoming transgene silencing. Our findings are expected to enhance the reliability and efficiency of gene-edited iPSC-based cell therapies in clinical applications. Furthermore, this research lays the foundation for long-term maintenance of transgene expression through epigenetic regulation, accelerating the development of personalized iPSC-based therapeutics for a wide range of diseases. Key words: Gene editing, tetracycline-inducible system, transgene silencing, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, endothelial cells, neural progenitor cells, sodium butyrate, azacitidine