효소변환을 통한 상백피 추출물의 티로시나제 저해제 생산

김은주 건국대학교 대학원 2013 국내박사

본 연구는 미백 화장품에 적용 가능한 기능성 화장품 신소재 개발을 하고자 70% 에탄올 상백피 추출물과 효소변환을 통한 생물전환 상백피 추출물을 제조하여 성분분석 하였다. HPLC 성분분석 결과 주 성분은 두 개의 포도당을 포함하고 있는 배당체 구조를 하고 있는 mulberroside A로 확인되었다. Mulberroside A를 효소변환 공정을 통하여 두 개의 당이 모두 제거된 비배당체인 oxyresveratrol로 생물전환 시의 최적 반응 조건을 조사하기 위하여 β-glucosidase, Novozyme, Accellerase로 10시간 처리한 결과 가장 효율성 높은 생물전환 효소로 Accellerase가 탐색되었다. Accellerase에 의한 생물전환 최적 온도와 pH 조건을 결정하기 위한 실험 결과로 Accellerase의 pH는 5.0-6.0, 온도는 40°C가 최적인 것으로 관찰되었다. 70% 에탄올 상백피 추출물과 생물전환 상백피 추출물의 항산화 활성의 변화를 조사하기 위해, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 상백피 추출물 생물전환 전, 후의 항산화 활성은 대표 대조군에 비해 큰 차이를 보이지 않는 것으로 확인되었다. 또한 상백피 추출물의 tyrosinase 저해 효과를 실험한 결과에서도 mulberroside A의 농도가 mushroom-tyrosinase에 대한 저해율을 결정하는 중요 인자임과 mulberroside A가 oxyresveratrol로 전환됨에 따라서 tyrosinase에 대한 저해율이 증가함을 알 수 있었다. 이는 배당체인 mulberroside A보다 비배당체인 oxyresveratrol의 tyrosinase 저해 효과가 월등히 높기 때문이다. L-tyrosine을 기질로 oxyresveratrol의 tyrosinase 저해 효과를 실험한 결과 미백 화장품 공시 시료인 arbutin 보다 oxyresveratrol이 기질의 농도에 따라서 보다 큰 감소효과를 보이는 것이 확인되었다. 생물전환 전, 후의 상백피 추출물의 세포 생존율 측정 결과 두 경우 모두 90% 이상을 유지하여 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 특히, B16-F10 세포를 이용한 각 각의 농도별 arbutin을 처리한 후와 농도별 oxyresveratrol을 처리한 후의 melanin 생성 저해율을 비교한 결과, 같은 농도에서의 arbutin에 비해 oxyresveratrol의 melanin 생성 저해능이 3.3배 우수한 것으로 나타났으며 농도가 높아짐에 따라 melanin 생성 저해 효과도 높아지는 것을 확인할 수 있었다. Arbutin 20 mg/mL과 arbutin 20 mg/mL에 oxyresveratrol 2 mg/mL을 첨가 하여 동시 사용 시의 억제효과는 arbutin 단독 사용 시와 비교하였을 때 3.5배의 상승 효과를 보였으며 oxyresveratrol의 농도의 증가에 따르는 상승효과는 큰 차이를 보이지 않았다. 같은 농도의 arbutin, 생물전환 전, 생물전환 후 상백피 추출물 20 mg/mL을 비교한 결과 arbutin에 비해 생물전환 전, 생물전환 후가 각 각 4배, 5배의 높은 melanin 저해 효과를 보였으며, arbutin에 농도별 생물전환 후 상백피 추출물 동시 사용 시의 melanin 생성 억제 실험 결과 생물전환 후의 상백피 추출물의 농도가 높아짐에 따르는 저해율에 있어 약간의 증가함만을 보여 기대 이상의 큰 상승효과가 관찰되지 않았다. Oxyresveratrol과 arbutin의 저해 형태를 분석한 결과 oxyresveratrol이 비경쟁적 저해 형태로 경쟁적 저해 형태의 arbutin보다 동일 몰수에서 120배 강한 저해력을 가지고 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 볼 때 생물전환 상백피 추출물은 resveratrol 보다 뛰어난 tyrosinase 저해 활성을 갖는 우수한 천연 식물 유래의 신소재로서 화장품 산업에서의 유용성이 클 것으로 사료된다.

연교추출물의 항산화활성및 화장품의 소재로서의 연구

양서진 건국대학교 대학원 2012 국내박사

Aspergillus niger와 Aspergillus usamii를 이용한 도라지 플라티코사이드의 생물전환 및 그 대사체 동정

안형진 서울대학교 대학원 2021 국내박사

도라지는 일본, 한국, 중국, 몽골과 같은 동아시아 국가들에서 2000년 이상 기침, 가래, 목 아픔, 폐 농양, 가슴 답답함 등의 호흡기 질환 증상에 전통적인 치료 요법으로 사용해 왔다. 도라지의 대표적인 생리활성물질로는 트리테르페노이드 사포닌 계열인 플라티코사이드가 알려져 있다. 도라지 내의 플라티코사이드는 재배 지역, 수확 시기, 재배 기간에 따라 함량이 다르며, 현재까지 70여 종의 플라티코사이드가 분리, 동정되었다. 플라티코사이드는 5환성의 올레난 구조의 3번 탄소와 28번 탄소에 glucose, laminaribiose, gentiobiose, arabinose, rhamnose, xylose, apiose 등의 당이 결합된 다양한 형태로 존재하며, 이에 따라 플라티코사이드의 생리활성 또는 장내 흡수율이 다르다. Platycodin D는 도라지의 플라티코사이드 중 많은 양을 차지하며 도라지의 생리활성을 나타내는 대표적인 물질로 한국에서 품질 관리의 지표 물질로 설정되어 있다. Platycodin D의 생리활성으로 항염증, 항종양, 항당뇨, 항비만, 항고지혈증, C형 간염 바이러스 복제 저해, 알레르기 관련 질병들의 저감화 등의 효과가 알려져 있다. 사포닌의 당 잔기는 생물전환을 이용하여 제거할 수 있으며, 당 잔기를 제거함으로 원하는 생리활성물질로 전환할 수 있다. 서로 다른 종류나 개수의 당 잔기를 가지는 동일한 아글리콘 골격의 사포닌 물질들은 서로 다른 생리활성이나 생체이용률을 나타낸다. 또한 사포닌 아글리콘 골격의 작용기의 변화에 따라서도 그 물질의 생리활성이나 생체이용률, 장내 미생물에 의한 대사가 변화한다. 인삼의 진세노사이드의 경우 이러한 당이나 작용기의 전환에 대한 연구가 많이 보고되어 있다. 하지만 도라지의 플라티코사이드의 경우 이러한 연구가 거의 되어있지 않은 상태이다. 따라서 본 연구에서는 식용이 가능한 미생물 균주들을 이용하여 도라지 내의 사포닌 계열의 생리활성물질인 플라티코사이드의 당 잔기 혹은 작용기를 전환하여 생리활성이나 생체이용률이 높은 대사체를 만들고, 그 물질을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 탐색하며, 생산한 대사체를 분리하고 구조를 확인하고자 하였다. 연구 1에서는 생물전환을 이용하여 도라지 내의 주요 생리활성물질인 platycodin D의 양을 증가시키기 위하여 platycodin D의 전구체인 platycoside E와 platycodin D3를 platycodin D로의 전환에 필요한 β-glucosidase 활성이 높은 식용 미생물을 탐색하고 생물전환 조건을 최적화하고자 하였다. 11개의 식용 미생물을 대상으로 실험한 결과, Aspergillus usamii의 β-glucosidase 활성이 가장 높았으며, 실제 기질인 platycoside E와 platycodin D3의 β-1, 6-glucosidic 결합을 분해하여 platycodin D로 전환하였다. 전환 효율을 높이기 위하여 조건을 최적화한 결과, 탄소원으로 cellobiose를 사용하였을 때 A. usamii의 β-glucosidase 활성이 4배 이상 높아졌으며, 그 조효소액을 사용하였을 때 platycoside E와 platycodin D3를 2시간 안에 99.9% 이상 platycodin D로 전환하여 platycodin D의 양이 2배 이상 증가하였다. 연구 2에서는 platycodin D의 생리활성이나 생체이용률을 높이기 위하여 식용 미생물 균주의 효소 활성을 이용하여 platycodin D의 당 잔기를 제거한 대사체들을 만들고 그 구조를 분석하고자 하였다. 이를 위하여 여러 식용이 가능한 미생물을 탐색하여 platycodin D의 생물전환에 필요한 β-glucosidase, β-xylosidase, α-rhamnosidase, esterase 활성이 높은 A. niger와 A. usamii를 선발하였다. 이들 균에 대하여 각각의 효소 활성을 선택적으로 높일 수 있는 탄소원을 탐색하여 cellobiose, xylose, rhamnose를 선정하였으며, 이 당을 첨가하여 배양한 각각의 조효소액을 이용하여 platycodin D를 전환하였다. HPLC와 electrospray ionization triple quadrupole LC/MS를 이용하여 분석한 결과, 전환한 대사체는 deapiosyl-xylosylated platycodin D, deapiosyl-xylosyl-rhamnosylated platycodin D, prosapogenin D, deglucosylated platycodin D, deglucosyl-apioxyl-xylosylated platycodin D, deglucosyl-apioxyl-xylosyl-rhamnosylated platycodin D, platycodigenin임을 확인하였다. 연구 3에서는 platycodin D를 A. niger의 조효소액으로 전환하여 생산한 신규 물질의 구조를 분석하고 그 물질의 생리활성을 platycodin D와 비교·분석하였다. Platycodin D의 당 잔기의 전환에 필요한 효소 활성을 증가시키기 위하여 A. niger의 배양 시 도라지의 사포닌 분획을 첨가한 경우 산화효소 활성이 유도됨을 발견하였다. 이 조효소액을 이용하면 platycodin D가 기존의 당이 제거된 platycodin D 대사체가 아니라 신규 물질로 전환되는 것을 HPLC로 확인하였다. LC/MS와 NMR을 이용하여 구조를 확인한 결과 이 신규 물질은 platycodin D의 히드록시기가 산화되어 케톤기로 변화된 16-oxo-platycodin D인 것을 알 수 있었다. A. niger의 배양 시 도라지 사포닌 분획을 첨가한 조효소액으로 platycodin D를 전환하였을 때, platycodin D는 16-oxo-platycodin D, 16-oxo-deapiosylated platycodin D, 16-oxo-prosapogenin D 순으로 전환되었다. 온도와 pH에 대한 전환조건 최적화로 platycodin D를 16-oxo-platycodin D로 2시간 내에 99.9% 이상 전환할 수 있었다. Platycodin D와 16-oxo-platycodin D의 구조적인 변화에 따른 생리활성의 변화를 확인하기 위해서 이들의 세포 증식 저해 활성을 확인한 결과 16-oxo-platycodin D는 정상 세포주인 NCTC 1469와 FHC에서 platycodin D와 비교하여 세포 증식 저해 활성이 8배 이상 줄어들었다. 본 연구에서는 도라지에 함유되어 있는 플라티코사이드를 생물전환하여 생리활성과 생체이용률이 높은 대사체를 만들기 위하여 식용 미생물들을 탐색하여 A. niger와 A. usamii를 선발하고 생물전환 조건을 최적화하였다. 그 결과 도라지 내의 platycoside E와 platycodin D3를 A. usamii의 β-glucosidase 활성을 이용하여 전환하여 도라지의 생리활성을 나타내는 platycodin D의 함량을 2배 이상 증가시킬 수 있었다. 또한 A. niger와 A. usamii의 배양 시 탄소원의 변화를 주어 β-glucosidase, β-xylosidase, α-rhamnosidase 활성을 선택적으로 높이고 이를 이용하여 platycodin D의 당 잔기가 전환된 7가지의 대사체를 생산하였다. 한편, A. niger의 배양 시 도라지의 사포닌 분획의 첨가로 산화효소 활성을 유도하였으며, 이를 이용하여 platycodin D를 신규 물질인 16-oxo-platycodin D, 16-oxo-deapiosylated platycodin D, 16-oxo-prosapogenin D로 전환하였다. 전환한 16-oxo-platycodin D는 platycodin D에 비해서 낮은 세포 증식 저해 활성을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발한 균주를 이용한 도라지 플라티코사이드의 생물전환 대사체 생산 기술은 도라지 내의 기능성 물질의 생리활성 및 생체이용률을 높여 도라지의 기능성 식품 소재로의 활용에 적용될 수 있을 것이다. 향후 각 대사체의 효율적인 생산과 이를 이용한 생리활성 및 생체이용률에 대한 추가적인 연구가 필요하다. Platycodi Radix has been used as a traditional herbal medicine to prevent and treat respiratory diseases such as cough, excessive phlegm, sore throat, bronchitis, lung abscess, and chest pain in China, Japan, Korea, and Mongolia for thousands of years. Bioactive chemical compounds in Platycodi Radix are known to be platycosides, one of triterpenoid saponin family. Total platycosides content of PR may be dependent on Platycodon grandiflorum’s soil, weather, cultivation method, and years of growth. About 70 varieties of platycosides have been identified to date. Platycosides consist of an olenane type triterpenoid backbone with two side chains linked with various sugar moieties such as glucose, laminaribiose, arabinose, rhamnose, xylose, and apiose at C-3 and C-28. Depending on the type of sugar moieties, platycosides have different bioactivity and bioavailability. Among these platycosides, platycodin D is a major and representative triterpenoid saponin which shows bioactivities in Platycodi Radix and is the indicator substance for quality management of Platycodi Radix in Korea. Platycodin D has been reported to have diverse pharmacological activities including anti-inflammatory, anti-diabetic, anti-cancer, anti-obesity, and anti-hyperlipidemic effects, inhibition of hepatitis C virus replication, and reduction of allergy-related diseases. Saponin can be converted into desired bioactive substances by removing sugar residues. Saponins with the same backbone with different types or numbers of sugar moieties exhibit different bioactivities or bioavailability. Also, saponin’s bioactivity, bioavailability, and metabolisms by intestinal bacteria can be different according to changes in the functional groups of the saponin backbone. In the case of ginsenosides of ginseng, many studies have been reported on the conversion of these sugars or functional groups of ginsenosides. However, transformations of sugar moieties and functional groups of platycosides have not been studied. Therefore, we tried to investigate effective methods for bioconversion of platycosides changing their sugar moieties or functional groups into new metabolites which may have increased bioactivities or bioavailability than the precursors using food-grade microorganisms, and identify the transformed molecules. The purpose of Study 1 was to increase the amount of platycodin D, a major bioactive substance in Platycodi Radix, using biotransformation. Food grade microorganisms with high β-glucosidase activity required for bioconversion of platycoside E and platycodin D3, two major platycodin D precursors, into platycodin D were screened, and the biotransformation condition was optimized. Among 11 microorganism strains tested, Aspergillus usamii had the highest β-D-glucosidase activity and active properties on bioconversion of platycoside E and platycodin D3 into platycodin D, hydrolyzing β-1, 6-glucosidic bond. Also, as a result of optimizing the culture condition to increase conversion efficiency, β-glucosidase activity of A. usamii was more than 4 times when cellobiose was used as a carbon source. More than 99% of platycoside E and platycodin D3 were converted into platycodin D when treated with the crude enzyme extract with increased β-glucosidase activity of A. usamii for 2 h. As the platycodin D precursors were converted, platycodin D content increased more than twice. The purpose of Study 2 was to biotransform platycodin D into metabolites, which have less sugar moieties, using enzyme activities of food grade microorganisms to increase bioactivities or bioavailability, and identification of those metabolites. A. niger and A. usamii were selected for platycodin D transformation due to their relatively high enzyme activities in β-glucosidase, β-xylosidase, α-rhamnosidase, and esterase when food grade microorganisms were tested. To get each of the transformed molecules from platycodin D, appropriate enzymes were induced via different carbon sources such as xylose, rhamnose, and cellobiose in the culture media. Using various crude enzyme extracts, platycodin D was transformed into 7 kinds of metabolites. Deapiosyl-xylosylated platycodin D, deapiosyl-xylosyl-rhamnosylated platycodin D, prosapogenin D, deglucosylated platycodin D, deglucosyl-apioxyl-xylosylated platycodin D, deglucosyl apioxyl-xylosyl-rhamnosylated platycodin D, and platycodigenin transformed from platycodin D were identified as platycodin D metabolites by using HPLC and LC/MS. The purpose of Study 3 was to analyze structure of a new metabolite from platycodin D produced by crude enzyme extract of A. niger and to compare the bioactivity of the metabolite with that of platycodin D. Platycosides fraction of Platycodi Radix was added in a culture medium of A. niger as an inducer to increase the enzyme activities for hydrolyzing apiose, xylose, rhamnose, arabinose, and glucose of platycosides D. New metabolites were produced by the crude enzyme extract of A. niger cultured with saponin fraction of Platycodi Radix. One of the new metabolites was identified to be 16-oxo-platycodin D, which was converted into a ketone group by oxidation of hydroxyl group of platycodin D, using HPLC, LC/MS, and NMR. Platycodin D was converted into 16-oxo-platycodin D, 16-oxo-deapiosylated platycodin D, and 16-oxo-prosapogenin D in order over time by the crude enzyme extract of A. niger. The transformation condition such as pH, temperature, and heat stability were optimized so that 99% of platycodin D was transformed into 16-oxo-platycodin D in 2 h. Inhibitory activity of platycodin D and 16-oxo-platycodin D on proliferation of normal cell lines, NCTC 1469 and FHC from mouse and human, respectively, was tested if the physiological activity was changed by changing the hydroxyl group of platycodin D to the ketone group. Compared to platycodin D, 16-oxo-platycodin D showed over 10 times lower inhibitory ability on proliferation of the NCTC 1469 and FHC cell lines. In this study platycosides from Platycodi Radix were transformed using edible bacterial and fungal strains into metabolites which ccould have higher bioactivities or bioavailability. Platycosides were converted using crude enzyme extracts of A. niger and A. usamii, which were the most suitable microorganisms for the conversion of platycosides since they had β-apiosidase, β-xylosidase, α-rhamnosidase, β-glucosdise, and esterase activities. Content of platycodin D increased more than twice after the conversion of platycodin D precursors using the β-glucosidase activity of A. usamii. Activities of β-glucosidase, β-xylosidase, and α-rhamnosidase, which were required to hydrolyze glucose, apiose, xylose, and rhamnose of platycodin D, were induced with different carbon sources (cellobiose, xylose, and rhamnose) in the culture media of A. niger and A. usamii. Using various induced crude enzyme extracts, platycodin D was transformed into 7 kinds of metabolites. In addition, oxidase activity of crude enzyme extract of A. niger was induced by platycosides of Platycodi Radix during cultivation. Platycodin D was transformed into 16-oxo-platycodin D, 16-oxo-deapiosylated platycodin D, and 16-oxo-prosapogenin D by the induced enzyme extract. 16-Oxo-platycodin D showed lower inhibition activity on proliferation of normal cells than platycodin D. These new metabolites from platycodin D produced by our methods may have new bioactivities or higher bioavailability. These results can be a new way to improve the quality of Platycodi Radix as a functional food. In the next study, the investigation on the change of bioactivities and bioavailability of platycodin D metabolites by their structural change compared to platycodin D is needed.

Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP를 활용한 유청 생물전환 물질의 치주염 개선효능 연구

이주현 숙명여자대학교 대학원 2021 국내석사

Whey is a by-product produced in the cheese manufacturing process, and the amount of whey production is 10 times more than that of cheese. Recently various functions have been proven, and it is used as a food additive and health promoting supplement. By inducing the hydrolysis of whey protein bioconversion through microbial fermentation, it can release bioactive compounds from the precursor protein. In particular, it is known that milk-derived bioactive peptides can exhibit various physiological functions such as antihypertension, immune regulation, antioxidant, and antithrombosis. Periodontal disease is the most common disease that occurs in the oral cavity, and periodontitis is a major cause of tooth loss in adults. In order to alleviate the side effects by antibiotics and physical therapies, interest in natural substitutes is increasing. Therefore, in this study, the efficacy of relieving periodontitis was confirmed by utilizing the whey bioconversion products. The whey bioconversion products was prepared using the lactic acid bacteria Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP isolated from raw milk, and bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction was prepared together to confirm the efficacy of the whey bioconversion products. In in vitro experiments, the antimicrobial effect on periodontal pathogens, antioxidant activity, cytotoxicity, and hemolytic properties of the E. faecalis whey bioconversion products were confirmed. In an in vivo experiment, E. faecalis whey bioconversion products were administered orally and dispensed to the site ligatured with the lower right maxillary first molar tooth for 8 weeks in periodontitis animal models. Histopathologicalal analysis and micro-CT analysis of gingival tissue were performed, and the expression levels of inflammation and oxidative stress-related proteins in gingival tissue and colon were confirmed through Western blot to confirm the effect of relieving periodontitis. In the antimicrobial effect on periodontal pathogens, whey bioconversion products prepared using E. faecalis M157 KACC81148BP (M157) and the bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction (M157+) exerted antimicrobial effect on Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Fusobacterium nucleatum. In antioxidant activity test, M157 and M157+ showed no significant difference with ascorbic acid used as a positive control. Cytotoxicity was not shown in HT-29 cells, and it was confirmed that there was no hemolytic properties. After the treatment of the whey bioconversion products and the whey bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction to Wistar rats that induced periodontitis, as a result of histopathologicalal analysis, epithelial proliferation and inflammatory cell infiltration occurred in the PE group. Compared to the PE group, it was confirmed that epithelial proliferation and invasion of inflammatory cells were expressed lower in the PE+M157 and PE+M157+ groups administered with the whey bioconversion products and the whey bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction. As a result of micro-CT analysis, bone volume/total volume (BV/TV), bone surface/bone volume (BS/BV), and bone loss volume were inspected in the treated group. In the PE+M157+ group administered with the bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction, BV/TV was significantly increased and bone loss volume was significantly decreased compared to the PE group. BS/BV was significantly decreased in PE+M157, PE+M157+ groups compared to the PE group. As a result of the expression levels of proteins related to inflammation (TNF-α, IL-6, IL-10) and oxidative stress (SOD1, CAT, GPx-1) through Western blot in gingival tissue and colon, anti-inflammatory and antioxidant effects were shown in the PE+M157 and PE+M157+ groups. Therefore, based on the results of this study, the whey bioconversion products prepared with E. faecalis M157 KACC81148BP has shown the relieve effect on periodontitis. 유청은 치즈 제조 공정에서 생성되는 부산물로, 치즈 생산량의 10배의 유청이 생산되고 있으며 최근 다양한 기능성이 입증되어 식품 첨가물, 건강기능식품으로 활용되고 있다. 미생물 발효를 통한 생물전환으로 유청 단백질의 가수분해를 유도하여 전구 단백질로부터 생리활성물질을 방출할 수 있다. 특히 우유 유래 생리활성 펩타이드는 항고혈압, 면역조절, 항산화, 항혈전 등 다양한 생리적 기능성을 보인다고 알려져 있다. 치주질환은 구강 내 발생하는 가장 흔한 질환이며 치주염은 성인 치아 손실의 주원인으로, 항생제 및 물리적 치료의 부작용을 극복하기 위해 이를 대체할 천연물에 관한 관심이 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 유청 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction을 활용하여 치주염의 개선효능을 확인하고자 하였다. 원유에서 분리한 젖산균 Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP를 이용하여 유청 생물전환 물질을 제조하고 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction의 효능을 확인하기 위해 bacteriocin active fraction을 추가한 물질을 함께 제조하였다. In vitro 실험에서 유청 생물전환 물질의 구강 유해 세균에 대한 항균효과, 항산화능, 세포독성, 용혈성을 확인하였다. In vivo 실험에서 우측 아래 제1 대구치를 결찰한 치주염 동물모델에 8주간 생물전환 물질 및 물질 내 bacteriocin active fraction을 경구투여 및 유발 부위에 도포하였다. 치주조직의 병리학적인 분석과 micro-CT 분석을 진행하고 치주조직과 대장에서의 염증 및 산화 스트레스 관련 단백질 발현량을 Western blot을 통해 확인하여 치주염의 개선 효과를 확인하였다. E. faecalis M157 KACC81148BP를 활용하여 제조한 유청 생물전환 물질 및 bacteriocin active fraction을 추가한 생물전환 물질의 구강 유해 세균에 대한 항균효과 실험에서 두 가지 모두 Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum 에 대해 항균력을 보였으며, 항산화능 실험에서는 양성 대조군으로 활용한 ascorbic acid와 유의차를 보이지 않는 높은 값을 보였다. HT-29 세포의 생존율을 확인하였을 때 대조군과 유의적 차이가 없어 세포독성이 없었으며, 용혈성이 없는 것을 확인하였다. 치주염을 유발한 Wistar rat에 8주간 유청 생물전환 물질(M157)과 bacteriocin active fraction을 첨가한 유청 생물전환 물질(M157+)을 처리하였다. 치주조직의 병리학적인 분석을 진행한 결과 대조군에서 상피증식 및 염증세포의 침윤이 발생하였으며 대조군보다 유청 생물전환 물질 및 bacteriocin active fraction을 추가한 유청 생물전환 물질을 투여한 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 상피증식과 염증세포의 침윤이 더 낮게 발현되는 것을 확인하였다. micro-CT 분석 결과 PE+M157+ 군에서 총 부피당 골 부피(BV/TV)가 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 골 소실량(bone loss volume)이 유의적으로 감소하였다. 골 부피당 표면적(BS/BV)의 경우 대조군과 비교하여 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 유의하게 감소하였다. 치주조직과 대장에서의 Western blot을 통한 염증(TNF-α, IL-6, IL-10) 및 항산화 효소 활성 지표(SOD1, CAT, GPx-1) 관련 단백질 발현량을 확인한 결과 대조군과 비교하여 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 항염증 및 항산화 효과를 보였다. 따라서 본 연구의 결과를 바탕으로 E. faecalis M157 KACC81148BP로 제조한 유청 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction은 치주염 개선효능이 우수한 것으로 판단하였다.

혐기성 반응 분리막을 이용한 CO2의 생물학적 메탄전환 공정에 관한 연구

신현철 서울시립대학교 2017 국내박사

ABSTRACT Bio-conversion of CO2 to methane using anaerobic reactive membrane system by Hyun-Chul Shin Department of Energy and EnviromentalSystem Engineering Graduate School,The University of SeoulSupervised by Professor Dong-Hoon Lee The increased use of fossil fuels following rapid industrialization since the Industrial Revolution has resulted in the reduction of global forest area through deforestation, and led to global warming. CO2 to the contribution of warming is very large, more than 80%. Therefore, to solve the problem of global warming efficient control and management of carbon dioxide should be prioritized. In order to effectively reduce and control CO2, it is necessary to recycle the generated CO2 or convert it to another useful substance. The reason for this is that since carbon dioxide is present in the atmosphere for a long time, suppression of the generation of carbon dioxide only limits the concentration of CO2 in the atmosphere efficiently. Methods for recycling CO2 via conversion to bioactive substances can broadly be categorized into chemical and biological conversion methods. This study focused on the methanation of CO2, which is a biological method. The biological conversion requires less energy because it can be conducted at room temperature and pressure. Further, no supplementary material is required for the conversion, as it proceeds via biological reactions. Methanation, which has been utilized for a long period, is the process of producing methane using hydrogen (H2) and microorganisms as the reducing agent and metabolites respectively. The advantages of using methanation include its stability of operation, higher binding ratio compared to other known biological processes (150g CO2/m3-day) and the fact that it can bind CO2 in high concentrations. The system set up for this research can be distinguished from those of existing studies by the manner in which it supplies the H2 reducing agents needed to reduce CO2 gases. To circumvent this issue, bubbleless membrane aeration using hollow fiber membranes was utilized in this study. This method is also beneficial in that it allows just enough methanogens to pass through the membrane, thereby reducing wastage of H2 electron donors. Hollow fiber membranes serve as the substrate, allowing methanogens to form a bio film on its surface and grow stably. The methanization of CO2 using the anaerobic reaction membrane was carried out as follows. It has been carried out the optimal operating conditions for the methanation of CO2 using anaerobic reactive membrane by the batch reactor. Semi-Continuous Stirred Reactor was operated to determine the amount of inorganic carbon source in the biological process based on the optimum operating conditions at the batch reactor. It derived the test design parameters for the successive reactor. The maximum methanization of CO2 was observed under the condition that pH was 7~8, ORP was–400mV and the ratio of the CO2 and H2 supply was 1:4 and the biological reaction was stable. Based on the derived design parameters, three successive reactors of CRL, CRS1, and CRS2 were fabricated and compared and optimized operation conditions for scale-up were derived and a continuous bioreaction process using anaerobic membrane was established. The CRS1 reactor was operated under the acidic conditions of pH 4∼5 and the CRS2 reactor was operated under the neutral condition of pH 7∼8. The amount of methane produced by CRS1 is about 3 times higher than that of CRS1. This is because the amount of methane generated by acetoslastic methanogen using acetic acid, which is continuously maintained as neutral rather than acidic, is increased by hydrogenotrophic methanogen. It is thought that this is the result of adding to methane production. The CRL reactor was seeded with methanogens grown in an acidic enrichment culture. The amount of methane generated maintained the average of 500㎖/day, but it is lower than CRS1, which was operated at the same acidic condition. The proportion of methane in the gases released was lower by around 30% compared to reactor CRS1. This implies that the conversion was less effective than in reactor CRS1. The reason for such observations may be the disparity in the microbial communities of the two set-ups and the fact that the CRL set-up was operated with high ORP. Approximately 97% of the methanogen cultured in the enrichment cultures were of the Methanobacterium oryzae family, and the simple make-up of the microbial community could have amplified the effects of inhibiting factors present in the operating conditions or in the reactants. To achieve stable a biological process, it is important to investigate the microorganisms responsible for methane production and to determine their optimal growth conditions. The Bacterial 16S rDNA PCR-DGGE technique was employed to identify the microorganisms responsible for methane production. Further, real-time qPCR was carried to measure the population sizes of these microorganisms, and NGS (Next Generation Sequencing) procedures were carried out for the microbial community analysis. Analysis of reactor CRS2 via the 16S rDNA PCR-DGGE procedure confirmed the existence of an acetogen named Sporomusa silvacetica, based on the results of DGGE band sequencing. This explains why the methane production level was higher in reactor CRS2 than in reactor CRS1. Furthermore, by analyzing the results of archaeal 16S rDNA PCR-DGGE, it was concluded that methanogens belonging to Methanosarcinaceae and Methanobacterium generation were responsible for methane production in acidic pH ranges, while methanogens from the Methanomicrobiales, Methanospirillum and Methanocorpusculum genera played a vital role in methane production under neutral pH conditions. Results of the real-time qPCR showed that Methanobacteriales are mainly involved in hydrogenotrophic methanogenesis, which produces methanol as the final metaboilic product from CO2 and H2. While, Methanomicrobiales were mainly responsible for acetoclastic methanogenesis produces the acetic acid as the metabolite. For microbial community analysis via NGS (Next Generation Sequencing), class level and species level analyses were conducted on the archaeal and the bacterial microorganisms. Class level analysis showed most microbes(99.59%) took part in the methanation process. On a species level, numerous species were identified in addition to the predicted Methanobacterium sp. that utilizes H2 gases as reducing agents to convert CO2 to methane. These include; Sporomusa sp., which is involved in the production of acetic acid; Methanomicrobial sp., which produces methane using acetic acid as a substrate; and Anaerolineae sp., Clostridium sp., and Spirorochaceae sp., which generate hydrogen using the organic acids produced. It was deduced that the species excluding Methanobacterium sp. aided the methanation process in directly by increasing the hydrogen and organic acid concentration within the reactor. Based on the optimal conditions identified by operating the CSR (Continuous Stirred Reactor) and microbial analysis, a SUCR (Scale- Up Contunuous strirred Reactor) was designed and operated to determine the feasibility of mass conversion of CO2 to methane via biological processes using anaerobic reactive membranes. On the 40th day of the operation, the average methane production reach ed 103.1 l/day. Production of methane was maintained at steady levels afterwards, suggesting that the mass conversion is potentially feasible. The technique using microbes that was explored in this study is more applicable than other CO2 recycling techniques in terms of reducing the effective CO2 level in the atmosphere, and it can potentially contribute to both the reduction of CO2 and the production of renewable energy. In the long-term, it is believed that this method could be utilized as a mass CO2 treatment process if ground breaking bioengineering breakthroughs are made, such as finding a microorganism with significantly improved methanation capabilities. Key words : Carbon dioxide, Methanization, Biological Conversion, Global Warming, Anaerobic Reactor, Anaerobic Reactive Membrane, Hollow-fiber Membrane, Hydrogen Transfer, Reductant, Molecular Biological Analysis 산업혁명 이후 급속한 산업화에 따른 화석연료 사용의 증가와 산림 훼손으로 인한 산림면적 감소는 지구 대기중에 포함된 온실 가스량의 급속한 증가를 가져왔고, 이는 지구 온난화라는 결과를 가져왔다. 온실가스중 특히 CO2가 온난화의 기여도면에서 차지하는 비중이 80% 이상으로 매우 크다. 따라서 지구 온난화 문제를 해결하기 위해서는 무엇보다. 이산화탄소의 효율적인 제어와 관리가 우선 되어야 한다. CO2를 효율적으로 저감·제어하기 위해서는 발생 CO2를 재이용 하거나 유용한 다른 물질로 전환하는 방안이 강구 되어야 한다. 이는 이산화탄소는 발생 후 대기중에 존재하는 기간이 길어 이산화탄소의 발생 억제만으로는 대기중의 CO2의 농도를 효율적으로 저감 하는데 한계가 있기 때문이다. CO2를 유용물질로 재이용 하는 방법은 크게 화학적 전환방법과 생물학적 전환 방법으로 나눌 수 있다. 본 논문에서는 생물학적인 방법, 특히 메탄화에 대해 연구하였다. 생물반응은 상온, 상압에서 이루어져, 에너지 소모가 적으며, 생물반응을 이용하므로, 물질전환에 기타 부재료가 필요 없다는 장점이 있다. 특히 메탄화는 오래전부터 사용되어져 온 생물공정으로써 비교적 안정적 운전이 가능하며, 이산화탄소의 고정화율이 타 생물공정에 비해 높다는 장점(150 gCO2/㎥-day)과 고농도의 이산화탄소도 고정이 가능하다는 장점이 있다. 본 논문의 기존 연구와의 차별성은 중공사막을 이용한 무기포 멤브레인 전달 방식을 사용하여 CO2를 환원하는데 필요한 수소를 CO2와 반응할 수 있게 공급하는 공정 구현에 있다. 이는 효율적인 수소의 공급과 동시에 중공사막이 일종의 담체 역할을 하여, 메탄 생성 미생물들이 안정적으로 자랄 수 있게 하는 부수적 효과도 기대 할 수 있기 때문에 CO2의 메탄 전환률을 크게 향상 시킬 수 있다. 본 논문에서 행해진 실험과 그로 얻은 결과는 다음과 같다. 회분식 실험을 통하여 혐기성 분리막(Anaerobic reactive membra -ne)을 사용한 CO2의 메탄전환 생물공정의 최적 운전조건을 도출하였으며, 공정중 무기 탄소원의 공급량을 결정하기 위하여 회분식 반응조에서 얻어진 최적운전을 토대로 반연속식 반응조(Semi-Con tinuous Stirred Reactor)를 운전하여 연속 반응조를 제작 하기위한 설계 인자를 도출 하였다. 이 결과 pH는 7∼8, ORP는 -400mV, CO2와 H2의 공급은 1:4로 공급하는 조건에서 CO2 메탄 전환률의 최대치를 보였으며, 생물학적 반응 또한 안정적 이였다. 도출된 설계인자를 토대로 CRL, CRS1, CRS2 세개의 연속 반응조를 제작, 비교 실험 하여 Scale-up을 위한 최적 운전조건을 도출 하였고, 혐기성 분리막을 이용한 연속 생물반응 공정을 확립하였다. 메탄 발생량에 있어서는 산성조건 (pH 4∼5)에서 운전된 CRS1보다 중성조건(pH7∼8)에서 운전된 CRS2가 약 3배 정도 많은 양을 생산하고 있는데 이는 pH가 산성이 아닌 중성으로 유지를 해줌에 따라 지속적으로 발생하는 Acetic acid를 이용하는 Acetoslastic methanogen에 의한 메탄 발생량이 Hydrogenotrophic methanogen에 의한 메탄 생산량에 더해짐으로써 나타난 결과로 판명 되었다. CRL 반응기는 산성조건에서 농화 배양된 Methanogen을 반응기에 식종하여 운전하였는데, 평균적으로 500㎖/day 수준의 메탄 발생량을 유지하였지만, 동일한 산성 조건에서 운전이 된 CRS1과 비교를 했을 때 메탄 발생량이 적다고 볼 수 있으며 배출되는 가스 중의 메탄의 비율도 CRS1보다 약 30% 정도 낮으므로 전환률에서도 떨어진다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 상대적으로 높은 ORP에서 운전이 된 것과 미생물 군집의 차이 때문이며,. 미생물 분석 결과 농화 배양된 Methanogen은 약 97%가 Methanobacterium oryzae라는 것을 확인했는데 이처럼 단순한 미생물 군집 구성을 가짐으로써 이들이 운전 조건 또는 반응액 내부의 어떤 인자로부터 저해를 받을 경우에 운전 결과 전체가 영향을 받을 우려를 가지고 있다. 안정된 생물공정 구현을 위해서는 메탄생산에 관여하는 미생물을 규명하고 이들의 최적 생장 조건을 도출 하는 것이 매우 중요하다 이를 위해 미생물종 확인을 위한 Bacterial 16S rDNA PCR-DGGE 와 미생물 개체수를 확인하기 위한 Real-time qPCR 및 다양한 미생물 군집분석(Microbial community)을 위한 NGS(Next Generation Sequencing)를 실시하였다. 16S rDNA PCR-DGGE 결과, CRS2 반응기에서는 Acetogen으로 여겨지는 Sporomusa silvacetica라는 미생물이 band sequencing 결과로 확인됨으로써 CRS2 반응기 연속운전에서 CRS1보다 메탄 생산량이 많은 것에 대한 결과를 뒷받침해주고 있다. Archaeal 16S rDNA PCR-DGGE 결과를 통해 산성 pH에서는 Methanosarcinaceae와 Methanobacterium에 속하는 Methanogen들이, 중성 pH에서는 Methanomicrobiales, Methanospirillum, 그리고 Methanocorpusculum에 속하는 Methanogen들이 주로 역할을 수행하고 있음을 알 수 있었다. Real-time qPCR 결과, Methanobacteriales는 Hydrogenotrophic methanogenesis로 대부분 규명 되었으며 이들은 직접적으로 이산화탄소와 수소를 이용하여 최종 대사산물로 메탄을 생산하는 종이다. Methanomicrobiales는 Acetoclastic methanogenesise들이 대부분으로 대사산물로 아세트산을 생산하는 종이다. NGS(Next Generation Sequencing)에 의한 미생물 군집분석은 고세균(Archaeal)과 박테리아(Bacterial)에 대해 강(Class level)과 종(Species level)에 대해 하였다. 강(Class level) 분석 결과 대부분(99.59%)이 메탄 생성에 관여하는 미생물이며 종(Species level)분석 결과 당초에 기대하였던 수소를 환원제로 사용하여 이산화탄소를 메탄으로 전환하는 Methanobacterium sp. 이외에도 다양한 미생물군이 확인 되었는데 크게 아세트산 생성에 관여하는 Sporomusa sp.와 Methanomicrobial sp. 와 같이 생성된 아세트산을 기질로 하여 메탄을 생산하는 종류, 또한 생성된 유기산을 기질로 하여 수소를 생산하는 Anaerolineae sp. Clostridium sp. Spirorochaceae sp.이다, 이들은 반응기내에 수소량과, 유기산을 증가시켜, 결과론적으로 메탄생산량 증가에 도움을 주는 것으로 판단된다. 혐기성 반응 분리막을 이용한 이산화탄소의 생물학적 메탄전환의 대용량화의 가능성을 확인하기 위하여, 연속반응기 운전과 메탄생성 미생물 분석을 통해 도출한 최적 운전 조건을 토대로 Scale-up 반응기인 SUCR을 제작 운전 하였다. 메탄의 발생량은 운전 40일째에 약 103.1l/day 수준의 메탄이 발생했음을 확인하였으며, 그 후 안정되게 지속적으로 메탄을 생산하여, 대용량화의 가능성을 확인하였다. 본 논문의 연구는 미생물을 이용한 CO2 재이용 기술로써 CO2 저감 부분에 있어 다른 CO2 자원화 기술에 비교하면 CO2의 순수 저감 효율이 높고 저감과 동시에 대사산물로 유용한 자원인 메탄을 생산하기 때문에 CO2 저감 기술인 동시에 환경 친화적인 신재생 에너지의 생산기술로서의 한 부분을 담당할 수 있을 것으로 판단된다. 장기적으로는 생물공학기술의 발달로 CO2에서의 메탄생성 능력이 획기적으로 향상된 미생물이 개발된다면 대용량의 CO2 처리기술로도 활용이 가능할 것으로 판단된다.

Enterococcus sp. RKY1에 의한 푸마르산으로부터 숙신산 생물전환

강귀현 전남대학교 대학원 1999 국내박사

숙신산과 그 유도체들은 농업, 식품, 의약품, 플라스틱, 화장품, 직물, 도금, 가스세정과 1,4-부탄디올, 테트라히드로푸란, γ-부티로락톤 등의 생산에 유용한 중간물질이다. 숙신산은 현재 산업적으로 석유를 원료로 하는 화학적 방법으로 생산되고 있으나 앞으로의 석유자원고갈 및 환경문제 등의 이유로 생물학적인 방법에 의한 숙신산 생산에 큰 관심이 집중되고 있다. 또한 글리세롤은 바이오 디젤의 제조시 부산물로 다량 생산되어 폐기 및 재 이용성에 따라 생산비용을 크게 좌우하는 매우 중요한 항목으로 거론되고 있다. 따라서 본 연구에서는 수소공여체로서 글리세롤과 수소수용체로서 푸마르산염을 이용하여 숙신산염으로의 생물전환을 실시하고자 전환능력이 뛰어난 새로운 통성 박테리아를 분리·동정하여 그 특성을 조사하였으며 생성된 발효산물을 이용하여 푸마르산염 첨가로 인해 변형된 탄수화물 대사경로를 추정하였다. 또한 여러 배양 및 배지조건의 최적화를 위한 기초실험 및 계면활성제를 이용하여 생산성 증진을 시도하였으며 Rhizopus 속 곰팡이 균주를 이용하여 글루코오스로부터 푸마르산을 직접 생산하여 푸마르산 발효액으로부터 숙신산 생물전환을 행하였다. 새로이 분리된 통성박테리아는 1㎛의 구형 그램 양성 박테리아로서 Enterococcus 속으로 동정되어 Enterococcus sp. RKY1으로 명명하였다. 한편 이 미생물은 글리세롤과 푸마르산 기질하에서 고농도의 숙신산을 생산하였으며 글리세롤 산화로 생성된 피루브산이 phosphoroclastic과 dismutation 경로를 통해 대사되어 그 외 부산물로 아세트산과 포름산을 생성하였다. 시험된 여러 수소공여체 중 글리세롤이 가장 효과적이었으며 푸마르산염 기질하에서 숙신산염 생성량이 가장 많았다. 푸마르산은 Na_(2)CO_(3)를 중화제로 이용한 푸마르산 나트륨염 형태가 가장 양호하였다. 최적 배양 배지 조건은 온도 38℃, pH 7.0이었으며 주된 기질로서 20 g/l glycerol, 80 g/l fumarate (Na염 형태), 15 g/l yeast extract와 그 외 무기염 및 금속이온으로는 10 g/l K_(2)HPO_(4), 1 g/l NaCl, 50 ppm MgCl_(2)·6H_(2)O, 10 ppm FeSO_(4)·7H_(2)O 였다. 고농도 세포배양 (2 g/l)에 의한 숙신산염 생성량은 초기 푸마르산염 농도 30, 50, 80과 100 g/l 각각에 대하여 29.3, 40.9, 63.6과 82.5 g/l 였으며, 초기 푸마르산염 농도가 증가함에 따라 숙신산염 생성량도 증가함을 알 수 있었다. 최대수율은 초기 푸마르산염 농도 30 g/l에서 96.8%로 가장 높은 값이 얻어졌으며 재래발효와 비교하여 숙신산염 생산성이 2.5배 정도 증진되었다. 유가식 배양을 행하여 배양 36시간 만에 숙신산염 생성량은 153 g/l였으며 평균 숙신산염 부피생산성은 4.25 g/l/h를 보였다. 칼슘 알지네이트에 고정화된 세포는 여러 차례의 재사용 (9회)에도 활성이 유지되어 생산공정의 단순화 및 연속생산의 가능성이 모색되었다. 저농도의 비이온 계면활성제, 유기용매, 식물성 기름을 배지내에 첨가함으로 숙신산염 생산성은 증진되었으며 시험된 농도 중 최적 농도는 각각 0.1 g/l Tween 80, 10 ml/l 아세톤과 1 g/l 옥수수유였다. 각각의 조건에서 24시간 발효 조 배양 실험결과 1 g/l 옥수수유 및 0.5 g/l Tween 80과 50 ㎍/l 비오틴 혼합배양의 경우 두 조건에서 약 85 g/l 숙신산염이 생성되어 가장 양호하였으며 대조용 실험과 비교하여 생산성이 약 25% 증진되었다. 옥수수유의 첨가로 인한 숙신산 생산성 증진은 숙신산이 식품, 의약품, 화장품 등에 크게 이용되는 점을 고려할 때 다른 유기 용매에 비해 상당히 바람직하였다. Rhizopus 속을 이용한 글루코오스로부터 푸마르산의 생산은 중화제로서 Na_(2)CO_(3)를 이용한 발효 실험결과 배양 4일째에 약 26 g/l의 푸마르산염이 생성되었는데 푸마르산 나트륨염 형태의 생성물 회수는 균사체의 재이용 및 전환기질의 직접 이용 등의 이유로 유리하였다. 이러한 푸마르산염 25 g/l를 함유하는 발효액을 특별한 전처리없이 전환기질로 이용하여 87.9% 수율의 22.3 g/l의 숙신산염을 얻을 수 있었다. 따라서 본 연구에 수행된 생물전환공정은 전환기질이 거의 모두 순수한 형태의 숙신산으로 매우 빨리 전환되어 원료의 전처리 및 회수·정제공정을 단축함은 물론 그에 소요되는 비용을 절감할 수 있어 산업화의 경우 효율적임을 알 수 있었다. Succinic acid is widely used as a specialty chemical with applications in polymers, foods, pharmaceuticals, and cosmetics, and as a four-carbon intermediate it is useful for the production of 1,4-butanediol, tetrahydrofuran, and γ-butyrolactone. Succinic acid can be produced either chemically or biologically, but is currently being produced commercially by chemical processes. Bioconversion of fumarate to succinate was anaerobically conducted with a synthetic medium containing glycerol as a hydrogen donor and fumarate as a hydrogen acceptor. Glycerol can be obtained as a byproduct during the manufacture of biodiesel fuel from rape oil. In this study, the identification and characteristics of a newly isolated facultative bacterium were investigated, and the culture conditions and medium optimization were examined for the bioconversion. Studies were also conducted using various surface active agents to obtain improved product yield. Fumaric acid fermentation by Rhizopus oryzae was carried out and the conversion of this fermentation to succinic acid fermentation was performed. A bacterium, RKY1, has been selected from culture samples of strictly anaerobic bacterium. Based on the morphological and physiological characteristics, the isolated RKY1 was identified as Enterococcus sp. and was named Enterococcus sp. RKY1. It was postulated that fumarate reacted with the reduced NAD generated in the oxidation of glycerol, and thus altered the role of pyruvate in the regeneration of oxidized NAD. The metabolism of pyruvate via the dismutation and phosphoroclastic pathways would then account for the increased growth response and the volatile acid and carbon dioxide production. Glycerol was found to be most efficient in promoting the reduction of fumarate to succinate and the efficacy of fumarate appeared to be due to its playing a role as a hydrogen acceptor. Neither glycerol nor fumarate alone produced succinic acid as well as an increase in cell growth. Na-fumarate (as Na_(2)CO_(3)) was the form most readily utilized by the bacteria for the conversion. The optimum condition of bioconversion was obtained with media containing 20g/L glycerol, 80g/L fumarate, 15g/L yeast extract, 10 g/L K_(2)HPO_(4), 1 g/L NaCl, 50 ppm MgCl_(2)·6H_(2)O, 10 ppm FeSO_(4)·7H_(2)O at pH 7.0∼7.6. When the initial cell density was high (2g/L), the succinate produced at pH 7.0 for initial fumarate concentrations of 30, 50, 80, and 100g/L was 29.3, 40.9, 63.6, and 82.5g/L, respectively, showing an increase corresponding with the initial fumarate concentration. The high yield of 96.8% per mole of fumarate in just 4 hours was obtained at the initial fumarate concentration of 30g/L. Comparing this value to that obtained through conventional fermentation, we found that the production rate in this study was about 2.5 times higher. Addition of a variety of surface active agents to the medium provided 25% increase in the production rate of succinate. In general, 0.1g/L Tween 80, 10mL/L acetone, and 1g/L corn oil increased succinate production. It is likely that the fatty acid esters contained in the agents alter the permeability of the cell membranes. Among the several agents tested, corn oil was more efficient than others. Since succinic acid is primarily used in the production of food, medicine and cosmetics, vegetable oil was also considered the most proper agent in the production of succinate. Fumaric acid production through microbial fermentation yielded 26g/L of culture. The broth, containing sodium fumarate, was then used for the succinic acid fermentation with conversion yields as high as 87.9% after 5hours. Thus very attractive and effective culture conditions for production of succinic acid from fumarate using glycerol as a hydrogen donor were established.

Chromohalobacter sp. HS-2 유래 수산화효소 유전자 내포 재조합 대장균을 이용한 hydroxybenzoate의 전환

임성훈 조선대학교 대학원 2009 국내석사

Chromohalobactersp. strain HS-2 was isolated from salted fermented clams and analyzed for the ability to grow on (hydroxy)benzoate as the sole carbon and energy source. HS-2 was characterized to be moderately halophilic, with an optimal NaCl concentration of 10%. The genes encoding the benzoate metabolism of HS-2 were cloned into a cosmid vector, sequenced, and then analyzed to reveal the benzoate dioxygenase (benABC), p-hydroxybenzoate hydroxylase gene (pobA) and m-hydroxybenzoate hydroxylase gene (mobA). The HS-2 genes involved in (hydroxy)benzoate degradation were clustered within approximately 39 kb region, and showed quite a different genetic organization from those of other benzoate catabolic genes. The benABC, pobA, mobA genes were cloned into the expression vector pEXP5-CT/TOPO. The expressed BenABC, PobA, MobA were analyzed by SDS-PAGE and the specific bands were confirmed. The HPLC and LC-MS/MS analysis revealed that resting cells of E. coli BL21 (DE3) harboring benABC, pobA, mobA oxidized 3-chlorobenzoate to 4-chlorocatechol, p-hydroxybenzoate to protocatechuate and m-hydroxybenzoate to protocatechuate, respectively. To enhance the conversion rate, pKJE7 chaperone (dnaK-dnaJ-grpE) were co-expressed with E. coli harboring pobA and mobA genes, respectively. The pobA and mobA genes expressed higher level of protein than without pKJE7. And bioconversion of high concentration of m, p-hydroxybenzoate to protocatechuate by co-expression of pobA with pKJE7.

Bioconversion of Mulberry Leaves With Viscozyme L

김영욱 부산대학교 대학원 2017 국내석사

뽕잎은 수 세기 동안 전통적인 한의학에서 사용되어 왔다. 뽕잎에는 알칼로이드, 플라보노이드, 식물 화학물질과 같은 다양한 화학성분을 포함하고 있다. 뽕잎은 항암, 항당뇨, 항산화, 미백 활성을 비롯한 많은 치료효과를 가지고 있다. 생물전환은 식물이나 동물 폐기물과 같은 유기물을 특정 효소 또는 미생물과 같은 생물학적 방법 또는 작용제를 사용하여 유용한 제품 또는 원료로 전환시키는 것이다. 생물전환은 생리활성을 향상시키기 위한 효과적인 방법으로 효소를 이용하여 다양한 분야에서 생리활성을 높이는데 사용된다. 본 실험에서는 활성이 없거나 활성이 있는 물질을 활성을 가지거나 더 강한 활성을 가지는 물질로 변화시키기 위하여 Alcalase 2.4 L FG, AMG 300 L, Lipex 100 L, Pectinex 100 L, Viscozyme L과 같은 몇 가지 상업 효소를 뽕잎에 처리하였다. 우리는 다양한 효소로 생물전환된 뽕잎 추출물로 항암, 항당뇨, 항치매, 항비만, 미백, 항통증, 항산화활성과 같은 생리활성을 평가하였다. Viscozyme L은 뽕잎의 항당뇨 활성을 증가시켰다. 생리활성을 증가시킨 활성물질을 정제하기 위해 먼저 용매추출법을 이용하여 항당뇨 활성이 나타나는 에틸아세테이트층을 분리하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 통해 활성물질을 분리하였다. 분리된 Compound MAV 1, MAV 2, MAV 3의 양은 각각 300, 180, 43 mg으로 100 g의 뽕잎으로부터 전환되었다. 물질 분리 후 핵자기공명법을 이용하여 Compound MAV 1, MAV 2, MAV 3가 각각 카페산, 케르세틴, 캠페롤임을 확인하였다. 활성 물질의 산출량을 최적화하기 위해 본 연구에서는 기질의 농도, 효소의 농도, 온도, pH, 반응 시간과 같은 변수들과 산출량의 관계를 검사하였다. 최적 조건인 20% 기질, 5% 효소, 37℃, pH 4, 24시간의 반응에서 건조 뽕잎 1 g 당 2.34 ± 0.03 mg의 케르세틴을 추출했다. Viscozyem L을 이용하여 뽕잎을 생물전환함으로써 얻어지는 케르세틴은 항당뇨효능을 나타내며 이러한 결과들은 Viscozyme L을 이용한 뽕잎의 생물전환이 항당뇨 효능을 가지는 기능성 식품과 의약품을 개발하는 데 기술적인 도움을 줄 것이다. Mulberry (Morus alba L.) leaves have been used in traditional oriental medicine for centuries. Mulberry leaves contain various chemical components such as alkaloids, flavonoids and phytochemicals. Mulberry leaves and its extract have many therapeutic benefits, including anti-cancer, anti-diabetic, anti-oxidant and anti-tyrosinase activity. Bioconversion, also called biotransformation, is the conversion of organic materials, like plants or animal wastes, into useful products or energy sources by biological methods or agents, such as certain enzymes or microorganisms. Bioconversion is effective method to enhance the biological activities and bioconversion with enzymes has been used in a variety of fields to improve the bioactivities. In this study, we treated several commercial enzymes, Alcalase 2.4 L FG, AMG 300 L, Lipex 100 L, Pectinex 100 L and Viscozyme L, on mulberry leaves to convert biologically inactive or active compounds into active or more active compounds. We estimated biological activities of extracts from bioconversed mulberry leaves with several enzymes on anti-cancer, anti-α-glucosidase, anti-acetylcholinesterase, anti-lipase, anti-tyrosinase, anti-xanthine oxidase, anti-oxidant activities in vitro. Viscozyme L enhanced the α-glucosidase inhibitory activity of mulberry leaves. Finally, we purified the bioconversed active compounds by ethyl acetate extraction and column chromatographies on normal-phase silica gel and Sephadex LH-20. The yields of purified compounds MAV 1, MAV 2 and MAV 3 were 300, 180 and 43 mg, respectively, from 100 g of mulberry leaves. After purification, we identified three active compounds, MAV 1, MAV 2 and MAV 3, as caffeic acid, quercetin and kaempferol, respectively, using nuclear magnetic resonance spectroscopy. To optimize the yield of the most active compound, quercetin, we examined the relationship between the yield and reaction conditions, such as the amount of substrate and enzyme, temperature, pH and reaction time. At the optimal conditions, 20% substrate, 5% enzyme, 37℃ and pH 4 with a reaction time of 24 hours, 2.34 ± 0.03 mg of quercetin was extracted from 1 g of dried mulberry leaves. The quercetin which is a potent α-glucosidase inhibitor bioconversed from mulberry leaves with Viscozyme L has an anti-diabetic effect and it can be used for the development of health foods and pharmaceutical products.

Characterization of unique lipoxygenases from bacterium Myxococcus xanthus and their application in the biotransformation of polyunsaturated fatty acids to bioactive oxylipins

안정웅 건국대학교 대학원 2018 국내박사

옥시리핀 (Oxylipin)은 지방산화효소 (Lipoxygenase)의 생성물로써, 고등생물에서 신호전달 물질의 일종으로 다양한 생리활성에 관여한다. 특히, 동물에서 지방산화효소에 의해 전환된 옥시리핀은 류코트리엔, 프로스타글란딘, 헤폭실린, 트리오실린을 포함하는 지질 조절제이며, 항염증 및 면역 반응과 밀접한 관련이 있다. 식물에서 지방산화효소에 의해 생성된 과산화지방산은 옥시리핀 생합성 효소에 의해 에폭시-, 수산화-, 케토-지방산 및 알데하이드로 전환되며, 이들은 외부 감염원에 대한 방어기작에 관여한다. 지방산화효소는 생체 내에서 옥시리핀 생합성의 출발효소이며, 비헴-철 효소로써, 지질과산화 효소군에 속한다. cis,cis-1,4-펜타디엔 구조를 가지는 다가불포화지방산으로부터 cis,trans-과산화지방산을 형성하는데 진핵생물에서 처음 발견되었으나, 최근 다양한 생물체에서 널리 보고되고 있다. 동물에 존재하는 몇몇의 지방산화효소는 기존의 과수산화반응 이외에도 과산화지방산을 기질로 에폭시화 반응을 촉매하여 류코트리엔, 헤폭실린과 같은 에폭시지방산을 생성할 수 있다. 지방산화효소는 기질의 종류에 따른 위치특이성에 따라 5-, 8-, 9-, 12-, 13-, 및 15-지방산화효소로 분류되며, 각각의 지방산화효소로부터 생성된 위치특이적 반응물은 생물체에서 다양한 생리활성기능을 가지기 때문에 특정 위치특이성을 가지는 지방산화효소를 확보하는 것은 매우 중요하다. 본 논문에서는 프로테오박테리아인 믹소코쿠스 잔투스 (Myxococcus xanthus)에서 특이한 위치특이성을 가지는 두 종류의 지방산화효소를 발견하였다. MXAN_1745 유전자로부터 발현된 지방산화효소는 아라키도네이트 12S-지방산화효소로 확인되었으며, 에이코사노이드의 탄소 9번 위치와 옥타데카노이드의 탄소 6번 위치에 작용하여 각각 12S-수산화지방산과 13S-수산화지방산을 생성하는 것을 확인하였으며, 에이코사노이드를 기질로하여 12S-형태의 반응물을 형성하는 것을 세균에서 처음으로 보고된 사례이다. 또한, 분자적인 접근을 통해, 아라키도네이트 12S-지방산화효소의 구조에서 위치특이성과 밀접한 관련이 있는 Thr397 잔기를 발견하였고, Thr 잔기를 Tyr로 치환하였을 때, 위치특이성이 변하는 것을 확인하였다. MXAN_1744 유전자로부터 발현된 다른 지방산화효소는 아라키도네이트 11S-지방산화효소로 확인되었으며, 전 생물체를 통틀어 본 연구에서 처음으로 보고되었다. 하지만 효소가 매우 불안정하여, 활성이 낮은 것으로 나타났다. 이 문제를 해결하기 위하여, 조절인자로 포스파티딜 콜린, Ca2+, 코토신 유사 단백질 (CLP)를 처리하여, 아라키도네이트 11S-지방산화효소의 안정성을 높이고, 이를 통해 효소 활성을 증가시켰다. 이 때, 사용한 CLP는 효모인 Rhodosporidium toluroides에서 발견하여 본 연구에서 처음 적용시켰다. 흥미롭게도 M. xanthus에서 발견한 두 가지 지방산화효소는 동물 유래 지방산화효소와 비슷하게 과수산화반응과 에폭시화 반응을 모두 촉매하였다. 더 나아가, M. xanthus를 다가불포화지방산이 포함된 배지에서 배양하여, 지질조절제의 존재를 확인하고, 이와 관련된 고리형산소화 효소와 에폭사이드 가수분해 효소 또한 확보하였다. 이를 이용하여 최종적으로 생리활성을 가지는 옥시리핀의 생합성에 적용하였다. 그 결과, M. xanthus 유래 지방산화효소들과 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 에이코사노이드로부터 10종류의 헤폭실린과 트리오실린 유사체를 생합성할 수 있었으며, 그 중에서도 6종류는 신규한 물질로 각각 헤폭실린 B5, 헤폭실린 D3, 헤폭실린 E3, 트리오실린 B5, 트리오실린 D3, 및 트리오실린 E3로 명명하였다. 또한 생성된 반응물의 생리활성을 확인하였고, 총 6가지 물질이 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체에 대한 부분적인 길항제로써의 역할을 하였다. 또한, M. xanthus 유래 아라키도네이트 11S-지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 옥타데카노이드들로부터 총 9가지의 식물 옥시리핀인 수산화지방산류, 에폭시수산화 지방산류, 및 삼수산화 지방산류를 성공적으로 생합성하였으며, 그 중에서 1종류의 에폭시수산화 지방산과, 2종류의 삼수산화 지방산은 신규 물질로 확인되었다. 전반적으로, 이러한 연구 결과는 앞으로 다양한 유기체에서의 옥시리핀의 생리학적 활성 연구를 용이하게 할 수 있으며, 생체활성 옥시리핀이 미생물 효소에 의한 전환될 수 있음을 시사한다. The lipoxygenase (LOX) products, types of oxylipin, have wide range of biological activities as diverse signaling molecules in higher organisms. In particular, LOX-derived oxylipins in animals, called lipid mediators, including leukotrienes (LTs), prostaglandins (PGs), hepoxilins (HXs), and trioxilins (TrXs), representatively, are significantly involved in anti-inflammatory and immune responses. In plant, hydroperoxy fatty acids (HPFAs) produced from LOXs are converted to epoxy-, hydroxy-, keto-fatty acids and aldehydes by other oxylipin enzymes, it participate in defense mechanisms from exogenous pathogens. LOX is the starting enzyme of oxylipin synthesis in vivo. LOX as non-heme iron enzyme belong to family of lipid peroxidation enzyme which catalyzes the oxygenation of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) containing one or several cis,cis-1,4-pentadiene units into cis,trans-HPFAs. At first, LOXs are reported only in eukaryotes. However, as more studies of oxylipins from various organisms proceed, LOXs also discovered from other organisms. In animals, LOXs also catalyze the epoxidation of HPFAs to epoxy hydroxy fatty acids (EHFAs) such as LTs and HXs. LOXs are classified as 5-, 8-, 12-, and 15-LOXs or 9- and 13- LOXs according to the number of oxygenated carbon site on arachidonic acid (ARA) and linoleic acid (LA), respectively. It is important to obtain a LOX with distinct regiospecificity because the regiospecific-products of LOX are shown different physiological activity in various organisms. In this thesis, two LOXs, having unique regiospecificities from Myxococcus xanthus, a proteobacterium, were investigated. The LOX expressed from the MXAN_1745 gene was identified as ARA 12S-LOX, catalyzed oxygenation at n-9 position in over C20 PUFAs to form 12S-HFAs and oxygenation at the n-6 position in C18 PUFAs to form 13S-HFAs. The 12S-form product of over C20 PUFAs is first reported of bacterial LOXs. Also, the residues involved in regiospecificity were determined to be Thr397. the regiospecificity of the T397Y variant for over C20 PUFAs was changed. Other LOX expressed from the MXAN_1744 gene was identified as ARA 11S-LOX for C20 and C22 PUFAs, it is the first reported from whole organisms. However, M. xanthus ARA 11S-LOX was unstable, it cause low activity. To solve this problem, phosphatidyl choline, Ca2+, and coactosin-like protein (CLP) as stimulatory factors were used to stabilization of enzyme and increase its activity. The CLP used in here was newly identified in the yeast Rhodosporidium toluroides. Interestingly, both LOXs from M. xanthus shown bi-functional activities of peroxidation and epoxidation, similar to mammalian LOXs. In addition, HX, TrX, and PG were identified from cultured wild M. xanthus with ARA, and related enzymes as cyclooxygenase and epoxide hydrolase (EH) could be found. These enzymes also reported first time in bacteria. Finally, the biotransformation pathway of bioactive oxylipins were designed using two LOXs and one EH of M. xanthus. As the results, ten types of HXs and TrXs as mammalian lipid mediators are succeed to produce from eicosanoids by recombinant E. coli expressing ARA 12S-LOX, ARA 11S-LOX, and EH from M. xanthus. Of which six types are newly identified, namely HXB5, HXD3, HXE3, TrXB5, TrXD3 and TrXE3. Also, biological activities of products were investigated that six types were determined potential peroxisome proliferator-activated receptor-γ partial agonist. Also, nine types of HFAs, EHFAs, and THFAs as plant oxylipins are produced from octadecanoids by recombinant E. coli expressing ARA 11S-LOX and EH from M. xanthus. Among them, one of EHFA and two of THFAs are discovered new compounds. Overall, these findings may facilitate physiological studies in various organisms and demonstrates bioactive oxylipins could be produced by microbial enzymes.

Lactic acid bacteria와 Yeast 혼합발효를 통한 인삼 첨가 레드 와인의 제조 및 특성 분석

윤재윤 건국대학교 대학원 2022 국내박사

본 연구는 국산 와인의 품질을 개선하고 고부가가치를 창출할 수 있는 기존의 와인과는 차별화된 독창적인 기능성 와인을 개발하기 위한 목적으로 β-glucosidase를 보유하고 있는 젖산균을 선별, 효모와 혼합접종을 통하여 인삼 추출물을 첨가한 와인 제조시 선별된 젖산균이 와인의 발효에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 젖산균을 대상으로 alcohol 내성, β-glucosidase 활성, 포도주스에서의 생장성 분석을 통하여 인삼 추출물이 함유된 와인 제조시 적합한 젖산균으로 L. plantarum subsp. plantarum KCTC 3108, L. rhamnosus KCTC 5033, O. oeni KCTC 3091 3종류의 젖산균을 선별하였다. 실험은 인삼을 첨가하지 않은 control 와인과 인삼을 첨가하고 효모만 접종한 와인(GY), 그리고 효모와 선별된 젖산균인 L. plantarum subsp. plantarum(GYLp), L. rhamnosus(GYLr), O. oeni(GYOo)를 각각 동시접종한 3종류의 와인을 포함, 총 5종류의 와인을 제조하여 당도, 알코올 함량, pH, 총 산도, 유기산 함량, 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 젖산균에 의한 ginsenoside 생물전환을 분석하였으며, 마지막으로 관능 검사를 실시하였다. 실험 결과 알코올 농도는 인삼을 첨가하지 않은 control 와인이 17.4%로 가장 높게 나타났으며, 인삼을 첨가한 와인은 15.3%~16.3%였다. 잔당의 함량은 control 와인이 9.1 0Brix로 다른 4종류의 와인에 비해 당이 더 소모되었다. pH는 GYLp 및 GYLr 와인의 pH가 발효 전보다 각각 pH 3.62 및 pH 3.76으로 감소하였다. 총 산의 결과도 GYLp(1.16%) 및 GYLr(0.91%) 와인에서 높게 나타났다. 유기산 측정 결과에서도 GYLp 및 GYLr 와인의 발효 전 malic acid가 발효 후 모두 lactic acid로 전환되는 말로락틱 발효가 진행되었다. 총 페놀 함량은 모든 와인에서 발효 전에 비해 감소하였으나 인삼을 첨가한 GY, GYLp, GYLr, GYOo 와인의 총 페놀 함량이 인삼을 첨가하지 않은 control 와인에 비해 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량은 발효 전 모든 와인에서 큰 차이점은 없었으나 발효 후에는 모든 와인의 총 플라보도이드 함량이 감소하였다. 젖산균에 의한 ginsenoside 생물전환 분석에 대한 실험결과 L. plantarum subsp. plantarum를 접종한 GYLp 와인과 L. rhamnosus를 접종한 GYLr 와인에서 발효 후 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc가 저분자 ginsenoside CY 및 CK로 생물전환이 촉진된 것을 확인할 수 있었다. 특히 L. plantarum subsp. plantarum를 접종한 GYLp 와인의 ginsenoside 생물전환이 높게 나타났다. 따라서 인삼을 첨가한 와인 제조 시 말로락틱 발효와 더불어 인삼 성분의 발효 가능성을 위한 젖산균으로 L. plantarum subsp. plantarum 및 L. rhamnosus가 보다 효과적인 미생물이 될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구는 국산 와인의 고부가가치화를 위해 젖산균과 인삼추출물의 적용 가능성에 대한 시도로써 의의가 있다. The purpose of this study is to improve the quality of domestic wine using ginseng in the presence of lactic acid bacteria and yeast. For this purpose, various β-glucosidase producing lactic acid bacteria was selected, and their effect on wine fermentation with ginseng extract was investigated. Alcohol tolerance, β-glucosidase activity, and the growth rate of the lactic acid bacterial species in the grape juice were analyzed. As a result, L. plantarum subsp. plantarum KCTC 3108, L. rhamnosus KCTC 5033 and O. oeni KCTC 3091 were selected as suitable species for the wine fermentation using the grape juice containing ginseng extract as a wine making material. To evaluate the ginsenoside production characteristics, five different types of wine preparation were made (control wine (with yeast, no ginseng added), only yeast inoculated (GY), L. plantarum subsp. plantarum inoculated (GYLp), L. rhamnosus inoculated (GYLr) and O. oeni inoculated (GYOo)). Sugar content, alcohol concentration, pH, total acidity, organic acid content, total phenolics, total flavonoid and ginsenoside biotransformation were analyzed at the end of fermentation, and organoleptic analysis was also performed. As a result of the experiment, the alcohol concentration was the highest at 17.4% for the control wine without ginseng, and 15.3% to 16.3% for the ginseng added wine. The residual sugar content of the control wine was 9.1 0Brix and sugar was consumed more than other four types of ginseng added wine. The pH of GYLp and GYLr were decreased to pH 3.62 and pH 3.76, respectively than before fermentation. The results of total acid were also high in GYLp(1.16%) and GYLr(0.91%). As a result of organic acid measurement, malo-lactic fermentation (MLF) was performed in which malic acid was converted into lactic acid before fermentation in the GYLp and GYLr. The total phenol content was decreased in all wines compared to before fermentation, but the total phenol content of ginseng added wines (GY, GYLp, GYLr, GYOo) were higher than control wine without ginseng. The total flavonoid content was not significantly different in all wines before fermentation, but the flavonoid content of the wines inoculated with lactic acid bacteria were decreased more after fermentation. The results of ginsenoside biotransformation analysis by lactic acid bacteria showed that the biotransformation of ginsenoside Rb1, Rb2, and Rc were promoted to low molecular weight ginsenosides CY and CK after fermentation in the wines inoculated with L. plantarum subsp. plantarum (GYLp) and L. rhamnosus (GYLr). In particular, the ginsenosides biotransformation of the wine inoclulated with L. plantarum subsp. plantarum (GYLp) was high. Therefore, it is expected that L. plantarum subsp. plantarum and L. rhamnosus can be more effective microorganisms as lactic acid bacteria for the possibility of fermentation of ginseng components as well as malo-lactic fermentation in preparation of ginseng added wine. This study suggests the possibility of application of lactic acid bacteria and ginseng extracts for high value added of domestic wine.