신경계 발달과정에서 JAKS의 발현 변화 및 그 역할 : The Role of JAKS During Neurogenesis

김윤희 아주대학교 2011 국내박사

뇌는 각각 분리되어 있는 뉴런들로 구성되어 있다. 이 뉴런(Neuron)들은, 구조적, 신진 대사적(metabolic), 그리고 기능적으로 독립적이다. 신경정보는 뉴런간의 시냅스(synapse)를 통해 전달된다. 또한, 뇌에 존재하는 또 다른 형태의 세포인 교세포(glialcell, gliaor neuroalia)는 뉴런의 활동을 보조한다. 신경전구세포(Neural progenitor cells, NPCs)는 성장인자를 공급받아 증식하거나, 뉴런 또는 교세포(Astrocyte, Oligodendrocyte등)의 뇌세포로 분화한다. 신경퇴행성 질환으로 고통받고 있는 환자들을 위해, 이런 신경전구세포를 이용해서 신경재생에 관한 많은 연구가 되고 있다. 이 신경전구세포를 배양해서 죽은 세포가 있던 부분에 이식한 후, 이 세포가 분열하여 신경세포로 분화하고 그 전에 하던 일을 하게 된다면 완전한 치료가 될 것이다. 따라서 신경전구세포의 생존과 분화를 조절하는 인자에 대한 이해가 필요하다. 이번 연구에서 배아 뇌에서 분리한 신경전구세포를 신경세포로 유도하는 기전에 대해 알아보았다. 먼저 뇌의 증식, 분화, 세포사하는 발달과정에 따라 대뇌에서의 Jaks 발현 변화를 관찰하였다. 마우스 배아뇌 11일부터 성인뇌가 되는 기간 동안 Jak3의 활성화 형태인 phospho form Jak3는 배아뇌 13일부터 증가하다가 생후 20일부터 감소되어 성체 뇌에서 확연히 발현이 감소한다. 반면, pJak2는 배아 15일부터 증가하여 성체 뇌에서 다량 발현한다. 신경전구세포 마커 중 하나인 Nestin과 pJak3의 발현을 배아 13일 뇌에서 비교해본 결과, 비슷한 부분에서 발현하고 있음을 면역염색을 통해 알 수 있다. Jaks이 뇌 발달 동안 신경전구세포에서 어떤 역할을 하는지 신경전구세포배양법을 이용하여 알아보았다. In vitro 배양한 분화하지 않은 신경전구세포(한 개세포 또는 sphere형태세포)는 pJAK3를 발현한다. JAK3 억제제 처리는 pJAK3 발현을 감소시키고 TUJ1과 MAP2를 발현하는 Neurite growth와 migration을 유도하였다. 날짜가 지남에 따른 형태적 변화를 분석해 보았다. 성장인자가 있는 조건에서 신경전구세포는 날짜가 지남에 따라 뉴런과 교세포로 점차 분화하였다. Jak3 억제제 처리는 전구세포의 비율은 줄이면서 뉴런과 oligodendrocye의 분화를 증가시키고, Astrocyte의 분화는 감소시켰다. mRNA level에서 Jak2 억제제와 달리 Jak3 억제제에 의해 Tuj1, Olig2, Ncam 발현이 증가되었고, protein level에서 뉴런의 마커인 MAP2, Tuj1와 oligodendrocyte marker인 NG2, O4 발현이 WHI-p154 1, 3 μM 농도에 따라 증가하였다. 억제제 또는 siRNA를 사용하여 JAK2와 JAK3를 각각 억제시켜 형태적변화, 유전자변화, 단백질 변화를 확인해보았을 때, JAK2억제는 전반적인 세포의 증식과 분화를 억제하는 양상을 띄었고, JAK3억제는 뉴런과 oligodendrocye의 분화를 증가시키면서 astrogenesis는 억제했다. JAK3 억제에 의해 일어나는 뉴로제네시스 현상은 성장인자 고갈로 인한 apoptotic 세포사의 과정에서도 나타났다. 신경전구세포는 bFGF나 EGF같은 성장인자가 없으면 세포사하게 되는데, JAK3 억제제에 의해 분화되어 생존하고 분열했다. 위의 현상을 일으킬수 있는 뉴런분화조절인자들 중에는 Hes가 있다. Hes1은 신경전구세포의 증식을 유도하면서 뉴론분화인자인 Ngn을 억제한다. 뉴런분화시기에는 Hes6가 발현하면서 Hes1을 억제하여 뉴론으로의 분화를 촉진한다. 본 실험에서 JAK3 억제제는 신경전구세포에서 Hes6의 발현을 증가시키고, Hes1의 발현을 감소시키고, Ngn2, NeuroD의 발현을 증가시킴을 확인했다. 이 결과로 신경전구세포의 진화과정에서 뉴로제네시스는 JAK에 의해 조절되고, 이로 인한 신경전구세포의 분화는 Hes, Ngn, NeuroD 조절 기전에 의해 MAP2, TUJ1 같은 뉴런마커를 유도함을 밝힘으로써, 신경전구세포에서 JAK3의 역할을 규명하였다.

Isolation, molecular characterization, and transplantation of PSA-NCAM(-) neural crest stem cells from human pluripotent stem cells

이동진 Graduate School, Yonsei University 2017 국내박사

Tumorigenic potential of human pluripotent stem cells (hPSCs) is an important issue in clinical applications. To minimize and eliminate risk factors of tumor formation, strategies have been proposed to predifferentiate hPSCs into specific cell types in vitro or to isolate desired cell types via targeted cell sorting before their applications. Despite many efforts, PSC-derived neural precursor cell (NPC)-based therapeutic strategies have repeatedly resulted in tumor formation even though pluripotent cells were not detected when treating neurological disorders of the central nervous system (CNS) in animal models. In identifying risk factors for the tumorigenicity of NPC-based transplantation therapy, previous attempts have overlooked a key neurodevelopmental process - the emergence of multipotent neural crest stem cells (NCSCs) during the early neural induction process. Heterogeneity of the ‘early’ SOX1- and PAX6-expressing NPCs were carefully evaluated and found that polysialic acid-neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM)-negative cells among the early NPCs caused tumorigenesis, whereas PSA-NCAM+ cells were nontumorigenic. Comprehensive molecular profiling, global gene analysis, and multilineage differentiation of PSA-NCAM- cells strongly support that they are multipotent NCSCs that could differentiate into both ectodermal and mesodermal lineages. The following study also demonstrated that the removal of PSA from PSA-NCAM+ cells leads to increased neural crest marker expression. Transplantation of PSA-NCAM- cells in a gradient manner mixed with PSA-NCAM+ cells resulted in a proportional increase in mesodermal tumor formation and unwanted grafts such as PERIPHERIN+ cells or pigmented cells in the rat brain. Therefore, this study suggest that NCSCs are a new player for tumorigenesis in hPSC-derived NPC-based therapy and removal of PSA-NCAM- cells eliminates the tumorigenic potential originating from NCSCs after transplantation into the CNS. 인간 전분화능줄기세포(human pluripotent stem cells, hPSCs)의 발암 잠재력(tumorigenic potential)은 임상 적용에 있어서 중요한 문제이다. 현재까지는 종양 형성의 위험 요인을 최소화하고 제거하기 위해 인간 전분화능줄기세포를 특정한 세포로 선분화(pre-differentiation)하거나 표적 세포만 선별하여 분리시키는 전략이 이용되어 왔다. 그러나 인간 전분화능줄기세포 유래 신경전구세포를 중추 신경계(central nervous system, CNS) 질환 동물모델의 세포 치료에 이용하는 경우, 전분화능줄기세포가 검출되지 않음에도 반복적으로 종양이 형성되는 결과가 도출되었다. 이는 신경전구세포를 기반으로 한 이식치료의 위험인자를 확인하는 과정 중 중요한 신경 발달과정 중 하나인 다분화능 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)의 발생을 간과했기 때문이었다. 본 연구는 신경전구세포 기반치료의 원천세포인 SOX1과 PAX6를 동시 발현하는 신경전구세포를 분석하여 polysialic acid-neural cell adhesion molecule(PSA-NCAM) 음성세포가 초기 신경전구세포 배양 개체군을 오염시키며 이질성의 원인이 된다는 것을 밝히고, 그들이 종양 형성의 위험 요인이라는 것을 확인하였다. 또한 종합적인 분자 프로파일링, 글로벌 유전자 분석 및 유도분화를 통하여 PSA-NCAM 음성세포가 외/중배엽 계통으로 분화 가능한 다분화능 신경능선줄기세포임을 확인하였다. 본 연구에서 PSA를 PSA-NCAM 양성세포에서 제거하였을 때 신경능선줄기세포의 마커 발현이 증가하였고, PSA-NCAM 양성 그리고 음성세포를 단계적으로 혼합하여 쥐의 뇌에 이식하였을 때, 중배엽 유래 종양 및 PERIPHERIN 양성세포와 색소세포의 형성이 비례하여 증가하는 결과가 도출되었다. 따라서 본 연구를 통하여 신경능선줄기세포가 인간 전분화능줄기세포 유래 신경전구세포 기반치료에 있어 새로운 종양형성 인자임을 제안하며 중추 신경계에 이식치료 시 PSA-NCAM 음성세포를 제거하는 것이 발암 가능성을 억제한다고 판단한다.

Dibutyl phthalate impairs the proliferation of neural progenitor cells and hippocampal neurogenesis

이원종 부산대학교 대학원 2019 국내석사

디부틸프탈레이트는 일반적으로 가소제로 사용되며 내분비계 장애 물질이다. 그로 인해 종양, 선천적 결함 및 발달 장애를 일으킬 수 있다. 게다가, 신경돌기 성장을 억제하고 학습 및 기억을 손상시킨다는 몇몇 연구가 있지만, 신경전구세포에 대한 신경 독성은 아직 조사되지 않았다. 본 연구는 디부틸프탈레이트가 신경전구세포와 해마신경재생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 수행되었다. 높은 농도의 디부틸프탈레이트 (500 μM)는 세포 생존률과 상관없이 G1기의 세포주기 정지를 유발하였고, 이는 DNA 손상의 확인을 통해 알 수 있었다. 그 뿐 아니라 신경전구세포에 디부틸프탈레이트를 처리했을 때 활성산소종 수치가 증가했으며 미토콘드리아 기능 장애를 보였다. 해마신경재생성 및 인지기능을 평가하기 위해 생쥐에게 2주간 디부틸프탈레이트 (10 또는 50 mg/kg)를 복강 내 투여했다. 그 결과 투여군의 해마에서 새로 생성된 신경세포가 유의적으로 감소했고 모리스 수중 미로 테스트를 통해 50 mg/kg 투여군에서 공간 학습과 기억력이 손상된 것을 확인하였다. 결과적으로 본 연구는 디부틸프탈레이트가 신경전구세포 및 해마신경재생성에 해로운 영향을 미치고 학습 및 기억 기능 부전을 초래할 수 있음을 시사한다. Dibutyl phthalate (DBP) is commonly used plasticizer and a known endocrine disruptor that can cause tumors, birth defects, and developmental disorders. Although several studies have reported that DBP has neurotoxic effects on neurite outgrowth and on learning and memory, its neurotoxic effects on neural progenitor cells (NPCs) have not been investigated. The present study was undertaken to determine the effects of DBP on NPCs and hippocampal neurogenesis. At high concentration DBP (500 μM) retarded NPC proliferation without affecting cell viability by arresting the cell cycle at G1 but did not cause cell death. DNA damage was observed by examining p53 expression and by γH2AX staining. DBP-treated cells had elevated ROS levels and exhibited mitochondrial dysfunction, which can cause DNA damage. Adult hippocampal neurogenesis was investigated using BrdU immunohistochemistry in young male C57BL/6 mice (5 weeks old) intraperitoneally administrated with vehicle or DBP (10 or 50 mg/kg) for 2 weeks. DBP administered mice were found to have significantly fewer newly generated neurons in hippocampi, and the Morris water maze test revealed that DBP (50 mg/kg) impaired spatial learning and memory. Taken together, these findings suggest that DBP has harmful effects on NPCs and hippocampal neurogenesis and that DBP exposure could lead to learning and memory dysfunctions.

Behavioral improvement after transplantation of neural precursors derived from embryonic stem cells into globally ischemic brain of adolescent rats

강훈철 Graduate School, Yonsei University 2006 국내박사

최근 중추신경계 질환의 세포 치료에 대한 연구의 발전으로 인해 중추신경계 손상을 실질적으로 회복시킬 수 있는 가능성이 제시되고있다. 본 연구는 황색 형광을 발현하는 단백을 가진 쥐 배아줄기세포를 기질 유래 유발 요소를 배출하는 PA6 기질 세포주와 공동 배양하여, 신경세포와 아교세포를 포함한 신경전구세포로 분화시킨 후 광범위 뇌허혈 손상이 유발된 흰쥐의 양쪽 해마체 C3 영역에 이식 후, 해부학적 기능적 회복을 관찰하고자 하였다. 시험관내 배아줄기세포의 분화는 면역 형광, RT-PCR, 전기생리 검사를 통해 다양한 신경 전구 세포로의 분화를 확인할 수 있었다. 이식 후8주간 생체내 배아 줄기세포의 신경세포 및 아교세포로의 분화 및 손상 조직 내 통합과 세포 이동을 관찰할 수 있었다. 인지 능력과 운동 능력을 평가하기 위해 시행한 Morris 수중 미로 검사에서 대조군에 비해 이식 쥐의 의미있는 능력 향상을 관찰할 수 있었고, 개방 영역 활동도 검사에서는 이식 쥐가 대조군에 비해 활동도가 증가하는 경향을 관찰하였다. 관찰 기간 2개월 간 기형종 발생은 없었다. 신경전구세포로 분화된 배아줄기세포을 이식함으로서 종양의 형성없이 중주신경계 허혈성 손상의 회복을 관찰할 수 있었다. Recent research into cell replacement therapy of the central nervous system has raised hopes that researchers can find ways to actually repair central nervous system damage. The purpose of the present study was to determine whether transplantated neurally-predifferentiated mouse embryonic stem (ES) cells can integrate and differentiate into mature neurons and glial cells in damaged brains and improve functional deficits caused by globally cerebral ischemic injury in adolescent rats. From predifferentiated precursors, we were able to generate neural lineages, including neurons and glial cells. Specifically, mouse ES cells that display enhanced expression of yellow fluorescent protein were co-cultured in N2 supplemented media with a stromal line of PA6 cells that had stromal derived inducing activity. We confirmed that the ES cells became neurons and glia by immunostaining, RT-PCR and electrophysiologic analysis. The cells that had been co-cultured were transplanted into bilateral hippocampal C3 regions of post-globally ischemic brains of adolescent rats at 14 days after 20-minute occlusion of both carotid arteries combined with cauterization of bilateral vertebral arteries. After 8 weeks following transplantation, efficient integration, migration and generation of neural cells including neurons, astrocytes, and oligodendrocytes from grafted ES cells could be observed. ES cells-transplanted animals exhibited enhanced functional recovery on neurological and behavioral tests, compared to vehicle control-treated animals. Therefore, transplantation of neurally-predifferentiated mouse ES cells shows promise for improving recovery after global ischemia in adolescent rats.

반복 스트레스에 의한 흰쥐 해마조직내 신경전구세포의 생성과 BDNF mRNA 발현에 미치는 Ginseng total saponin의 효과 연구

곽규환 고려대학교 대학원 2003 국내석사

홍삼은 전통적으로 항스트레스 작용과 기억과 학습을 향상시키는 것으로 알려져 왔으며, 그 기전에 acetylcholine 등이 관여하는 것으로 추정되어 왔다. 그러나 최근 해마 부위에서 신경전구세포가 생성되고, 이는 학습과 기억에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편 해마 에 존재하는 신경성장인자중 BDNF는 신경전구세포의 생성과 기억 및 학습에 중요한 작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 스트레스에 노출시 BDNF의 발현과 신경전구세포의 생성이 저하되고, 이는 인지기능저하와 관여하는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 홍삼 성분에 의한 신경전구세포의 생성과 BDNF의 발현에 관한 연구는 그리 많지 않은 실정이다. 본 연구에서는 반복 스트레스에 노출시 신경전구세포의 생성과 BDNF mRNA의 발현에 미치는 홍삼 성분 사포닌의 반복 투여효과를 관찰하였다. 연구결과 고려홍삼 사포닌의 반복 투여시 해마 SGZ 부위에서 신경전구세포의 생성이 유의하게 증가되었으며, 이와 같은 경향은 반복 스트레스에 노출되어도 유지되었다. 고려홍삼 사포닌의 반복 투여시 해마 CA3와 CA1 부위에서 BDNF mRNA의 발현이 증가되었으나, 반복 스트레스에 의한 BDNF mRNA의 감소를 차단하지 못하였다. 따라서 고려홍삼 사포닌 반복 처치에 의한 해마 신경전구세포의 생성에 BDNF 보다는 다른 요인이 관여할 가능성이 크며, 고려홍삼 사포닌 반복 투여에 의한 해마 신경전구세포의 생성 증가와 BDNF mRNA의 발현 증가는 홍삼에 의한 기억과 학습 증진 작용에 기여할 것으로 추정된다. Korean red ginseng is known to have anti-stress and memory enhancing effects. Recent studies demonstrated that the production of neural progenitor cells in hippocampus, a process termed neurogenesis, occurs in a variety of adult mammals including rats, macaque monkeys, and humans. Stress has been shown to reduce adult neurogenesis in the hippocampus, which may be, in part, related with diminished performance of hippocampus-dependent tasks by stress. On the other hand, hippocampus is believed to mediate negative feedback inhibition of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, which may reduce stress-induced HPA activation. Recent studies suggested that stress-induced inhibition of adult neurogenesis in hippocampus may contribute, in part, to decreased negative feedback inhibition of HPA axis. In order to elucidate the mechanism of Korean red ginseng in anti-stress and memory enhancing effects, we observed the effects of repeated treatment of Korean red ginseng total saponin (GTS, 50mg/kg, i.p.) in response to repeated unpredictable stress for 10 days. Male Sprague-Dawley rats (230-260g) received with either GTS (50mg/kg, i.p.) or vehicle (1ml/kg, i.p.) 1 h before stress for 10 days. Rats were injected with bromodeoxyuridine (BrdU, 50mg/kg, i.p.) 16-18 hr after last stress procedure, and were sacrificed 2 hr later by perfusion. Immunohistochemistry of BrdU was done to measure proliferation of neural progenitor cells in hippocampus, which was used as an index of neurogenesis. BDNF mRNA was measured in subregions of hippocampus by in situ hybridization. Repeated GTS treatment for 10 days increased neurogenesis in subgranular zone area of dentate gyrus (SGZ), but not hilus, compared with vehicle-treated rats. Repeated unpredictable stress did not affect the neurogenesis compared with controls, while repeated GTS treatment increased neurogenesis in SGZ in repeated unpredictable stress-exposed group. BDNF mRNA expression in CA3 and CA1 pyramidal cell layer was increased by repeated GTS treatment but not in dentate granule cell layer. Repeated unpredictable stresses significantly decreased BDNF mRNA expression in all subregions of hippocampus, but repeated GTS treatment did not prevent stress-induced BDNF mRNA downregulation. Given that repeated GTS treatment increased proliferation of neural progenitor cells in repeated unpredictable stress-exposed rats in the presence of decreased BDNF mRNA expression in dentate granule cell layer, it raise the possibility that BDNF may not play a significant role in GTS-mediated increase of neurogenesis in adult rat hippocampus. Also, these results suggest that repeated GTS treatment increased neurogenesis of SGZ and BDNF mRNA expression, which may account for memory enhancing effect of Korean red ginseng. In addition, repeated GTS treatment appears not to have anti-stress effects in terms of neurotrophin, but GTS-mediated increase of neurogenesis in hippocampus may contribute to increase negative feedback inhibition of HPA axis.

유전자 편집 전분화능줄기세포의 테트라사이클린-조절 시스템이 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포로의 분화 과정 중 보이는 유전자 침묵(gene silencing)에 관한 연구

최명훈 차의과학대학교 일반대학원 2024 국내석사

유도만능줄기세포(iPSC)는 체세포를 재프로그래밍해 배아와 유사한 전분화 능력을 갖는 세포로, 재생의학 및 세포치료 분야에서 획기적인 돌파구를 제공하고 있다. iPSC는 조혈모세포(HSC), 내피세포(EC), 신경전구세포(NPC) 등 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있어, 유전자 편집 및 맞춤형 세포 치료제 개발에 중요한 플랫폼으로 주목받고 있다. 그러나 유도만능줄기세포를 분화시키는 과정에서 도입된 형질전환 유전자가 발현되지 않는 유전자 침묵(transgene silencing) 현상은 세포 치료제의 효능과 안전성에 큰 도전 과제로 작용한다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 AAVS1 safe harbor locus에서 유전자 편집을 수행한 유도만능줄기세포를 다양한 세포 계통으로 분화시키고, 분화 과정에서 발생하는 유전자 침묵 현상을 분석하였다. 특히, 테트라사이클린 유도성 시스템을 형질도입한 유도만능줄기세포에서 분화 후 특정 시점에 유전자가 침묵되는 현상을 확인하였으며, 이러한 침묵 현상이 세포 유형 및 분화 경로에 따라 달라지는 것을 관찰하였다. 이를 해결하기 위해 소디움 뷰티레이트(sodium butyrate) 및 아자시티딘(azacitidine)과 같은 후성유전학적 저분자 억제제를 처리하여 유전자 침묵을 완화하고, 분화된 세포에서 안정적인 유전자 발현을 유지하는 전략을 탐구하였다. 이 연구는 유도만능줄기세포의 유전자 편집 및 분화 과정에서 발생하는 후성유전학적 변화와 유전자 발현 패턴을 심층적으로 분석하고, 유전자 침묵을 극복하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 이러한 접근은 유전자 편집 유도만능줄기세포 기반의 세포 치료제 개발 및 임상 적용에서 신뢰성과 효율성을 높이는 데 기여할 것으로 기대된다. 나아가, 본 연구는 후성유전학적 조절 기법을 활용해 유전자 발현을 장기적으로 유지하고, iPSC 기반 맞춤형 치료제 개발을 가속화하는데 중요한 기반을 마련한다. 핵심되는 말: 유전자 편집, 테트라사이클린 유동성 시스템, 유전자 침묵, 유도만능줄기세포, 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포, 소디움 뷰티레이트, 아자시티딘 Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized the fields of regenerative medicine and cell therapy by providing a virtually unlimited source of cells capable of differentiating into various lineages, including hematopoietic stem cells (HSCs), endothelial cells (ECs), and neural progenitor cells (NPCs). iPSCs play a pivotal role as platforms for gene editing and the development of personalized cell-based therapies. However, transgene silencing during differentiation remains a significant challenge, potentially compromising the efficacy and safety of cell therapies. In this study, we utilized the CRISPR/Cas9 system to perform gene editing at the AAVS1 safe harbor locus in iPSCs and analyzed transgene silencing during their differentiation into various cell lineages. Notably, we observed transgene silencing in iPSCs with a tetracycline-inducible system following differentiation, with suppression patterns varying depending on cell type and differentiation pathways. To address this issue, we investigated the use of epigenetic small-molecule inhibitors such as sodium butyrate and azacitidine to mitigate gene silencing and maintain stable transgene expression in differentiated cells. This study provides a comprehensive analysis of epigenetic changes and gene expression patterns during the differentiation of gene-edited iPSCs, offering new insights into overcoming transgene silencing. Our findings are expected to enhance the reliability and efficiency of gene-edited iPSC-based cell therapies in clinical applications. Furthermore, this research lays the foundation for long-term maintenance of transgene expression through epigenetic regulation, accelerating the development of personalized iPSC-based therapeutics for a wide range of diseases. Key words: Gene editing, tetracycline-inducible system, transgene silencing, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, endothelial cells, neural progenitor cells, sodium butyrate, azacitidine

배양 환경에 따른 인간 신경전구세포의 발현 패턴에 대한 연구 : 신경전구세포의 발현 패턴

최대한 가천대학교 메디컬캠퍼스 일반대학원 2024 국내박사

최근 3차원 세포 또는 조직 오가노이드에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있는데, 이를 통해 태아 조직 이식과 관련된 실직적인 문제를 극복할 수 있을 뿐만 아니라 손상된 척수 재생을 위한 잠재적인 소스를 제공할 수 있을 것으로 기대하고 있다. 이 연구에서 우리는 태아 척수에서 파 생된 인간 신경전구세포 (hNPC)가 2차원, 3차원 및 조직 오가노이드 시스템에서 무혈청 배지에서 배양될 수 있음을 보여주었다. 또한 2차 원, 3차원 및 오가노이드와 같은 조직에서 프로테오글리칸, 콜라겐 또 는 미엘린의 발현과 함께 시간 경과에 따른 형태학적 변화를 조사하였 다. 2차원 세포는 고전적인 방추 형태를 보인 반면, 3차원 세포는 카 페트처럼 말리는 미분화 세포 및 세포판 클러스터로 성장하였다. 면역 염색은 2차원 세포 또는 조직 유사 오가노이드에서 TUJ-1, MAP-2, GAD 65/67 및 ChAT의 발현을 입증하기 위해 수행되었고 양성으로 염색되었 다. 본 실험에서 연구된 오가노이드 배양 시스템은 향후 척수 손상의 치료 매개체로 이용되거나, 인체 반응 개선 및 질병 치료를 위한 신약 개발에 필요한 재료로 이용될 수 있을 것으로 기대한다.

광혈전성 뇌허혈 후 신경전구세포의 이동에서 matrix metalloproteinase의 역할

강성수 전남대학교 대학원 2007 국내박사

최근 뇌 허혈손상 후에 많은 신경모세포들이 뇌실하층으로부터 손상부위로 이동한다는 연구들이 보고되었다. 그러나 뇌실하층 내의 어떠한 종류의 세포들이 어떤 기전에 의해 손상부위로 이동하는지에 대해서는 알려진 사실들이 많지 않다. Nestin은 신경줄기세포를 확인하는데 널리 사용되는 중간세섬유이다. 본 연구는 대뇌피질의 허혈 후에 손상부위로 이동하는 nestin 양성인 신경줄기세포들의 특징들을 알아보기 위해서 시행되었다. 신경줄기세포의 이동을 효과적으로 보여주기 위해서 nestin-eGFP 형질전환 생쥐를 사용하였고 국소 뇌허혈을 일으키기 위해 rose bengal을 생쥐의 복강 내로 투여한 후 (30 ㎎/㎏) 냉광을 조사하여 광혈전을 유발하였다. 광혈전을 유발 시킨 지 7일 후에 생쥐를 심장관류 시키고 뇌를 적출하여 고정한 후 40 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. Nestin-eGFP 세포들은 대뇌피질의 손상부위에서 광혈전성 뇌허혈 유발 후 5일과 7일째에 유의하게 증가하였다. Nestin 양성인 세포들의 이동을 DiI의 주입과 BrdU 형광염색으로 확인하였다. 일부의 nestin 양성세포들이 DiI 또는 BrdU와 동시에 염색이 되었다. Nestin에 양성인 세포들을 규정짓기 위해서 신경모세포의 표지인 DCX와 성상세포의 표지인 GFAP에 대한 면역형광염색을 수행하였다. 일부의 nestin 양성세포들은 DCX과 면역염색반응이 일치하였지만 GFAP와는 어떠한 세포도 일치하지 않았다. MMP 저해제인 FN-439를 사용한 MMP 억제는 뇌허혈 후 7일째에 경색부위 주변의 nestin 양성세포를 감소시켰다. 그러나 MMP-9은 경색부위 주변의 nestin 양성세포들과 동시에 발현되지 않았다. 이와 같은 결과는 MMP-9이 광혈전성 국소 뇌허혈 후에 nestin 양성인 신경전구세포들의 대뇌피질 손상부위로의 이동에 기여하고 있음을 시사한다. Recent studies have shown that many neuroblasts migrate from the subventricular zone (SVZ) into the injured area after ischemic brain insults. However, it has not been well understood that which mechanism mediates this ectopic migration and which types of cells in SVZ migrate into the damaged region. Nestin is an intermediate filament protein widely used to identify neural stem cells. The present study was aimed at investigating the characteristics of the migration of nestin+ neural stem cells toward the ischemic injury region after focal cortical ischemia. Nestin-eGFP transgenic mice were used to exhibit effectively the migration of neural stem cells. Photothrombotic ischemia was induced by the injection of rose bengal (30 ㎎/㎏) and the exposure to the cold light. At 7 day after photothrombosis, mice were transcardially perfused with 4% paraformaldehyde and the fixed brains were sliced (40 ㎛). The number of nestin+ cells was increased significantly in peri-infarct area at 5 and 7 day after photothrombosis. Migration of nestin+ cells was examined using DiI and BrdU labelling. Subset of the nestin+ cells was co-labelled with DiI or BrdU. For characterization of the nestin+ cells, immunofluorescent staining against doublecortin (DCX), a marker of neuroblast, and glial fibrillary acidic protein (GFAP), a marker of astrocyte, was performed. Some of the nestin+ cells were co-expressed with DCX but any nestin+ cells were not immunoreactive for GFAP. The inhibition of MMPs using MMP inhibitor, FN-439, decreased nestin+ cells in the peri-infarct region at 7 day after photothrombotic ischemia. However, MMP-9 was not co-expressed with the nestin+ cells in peri-infarct cortex. These results suggest that nestin+ neural progenitor cells migrate into the peri-infarct cortex after photothrombotic ischemia and MMP-9 is involved in the migration.

Screening of the neuronal differentiation related genes and proteins in central neurocytoma and its application in neural stem cell

신혜영 서울대학교 대학원 2010 국내박사

Efficient derivation of neural precursors and dopamine neurons from human embryonic stem cells and their application to a Parkinsonian rat model

고지윤 Graduate School, Yonsei University 2010 국내박사

Human embryonic stem (hES) cells can be guided to differentiate into ventral midbrain-type neural precursor (NP) cells that subsequently generate high yields of dopamine (DA) neurons. These findings indicate that hES-derived NP cells can be a prospective cell source to be used in cell replacement strategies for Parkinson’s disease (PD). To further clarify the prospect, we have scrutinized the properties of hES-NP cells in the points of (1) capability of these cells in stably providing human DA neurons in a large scale (2) cell survival and tumorigenic potentials which are the most critical issues for an effective and safe cell therapy. First, we investigated the potential of hES-NP cells for the large-scale generation of human DA neurons for functional analyses and therapeutic applications. To address this, hES-NP cells were expanded in vitro for 1.5 months with 6 passages, and their proliferation and differentiation properties determined over the NP passages. Interestingly, the total hES-NP cell number was increased by >2×104-folds over the in vitro period without alteration of phenotypic gene expression. They also sustained their differentiation capacity towards neuronal cells, exhibiting in vitro presynaptic DA neuronal functionality. Furthermore, the hES-NP cells can be cryopreserved without losing their proliferative and developmental potential. Taken together, these findings indicate that hES-NP cell expansion is exploitable for a large-scale generation of experimental and transplantable DA neurons of human-origin. In second part of this thesis, we describe cell survival and tumorigenic aspects of these hES-NP cells that are critical issues in cell therapeutic approaches for PD. Neuroepithelial rosettes, a potentially tumorigenic structure, disappeared during hES-NP cell expansion in vitro. Although a minor population of cells positive for Oct3/4, a marker specific for undifferentiated hES cells, persisted in culture during hES-NP cell expansion, they could be completely eliminated by subculturing hES-NPs under differentiation-inducing conditions. Consistently, no tumors/teratomas formed in rats grafted with multi-passaged hES-NPs. However, extensively expanded hES-NP cells easily underwent cell death during differentiation in vitro and after transplantation in vivo. Transgenic expression of Bcl-XL and sonic hedgehog (SHH) completely overcame the cell survival problems without increasing tumor formation. These findings indicate that hES-NP cell expansion in conjunction with Bcl-XL+SHH transgene expression may provide a renewable and safe source of DA neurons for transplantation in PD. In conclusion, we provide evidences for hES-NP cells as a continuous, stable, and on-demand source for human DA neurons. Multiple passaging of these NP cells helped for a large scale generation of human DA neuron free from tumor formation potentials. However, survival of the multi-passaged hES-NP cells was drastically decreased in vitro and in vivo after transplantation. Although transgene expression of Bcl-XL+SHH overcome the cell survival problem, the cell survival issue remain to be further studied.