라임(Citrus aurantifolia) 추출물, Geranyloxycoumarin, Coumarin유도체의 항균 및 장관면역 조절 효과 규명

황수미 부산대학교 대학원 2021 국내박사

Coumarin is an aromatic organic compound of flavonoids that are found as colorless crystals. A multitude of antimicrobial and antioxidant compounds engaged in the plant defense mechanism are found in abundance in the plant body, and coumarin is a compound with various bioactivities such as antioxidant, anti-inflammatory, anticancer, antimicrobial, antifungal, and anticoagulant effects. Coumarin exhibits a wide range of biological activities in living organisms by being able to mediate noncovalent interactions with numerous enzymes and receptors, and the compound has thus been the choice as a key natural substance in biomedical science for disease treatment. In this study, natural compounds from the peel of Citrus aurantifolia were isolated, extracted and purified, and after the device analysis of their structures, the compounds were used as precursors in synthesizing geranyloxy coumarin derivatives with known anti-inflammatory effects and coumarin derivatives with outstanding antimicrobial effects. These derivatives were subsequently analyzed for the regulatory effects on immune cells and the anti-inflammatory activities using mice infected with Citrobacter rodentium and for the intestinal immune regulatory effects using intestinal organoids. The results showed that, regarding antimicrobial activities, the C. rodentium-infected mice treated with the coumarin derivatives with a known antimicrobial effect against Escherichia coli exhibited anti-inflammatory activities. Oral administration of the coumarin derivatives 3cf, 3gf, and 3k led to the reduction of C. rodentium bacteria in mice fecal samples, and the level of RORγt+ T cells, the key transcription factor of Th17 cells differentiation in the intestinal lamina propria, was reduced. This reduction in the level of RORγt+ T cells is particularly noteworthy in mice immunity together with the reduction of C. rodentium bacteria. In addition, the macrophage RAW 264.7 cells was treated with non-cytotoxic geranyloxy coumarin derivatives 5c, 5d, 5g, 5i, 5j, 5k and 5l and coumarin derivative 3ff, and the anti-inflammatory activities were analyzed after the concentration-dependent treatment of cells with lipopolysaccharides. The level of inflammatory cytokine IL-1β decreased, while the level of anti-inflammatory cytokine IL-10 increased. This confirmed that geranyloxy coumarin derivatives exerted an adequate control over the inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines that regulate immune reactions. Next, porcine intestinal organoids were used to determine the intestinal immune regulatory effects of the compounds that had exhibited an effect to control the cytokines in RAW 264.7 cells. As a result, 5 μM of geranyloxy coumarin derivatives 5j and 5k were found to have activated the proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells, with an ability to promote and regulate the development of intestinal epithelial cells. Furthermore, regarding antimicrobial effects against various pathogens, an outstanding activity was shown by the coumarin derivatives containing a CF3 group, and when coumarin derivatives of a new structure with a CF3 group were additionally synthesized, they were found to have antimicrobial effects against all tested agents including 8 strains of pathogenic bacteria, 1 strain of Streptococcus mutans, 1 strain of Candida albicans, and 3 strains of Aspergillus spp. The results indicated that the soluble coumarin derivatives containing a fluorine (F) moiety exhibited high antimicrobial effects. Thus, the 8 types of coumarin derivatives with a newly identified structure containing a CF3 group are anticipated to contribute to the development of natural antimicrobial agents against S. mutans and others and the determination of diverse antimicrobial effects, through further studies on the different relations between the structures containing a CF3 or OH group and the respective activities. 본 연구에 활용되는 Coumarin(쿠마린)은 무색의 결정체로 플라보노이드 계열의 방향성 유기 화학 물질이다. 식물 방어반응에 관여하는 항미생물, 항산화 성분이 식물체 중 다량 존재하며 항산화, 항염증, 항암, 항균, 항진균 및 항응고제 작용등과 같은 다양한 생리활성을 나타내는 물질이다. Coumarin은 살아있는 유기체에서 많은 효소 및 수용체와 비공유 상호 작용하는 능력으로 광범위한 생물학적 활성을 나타냄으로 질병을 치료하는 의약 화학분야에서 중요한 천연물질로 선택되어 왔다. 라임(Citrus aurantifolia)껍질에서 분리된 천연물질을 추출, 분리하여 GC-MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, 19F-NM R로 구조를 분석하고 항염증에 효능이 있는 것으로 알려져 있는 geranyloxycoumarin(제라닐옥시쿠마린) 유도체와 항균력과 항염증에 효능이 우수한 coumarin 유도체들을 합성하였다. 라임 추출물, geranyloxycoumarin 유도체, coumarin 유도체를 이용하여 항균 스크리닝을 실시하고 항균력이 우수한 coumarin 유도체들을 이용하여 Citrobacter rodentium 감염 마우스를 이용한 장관내 항균력과 장면역세포의 면역 반응을 분석하였다. 또한, geranyloxycoumarin 유도체를 이용하여 대식세포주 Raw 264.7 cells을 이용한 염증성 cytokine과 항염증성 cytokine 분석 및 장관 오가노이드(Intestinal organoid)를 활용한 오가노이드 발생 효율(Organoid forming efficiency, %), 오가노이드 형성 효율(Organoid budding efficiency, %)을 분석하였다. 그 결과, 항균 활성에서 Escherichia coli에 항균력이 확인된 coumarin 유도체 시료를 이용하여 Citrobacter rodentium 감염 마우스에 투여시 coumarin 유도체인 3cf, 3gf, 3k를 구강투여(oral gavage)한 감염 마우스의 분변내 C. rodentium 균 감소와 coumarin 처리된 감염 마우스의 대장내 점막고유층(Lamina Propria)에서 Th17 cells분화의 중요한 유전자 전사인자(Transcription factor)인 RORγt+ T cells의 감소를 확인하였다. 특히, IL-17 cytokine을 분비하는 Th17 cells의 전사인자인 RORγt+ T cells의 감소는 coumarin 처리된 감염 마우스의 C. rodentium 균 감소와 함께 확인되어 3cf, 3gf, 3k coumarin 처리 그룹의 항균 효과와 장관면역반응에 중요한 역할을 하였음을 상징성 있게 보여 주는 결과로 사료된다. 또한, 대식세포주인 RAW 264.7 cells에서 세포독성이 없는 geranyloxycoumarin유도체인 5c, 5d, 5g, 5i, 5j, 5k, 5l과 coumarin 유도체인 3ff에서 lipopolysaccharide(LPS)를 공통적으로 처리하고 물질별로 농도 처리하여 항염증 반응을 분석한 결과 염증성 cytokine인 IL-1β는 감소하고 항염증성 cytokine인 IL-10은 상대적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. 이는 특히, geranyloxycoumarin 유도체 시료에서 면역반응을 조절하는 염증성 cytokine과 항염증성 cytokine의 조절이 적절하게 조절되고 있으며 면역세포의 항상성 조절을 매우 잘 하고 있음을 확인할 수 있었다. 다음은 RAW 264.7 cells에서 cytokine을 잘 조절했던 물질들이 장관면역에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위해 돼지 소장 오가노이드를 활용하여 효과를 확인하였다. 그 결과, 4일째 오가노이드 형성 효율(Organoid budding efficiency, %)에서 대조군 41%에 비해 5 uM geranyloxycoumarin 유도체 시료 5j는 65%, 5k는 67% 측정되어 geranyloxycoumarin 유도체 5k, 5j의 5 uM 농도에서 오가노이드 형성 효율이 잘 일어난 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는, 대식세포 Raw 264.7 cells에서 항염증을 조절했던 geranyloxycoumarin 유도체 시료에서 장상피세포의 증식과 분화가 활발히 일어났음을 확인하였고 장상피 세포의 발달 및 조절능을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 coumarin 유도체에서 장관내 항균력과 장관면역반응을 확인하였고 geranyloxycoumarin 유도체에서 면역세포의 항상성 조절과 장상피세포의 증식과 분화를 확인하여 장내 미생물 및 면역 조절 기전에 관한 연구와 장관 염증조절제 개발 연구에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Zinc ion-releasing hydrogels for enhanced skin wound healing with imunomodulation

허민재 인천대학교 대학원 2024 국내석사

피부는 우리 몸의 가장 바깥에 위치하여 외부 환경과 직접적으로 접촉하기 때문에 인체에서 가장 취약한 조직입니다. 크고 작은 피부의 상처는 환자의 불편함, 통증, 위험 등 다양한 부정적인 경험을 동반합니다. 따라서 현대사회에서는 더 진보된 창상 치료용 생체재료에 대한 수요와 요구가 증가하고 있습니다. 하이드로젤은 친수성 고분자의 3차원 네트워크입니다. 최근에는 하이드로젤의 물리, 화학, 그리고 생물학적 자극을 통해 주변 조직을 자극하고 세포들과 상호작용하는 생체활성 하이드로젤이 주목받고 있습니다. 생체활성 하이드로젤은 내인성 치유 능력을 향상시켜 상처 치유를 향상시킬 수 있습니다. 특히 면역조절 하이드로젤은 다양한 면역세포의 활성과 기능을 조절해 염증단계를 조절합니다. 대표적으로 대식세포는 표현형 조절을 통해 전 염증 및 항 염증 미세환경을 제공하여 상처치유에 기여합니다. 무기이온 기반 생체활성 하이드로젤은 인체 내의 다양한 생물학적 기능을 조절하는 무기이온의 면역조절 특성을 활용하여 조직 재생을 향상시키기 위한 생체 재료입니다. 특히, 아연이온은 선천성 및 적응성 면역조절에 관여하며 면역조절 인자 발현을 통해 대식세포 유입 및 M2 대식세포 분극화에 효과적이며 상처치유 전반적인 과정에 기여합니다. 하지만 대식세포 행동을 조절하는 아연이온의 면역조절 기작은 아직 명확하게 밝혀지지 않았습니다. 따라서 아연이온 기반의 생체재료를 제작함에 있어 면역조절 기작을 이해하는 것은 중요합니다. 본 연구에서는 티올-엔 가교 반응과 과산화아연 매개 가교 반응을 통해 아연이온 방출 면역조절 하이드로젤을 개발하였습니다. 하이드로젤은 상전이 시간 및 기계적 강도를 포함하여 조절 가능한 물리화학적 특성을 가집니다. 우리 하이드로젤은 장기간 지속적으로 아연이온을 방출하여 장기간 아연 이온이 풍부한 미세환경을 제공할 수 있습니다. 또한, 우리 하이드로젤은 상처 치유 생체재료로서 우수한 세포적합성과 조직적합성을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 하이드로젤에서 방출된 아연이온은 면역조절 인자(CCL2/MCP-1, A20/TNFAIP3 및 IL-13)의 발현을 통해 대식세포 유입 및 M2 표현형 대식세포 분극화를 나타냈습니다. 항 염증 미세환경을 제공하는 M2 대식세포는 면역조절뿐만 아니라 세포증식, 혈관 신생, 콜라겐 성숙 등 상처치유 전반적인 과정에 기여할 수 있습니다. 결론적으로, 우리의 아연이온 방출 면역조절 하이드로젤이 상처치유 및 조직 재생을 위한 진보된 면역조절 생체재료로서 큰 잠재력을 가지고 있다고 제안합니다. Skin is the most vulnerable tissue in the human body because it is located on the outermost layer of our body and is direct contact with the external environment. Skin wounds, large and small, are associated with various negative experiences, including patient discomfort, pain, and danger. Therefore, the demand and demand for more advanced biomaterials for wound treatment is increasing. Hydrogels are three-dimensional networks of hydrophilic polymers. Bioactive hydrogels that stimulate surrounding tissues and interact with cells through physicochemical and biological stimulation are attracting attention. Bioactive hydrogels can enhance the endogenous healing process and improve wound healing. The immunomodulatory hydrogel regulates the inflammation stage by controlling the activity and function of various immune cells. Macrophages typically contribute to wound healing by regulating the microenvironment through phenotypic changes that promote both pro-inflammatory and anti-inflammatory responses. Inorganic ion-based bioactive hydrogel is a biomaterial that improve tissue regeneration by utilizing the immunomodulatory properties of inorganic ions that regulate various biological functions in the human body. Specifically, zinc ions (Zn2+) are involved in innate and adaptive immunomodulation and are effective in macrophage recruitment and M2 macrophage polarization through immunomodulatory factor expression. However, the mechanism by which Zn2+ regulates macrophage behavior as an immunomodulator has not yet been clearly identified. Therefore, it is important to understand the mechanism when producing Zn2+-based biomaterials. Herein, we developed Zn2+-releasing immunomodulatory hydrogel via thiol-ene cross-linking reaction and ZnO2-mediated crosslinking reaction. This hydrogel had tunable physicochemical properties, including gelation time, and mechanical strength. Our hydrogel continuously released Zn2+ for up to 28 days, providing a long-term zinc ion-rich microenvironment. Our bioactive hydrogel showed excellent cytocompatibility and tissue compatibility biomaterial for wound healing. Interestingly, zinc ions released from the hydrogel exhibited macrophage recruitment and M2 phenotype macrophage polarization through the expression of immunomodulatory factors (CCL2/MCP-1, A20/TNFAIP3, and IL-13). M2 macrophages, which provide an anti-inflammatory microenvironment, could contribute not only to immune regulation but also to the overall wound healing process, including cell proliferation, angiogenesis, and collagen maturation. In conclusion, we suggest that Zn2+-releasing immunomodulatory hydrogels have great potential as advanced immunomodulatory biomaterials for wound healing and tissue regeneration.

Immune regulation of mesenchymal stem cells through indoleamine 2,3-dioxygenase-aryl hydrocarbon receptor axis

박하영 인제대학교 일반대학원 2021 국내석사

Objective: Mesenchymal stem cells (MSCs) are being applied to treat inflammatory diseases based on their ability to suppress inflammation. MSCs acquire immuno-modulatory function by various inflammatory cytokines, but are limited in their use due to increased immunogenicity and functional instability in the inflammatory microenvironment. In this study, I establish stable immunomodulatory function of MSCs based on the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), and investigate its therapeutic effect and mechanism of action for inflammatory diseases. Method: The immunoregulatory function and immunogenicity of MSCs induced by various combinations of interferon-γ (IFN-γ) and bortezomib (BTZ) were identified by the expression of IDO and MHC class II. The effectiveness of MSCs at inhibiting inflammatory diseases was confirmed through evaluating disease severity, histopathological evaluation, and inflammatory cytokine analysis in mouse models with pulmonary and colitis diseases. Aryl hydrocarbone receptor (AhR) antagonist and AhR knockout mouse models are used for investigating the mechanism of action. Results: When MSCs were co-treated with low concentration IFN-γ (10-50 IU/ml) and BTZ, the functional expression of the immunomodulatory enzyme IDO was effectively induced, while the expression of immunogenic and inflammatory cytokines was significantly reduced. It was confirmed that the disease inhibitory effect of IFN-γ/BTZ-treated MSCs was lost when AhR signal was blocked using antagonist-treated and AhR knockout mice. A significant disease inhibitory effect was confirmed when IFN-γ/BTZ-treated MSCs were administered to an inflammatory disease mouse model. Conclusion: The combined treatment of low-dose IFN-γ and BTZ can reliably induce immunoregulatory function of MSCs, which maximizes the inhibitory effect of inflammatory diseases. The induction of AhR activation in inflammatory cells by the IDO of MSCs is a key mechanism in the regulation of inflammatory responses. Therefore, the stable immunoregulatory function of MSCs based on the IDO-AhR axis can be an effective strategy for treating inflammatory diseases. 목적: 중간엽줄기세포는 염증 억제 기능을 바탕으로 다수의 염증질환에 이용되고 있다. 중간엽줄기세포는 다양한 염증성 사이토카인에 의하여 면역조절 능력을 획득하지만 면역원성 증가 및 염증 미세환경에서의 기능적 불안정으로 인해 사용이 제한되어 있다. 본 연구에서는 면역조절효소 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO)를 기반으로 중간엽줄기세포의 안정적인 면역조절기능을 확립하고 다양한 염증 질환에 대한 치료 효과와 작용 기전을 조사한다. 방법: 인터페론-감마(IFN-γ)와 보르테조밉(BTZ)의 다양한 조합에 의한 중간엽줄기세포의 면역조절기능과 면역원성은 IDO와 MHC class II의 발현으로 확인하였다. 중간엽줄기세포의 염증질환 억제효과는 폐염증질환 및 장염증질환을 가진 마우스 모델에서 투여하여 질환 중증도, 조직 병리학적 평가 및 염증성 사이토카인 분석을 통해 확인하였다. 작용 기전 조사를 위해 아릴하이드로카본 수용체(AhR) 길항제 처리 및 AhR knockout 마우스 모델을 사용하였다. 결과: 중간엽줄기세포에 저농도 IFN-γ(10-50 IU/ml)와 BTZ를 공동 처리하면 면역조절효소 IDO의 기능적 발현이 효과적으로 유도되고 동시에 면역원성 및 염증 사이토카인의 발현이 유의하게 감소하였다. IFN-γ/BTZ-처리 중간엽줄기세포를 염증질환마우스모델에 투여 시 유의한 질환 억제 효과를 확인하였다. 길항제 처리 및 AhR knockout 마우스를 이용하여 AhR 신호 차단 시 IFN-γ/BTZ-처리 중간엽 줄기세포의 질환 억제 효과가 상실됨을 확인하였다. 결론: IFN-γ와 BTZ 공동 처리를 통해 중간엽 줄기세포의 면역조절 기능을 안정적으로 유도할 수 있고 이를 통해 염증질환 억제효과를 극대화 시킬 수 있었다. 중간엽줄기세포의 IDO에 의해 염증세포의 AhR 활성화 유도가 염증 반응 조절의 핵심 기전임을 입증하였다. 그러므로 IDO-AhR 축을 기반으로 한 중간엽줄기세포의 안정적인 면역조절 능력은 염증성 질환을 치료하기 위한 효과적인 전략이 될 것으로 생각된다.

녹용에서 면역조절물질의 정제 및 활성연구

이의정 이화여자대학교 대학원 2001 국내석사

녹용은 한방에서 강장제로 사용하고 있으며 신체의 전반적인 면역기능의 증가와 세포성 및 체액성 면역 기능의 증강, macrophage의 활성화 등에 관여한다는 연구 보고가 있다. 그러나 녹용의 어느 성분이 면역 조절을 담당하는 지에 대해서는 연구가 미흡하다. 본 연구에서는 녹용에서 면역 조절 작용이 있는 성분을 찾아 구조 분석하였다. 녹용은 다단계 용매 추출법에 의해 hexane, chloroform 및 70% ethanol 세단계로 추출을 실시하였다. 추출물 중 면역조절 작용이 있는 성분을 ConA로 활성화된 증식 분석법을 이용하여 분리하였다. 각 단계마다 면역조절활성도가 가장 높은 분획을 따라 silica gel column chromatography로 분리, 정제하였다. 최종 분획을 FT-NMR , FAB-Mass, Tandem-Mass, FT-IR등을 사용하여 구조 분석한 결과 분자량 760 근처의 arachidonyl(C20:4), stearoyl(Cl8:1), oleoyl(Cl8:1), linoleoyl(Cl8:2), palmitoyl(Cl6:0), myristoyl(Cl4::0)을 포함하는 phosphatidylcholine class 임을 확인하였다. 녹용의 또 다른 면역조절 작용을 연구하기 위해, 기본적인 분석법을 비롯하여 항암작용을 일으키는 activated killer(AK) 세포 활성을 알아보기 위해 Iymphokine activated killer cell(LAK) 분석법을 사용하였다. 세포 증식 기전을 알아보기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포내 Ca^(2+)농도([Ca^(2+)]_(i)) 증가의 경향을 함께 살펴보았다. 이에 대해 LAK 분석법에서 녹용추출물이 아무런 활성을 나타내지 않았고, [Ca^(2+)]_(i),를 단독으로 증가시키는 것으로 보아, [Ca^(2+)]_(i)의 증가를 통한 세포 증식 기전에 관여한다는 것을 알 수 있었다. Deer antler has been recognized as one of the most effective invigorant and the enhancer of resistance to infectious disease among traditional medicine. Cervus elaphus was extracted with hexane, chloroform 70% ethanol. The 70% ethanol extract were further purified by silica gel column chromatography and the fraction from each purification steps were analyzed by high performance thin layer chromatography. Concanavalin A(ConA) is a mitogen of lectin classes to be responsible for the T cells by proliferating the spleen cells with thymidine incorporation. In this study, the component(CE-E-3-C-d-Ⅲ-2) of 70% ethanol extracts suppressed the immunomodultary activity by alone, but stimulated with ConA. This components were analyzed by FAB mass, Tandem mass, NMR spectrometry, FT-IR and identified to be phophatidylcholine (1,2-alkyl -sn -glycerol-3-phosphocholine) containing arachidonyl(C20:4), stearoyl(C18:0), oleoyl(C18:1), linoleoyl(C18:2), palmitoyl(C16:0), myristyl(C14:0). Deer antler has been also used for an antitumor activity AK cell. The fraction of 7o% ethanol extracts (CN-E) cant show an antitumor activity to the LAK assay. In view of the central role of Ca^(2+) in driving optimal splenocyte proliferation, we investigated the effects of CE-E-3-C-d-Ⅲ-2 on Ca^(2+)-dependent proliferative responses. As a result [Ca^(2+)], release was shown to depend on the dose of the CE-E-3-C-d-Ⅲ-2.

비사포닌계 홍삼 성분이 노화의 비특이적 면역조절작용에 미치는 영향 연구

장선아 강원대학교 산업과학대학원 2010 국내석사

홍삼은 수삼을 수증기로 쪄서 건조한 것을 말하며, 이는 주요 약리성분인 사포닌과 비사포닌으로 구성되어 있다. 인삼 사포닌은 항염증 작용, 해독작용, 혈소판 응집억제 작용, 항간염 작용, 암세포 증식억제 작용, 간보호 작용, 혈관이완 작용, 진통작용, 해열작용 등 다양한 약리활성이 보고되고 있으나 그에 반해 비사포닌계 약리활성은 보고된 바가 적다. 본 연구의 목적은 비사포닌계 홍삼 성분 (non-saponin red ginseng : NSRG)의 면역조절작용과 노화에 의한 면역계에 미치는 작용을 알아보고자 하였다. 우선, NSRG의 면역조절 능력을 측정하고, 노화쥐를 이용하여 노화쥐에서의 면역조절작용의 변화 및 회복현상을 측정함으로써 비사포닌계 홍삼 성분이 면역증강제로 사용할 수 있는지 확인하고, 노인면역에서도 면역증강제로써 그 효능이 유지될 수 있는지의 여부를 측정하였다. 또한 신경계의 NCAM 단백질의 발현과 손상된 NCAM의 회복효과를 확인함으로써 노인성 뇌질환에도 유용한지의 여부를 확인하였다. 연구결과 대식세포주인 RAW264.7에 NSRG를 농도별 (1, 10, 100 ㎍/㎖)를 처리시 1 ㎍/㎖에서만 항암활성 효과가 증가하였고, NO 생성에는 유의적인 효과가 없음을 확인하였다. Splenocyte를 이용한 lymphoblastogenic response에서는 NSRG 100 ㎍/㎖에서 B cell의 세포증식을 확인하였고, 자연살해세포 항암효과에서는 NSRG가 농도 의존적으로 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 노화상태에서의 면역조절효과를 측정하였는데, 노화쥐 (82주; 1년 9개월)와 정상쥐 (8주)의 대식세포에 NSRG를 처리한 배양액을 이용하여 항암효과와 NO 생성을 확인한 결과, 노화쥐의 배양액에서는 항암효과와 NO 생성이 증가한 반면, 정상쥐의 배양액에서는 항암효과와 NO 생성 모두 아무런 효과를 보이지 않았으며, 탐식작용에서는 두 군 모두 아무런 효과를 보이지 않았음을 확인하였다. 더불어 뇌조직의 대식세포인 microglia 세포주 C6를 이용하여 IFN-γ 처리시 유도된 NO 생성이 NSRG에 의해 감소되는 것을 확인하여 항염증 효과를 예측하였고, 뇌 신경세포주인 SK-N-SH에 acrylamide (ACR) 처리시 손상된 NCAM의 발현을 NSRG 가 다시 회복시켰으며, 또한 NSRG가 자체적으로 NCAM의 발현을 증가시키는 것도 확인하였다. 또한, ACR에 의해 감소된 SK-N-SH의 세포증식력을 NSRG가 농도 의존적으로 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 본 연구결과로부터 홍삼의 NSRG는 신경염증성 상태 또는 신경독성 물질에 의한 신경퇴행성 질환을 앓는 환자들에게 신경보호 치료제로써의 가능성과, 노인면역에 있어서도 면역증강제로써 유용하다는 잠재적인 가능성을 제시한다. Red ginseng (Ginseng Radix Rubra) is produced by steaming the root of white ginseng (Ginseng Radix Alba) followed by drying. The major pharmacologic components of red ginseng are saponin and non-saponin. The saponin of ginseng has been known to have a variety of pharmacologic action such as anti-inflammatory action, platelet anti-aggregation, anti-hepatitis action, anti-tumor action, vasorelaxative action, analgesic action, anti-pyretic action and so on. However, pharmacologic action of non-saponin are well-unknown. Therefore, this study examined the effect of non-saponin red ginseng (NSRG) components on the NK cell, macrophage and lymphocyte blastogenesis activities. Also, we determined whether the macrophage response to NSRG in aged mices is different from that of young ones. Additionally, we determined the neuronal effects of NSRG on neuron cells and glial cells. We assessed the effects of NSRG on NK cell and macrophage tumoricidal activities, and the lympho-proliferative response to the mitogen stimulus. NSRG had no effect on nitric oxide (NO) production in macrophages while it increased tumoricidal activity of macrophages at 1 ㎍/㎖. However, NK cells treated with NSRG (1, 10, 100 ㎍/㎖) showed increased tumoricidal activity in dose-dependent manner. NSRG also increased lymphoblastogenic response of lymphocytes to the LPS at 100 ㎍/㎖. In the next experiment, we assessed the effects of NSRG on the functions of macrophages in young (8 weeks) and aged (82 weeks) C57BL/6 male mice in vitro, respectively. NSRG increased NO release in macrophages from aged mice. Supernatants of NSRG-treated macrophages from aged mice resulted in the increase of cytotoxicity against B16 tumor cells at 300 μg/㎖. In addition, NSRG alone had a direct cytotoxic effect on B16 tumor cells. However, NSGR did not show significant effect on the functions of mcrophages from young mice. In case of the phagocytic activity, there were no differences in both mice. Additionally, we examined whether NSRG could modulate the NO production of astrocytes. NSRG suppressed the levels of NO induced by IFN-γ in C6 cells. Interestingly, NSRG showed protective effects on neuroblastoma cells (SK-N-SH). NSRG not only directly increased the exression of NCAM but also restored impaired NCAM exression by ACR. Further more, NSRG also restored impaired proliferation of SK-N-SH cells by ACR in a dose-dependent manner. Taken together, these results suggest that NSRG would be a possible therapeutic approach for the treatment of people who suffered from neurodegenerative diseases by inflammation or neurotoxins. Also, NSRG shows potential as an immunomodulator for aged people.

RAW264.7 대식세포와 CPA유도 면역저하 마우스모델에서 울금추출물과 홍화씨추출물의 면역조절 효과

최진영 전북대학교 일반대학원 2023 국내석사

울금과 홍화씨는 건강식품으로 사용되어 왔으며, 항염증, 항산화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 울금추출물(Curcuma longa L. Extract, CLE)과 홍화씨추출물(Carthamus tinctorius L. Extract, CTE)이 염증반응유도 대식세포와 면역억제 마우스 모델에 미치는 면역조절 효과를 조사하였다. RAW 264.7 세포에 CLE, CTE 및 CLE + CTE (1:0.6, v/v)를 0~200 mg/kg의 농도로 처리하여 세포 생존율 및 산화질소(NO) 생성능을 관찰하였다. 실험결과 모든 그룹에서 NO 생성이 억제되었으며, CLE + CTE 처리 그룹에서 가장 강한 억제 효과가 나타났다. CLE + CTE 처리 그룹에서 유도성 산화질소 신타아제 (iNOS) 및 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타아제 2(COX-2)의 발현이 CLE와 CTE 단독 처리 그룹에 비해 강하게 조절되었으며, ERK 1/2 및 p38 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 또한, CLE + CTE는 마우스 복막 세포의 생존율, 자연살해세포(NK) 활성 및 NK 세포 관련 사이토카인 발현을 유의미하게 조절하였다. 그리고 CPA 유도 면역결핍 마우스모델에서 CLE, CTE, CLE + CTE 처리 그룹은 체중 및 비장 중량, 면역글로불린 및 NK 세포 활성도 수준이 조절되었다. 종합적으로, 본 연구 결과는 CLE와 CTE가 LPS 유발 염증 RAW264.7 세포 및 CPA 유도 면역결핍 마우스 모델에 대해 면역조절 효과를 보이는 것으로 나타났으며, CLE와 CTE의 병용 처리에 의한 시너지 효과에 대한 과학적 증거를 제공한다.

간세포암종에서의 ICP-279의 발현과 CIK 세포 저해 효과 : HCC와 CIK에서 ICP-279의 효과

최수혁 호서대학교 일반대학원 2023 국내석사

천연추출물 유래 물질의 면역세포 활성효능 평가

김도희 세명대학교 대학원 2025 국내석사

지속적인 면역 조절제의 연구에도 불구하고 치료 반응의 개인차와 내성 발생 문제는 여전히 임상에서 중요한 과제로 남아 있다. 이에 따라 단일 기전 조절을 중심으로 한 기존 접근을 보완할 수 있는 복합적인 면역조절 전략에 대한 요구가 증가하고 있다. 특히 천연 유래 생리활성 물질은 낮은 독성과 복합적인 면역조절 기능을 나타내는 것으로 보고되어 새로운 면역치료 후보 물질로 제시되고 있다. 면역세포의 이동을 통한 면역 조절은 병원균의 침입이나 자가면역질환에서 체내 항상성을 맞추는데 중요한 과정으로 익히 알려져 있다. 이러한 면역세포는 특정 케모카인의 세포 표면 접착 분자에 의해 특정 조직으로 유도되어 기능을 수행한다. Zerumbone은 항암, 항염증 및 이동성에 대한 연구 결과가 보고 되었으며, PSK는 면역조절과 항종양에 대한 연구 결과가 보고 되었다. 이에 본 연구에서는 백혈병 T 세포주인 Jukrat과 전혈 유래 PBMC, T 세포 및 NK 세포에 Zerumbone과 PSK를 처리하여 두 천연추출물에 의한 각 세포의 면역활성을 분석하였다. 그 결과 Zerumbone은 T 세포의 이동성을 감소시켰으며 Polysaccharide-K(PSK)는 T 세포의 이동성을 증가시켰다. T 세포, PBMC 그리고 NK 세포의 활성에는 다양한 영향을 나타냈다. 이러한 연구 결과는 Zerumbone, PSK가 면역조절제 또는 면역보조제로서 사용할 가능성을 시사하는 바, 향후 세밀한 추가 연구가 요구된다.

코디세핀 고함유 밀리타리스 동충하초의 면역조절과 마우스 종양 성장에 미치는 영향

이창민 동아대학교 대학원 2013 국내박사

코디세핀 고함유 밀리타리스 동충하초의 면역조절과 마우스 종양 성장에 미치는 영향 Effects of Cordycepin-enriched Cordyceps militaris on Immunomodulation and Mouse Tumor Growth 의 학 과 이 창 민 지도교수 이 상 화 밀리타리스 동충하초는 건강 증진과 다양한 질병의 치료 목적으로 오래전부터 사용되어 왔다. 특히 밀리타리스 동충하초의 주요 성분 중의 하나인 코디세핀은 항염증, 항감염, 항당뇨 및 항종양 효과 등 다양한 약리학적 작용을 가지고 있다고 연구되었다. 이들 작용은 모두 면역반응과 연관되어 있음을 추정할 수 있지만, 항종양 효과를 설명할 수 있는 면역학적 기전에 대하여는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 야생형 밀리타리스 동충하초를 역교배하여 만든 코디세핀 고함유 밀리타리스 동충하초 JLM 0636 신품종의 종양면역반응에 대한 작용과 그에 따른 항종양 효과를 조사하고자 하였다. 밀리타리스 동충하초 JLM 0636 신품종의 코디세핀 함량은 야생형에 비하여 7 배 많은 건조중량 1 그램당 7.42 밀리그램으로 측정되었다. 여기에서 분리정제한 코디세핀은 지질다당질로 자극한 마우스 비장세포의 IL-4, IL-10 IL-12 및 IFN-γ, 생산을 증강시킨 반면 IL-2, IL-6 및 TNF-α 분비는 억제하였다. 특히 IL-2의 감소와 IL-4 및 IFN-γ의 증가는 종양면역반응에서 주요한 세포성 면역반응의 조절에 있어서 밀리타리스 동충하초의 작용 가능성을 시사하고 있다. 이에 마우스를 대상으로 밀리타리스 동충하초를 사료와 물을 통하여 지속적으로 공급하면서 마우스 유방암세포를 이식한 결과, 대조군에 비하여 유의한 종양 성장 저해 효과와 생존율의 증가를 관찰할 수 있었으며, 이 효과는 야생형에 비하여 코디세핀 고함유 JLM 0636 품종에서 더욱 분명하게 나타났다. 종양이 형성된 마우스의 비장세포는 concanavalin A 자극에 대하여 림프구 증식반응에서는 차이를 보이지 않았지만, 밀리타리스 동충하초를 습식한 경우 코디세핀 함량에 비례하여 IL-2 생산은 감소한 반면 IL-4와 TGF-β 분비는 증가하였다. 이들 사이토카인은 가장 주요한 종양면역 억제 세포인 Treg 세포의 생성과 관련이 있으므로, 비장세포의 T 세포 아군에 대하여 분석하였다. 실험군에 따른 CD4+ T 세포의 빈도는 변화가 없었지만, CD4+CD25+ 세포는 코디세핀 함량에 비례하여 유의하게 감소하였다. 분명한 Treg 세포 표식자인 FoxP3 발현도 CD4+CD25- 세포에서는 변화가 없었지만, CD4+CD25+ 세포 집단에서 동일한 양상으로 감소하였다. 반면에 CD8+ T 세포와 종양면역반응에서 종양특이적인 세포독성 T 세포로 작용하는 IFN-γ 발현 CD8+ T 세포는 코디세핀 함량에 비례하여 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 종양을 형성한 마우스에서 코디세핀 고함유 밀리타리스 동충하초 JLM 0636 습식이 종양 유도 T 세포의 사이토카인 생산을 조절함으로써 Treg 세포의 생성과 기능을 억제하며, 이로 인하여 IFN-γ 발현 CD8+ T 세포의 증가로 이어져 궁극적으로 종양 성장을 저해하고 생존 기간을 연장한 것으로 해석할 수 있다. 본 연구에서는 코디세핀 고함유 밀리타리스 동충하초 JLM 0636 신품종의 항종양효과와 그 효과를 설명할 수 있는 종양면역반응 기전을 밝힐 수 있었다. 이는 항암화학요법, 방사선 치료 및 항암면역치료를 수행하는데 있어 JLM 0636 신품종을 아쥬번트로 사용할 수 있는 근거를 제공한다. 주요어 : 밀리타리스 동충하초 JML 0636, 코디세핀 고함유, 면역조절, 항종양효과, 종양면역반응, Treg 세포, IFN-γ 발현 CD8+ T 세포

Regulation of natural killer cell activity and inflammatory responses by mesenchymal stem cell secretome

고은희 Graduate School, Yonsei University 2024 국내박사

Mesenchymal stem cells (MSCs) exhibit immunomodulatory properties by secreting a diverse range of soluble factors collectively known as the secretome. This secretome has displayed therapeutic potential not only in autoimmune diseases but also in various other medical conditions. Despite this, the specific key factors within the MSC secretome and their precise mechanisms of action on immune cells remain incompletely understood. While most in vitro experiments use various types of immune cells, studies specifically focusing on natural killer (NK) cells are limited and have yielded inconsistent results. NK cells play a crucial role in directly killing target cells, such as cancer or virus-infected cells, and supporting other immune cells. However, abnormalities in NK cell number and function are observed in autoimmune environments, and the exact cause or its implication in disease progression remain unclear. This study has a dual purpose. First, to elucidate the impact and mechanisms of action of the adipose tissue-derived stem cell (ADSC) secretome on NK cell activity. Second, to analyze the characteristics of NK cells in lupus nephritis (LN), a common complication of systemic lupus erythematosus (SLE), an autoimmune disease, and investigate the in vivo changes and inflammatory regulation mechanisms due to ADSC secretome administration. In Chapter 1, based on previously published data in Stem Cell Research & Therapy (November 2023), we conducted in vitro experiments utilizing human-derived NK cells and observed that the ADSC secretome selectively inhibited effector functions of NK cells induced by IL-2 while maintaining normal proliferation. This effect was associated with a decrease in the expression of NK cell surface activating receptors (NKG2D, NKp30, NKp46) and IL-2 receptors (CD25, CD132), along with an increase in the expression of the inhibitory receptor CD96. Intracellularly, the ADSC secretome upregulated the negative regulators CIS and DUSP4, thereby interfering with the IL-2 signaling pathway in NK cells. In Chapter 2, through ex vivo experiments utilizing mouse splenic NK cells, we observed that their activity and receptor expressions closely resembled those of human NK cells. Furthermore, upon employing NZB/W F1 mice with lupus nephritis, we observed infiltration of their NK cells into the target organ, the kidney, albeit displaying an exhaustion phenotype with dysfunction. While NK cells may paly a protective role in the lupus environment by eliminating autoreactive immune cells, their function appears impared due to prolonged inflammation over time. Moreover, the administration of the ADSC secretome mitigated the inflammatory response and preserved renal structure and function. This occurred as the ADSC secretome reduced the abundance of inflammatory immune cells in both the spleen and kidneys, and upregulated the suppressed regulatory function of NK cells, partially restoring the NK cell phenotype towards a normal state. In conclusion, the ADSC secretome selectively modulates NK cell activity by suppressing effector functions while maintaining cell proliferation when NK cells are transiently stimulated. Additionally, it induces the recovery of suppressed NK cell function by regulating the expression of surface receptors to a normal phenotype in chronic inflammation. Therefore, the MSC secretome holds the potential as an immune modulator, targeting inflammatory and autoimmune diseases mediated by NK cells. 중간엽줄기세포(MSCs)는 면역조절 특성을 지니고 있으며, 분비단백체라고 불리는 이들의 수용성 물질들을 세포 밖으로 분비함으로써 자가면역질환에 치료 효과를 줄 수 있다. 그러나 분비단백체내 특정 주요 인자와 이들이 면역세포에 대해 작용하는 구체적인 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않다. 이를 밝히기 위한 시험관 내 (in vitro) 실험에는 대부분 면역세포가 사용되어 왔으나, 자연살해세포(NK 세포)를 사용한 실험은 매우 드물며, NK 세포를 활용한 일부 연구에서 조차 일치하지 않는 결과를 보여왔다. NK 세포는 암이나 감염 환경에서 암세포, 바이러스에 감염된 세포 등 표적 세포를 직접 죽이거나 다른 면역 세포들의 활성을 돕는 기능을 갖는다. 하지만 자가면역 환경에서는 NK 세포 수 및 기능 이상이 관찰되며, 명확한 원인이나 이로 인한 질병 진행 관여 측면에서는 여전히 불분명하다. 본 연구의 목적은 첫째, 지방 조직에서 유래한 중간엽줄기세포 분비단백체 (ADSC secretome)가 NK 세포 활성에 미치는 영향과 그 작용 기전을 밝히는 것에 있다. 둘째, 자가면역질환 중 하나인 루푸스 신염에서 NK 세포의 특성을 분석하고, ADSC 분비단백체 투여로 인한 생체 내 (in vivo) NK 세포의 변화와 염증 조절 기전을 밝히는 것에 있다. 1장에서는, 인간 유래 NK 세포를 이용한 시험관 내 실험에서 ADSC 분비단백체 처치 효과와 그 작용 기전을 밝혔다. 이 내용은 2023년 11월에 ‘Stem Cell Research & Therapy’ 학술지에 게재된 데이터를 기반하였다. ADSC 분비단백체는 IL-2에 의한 NK 세포의 정상적인 증식은 유지시키되 효과 기능만을 특이적으로 억제하였다. 이는 NK 세포 표면 활성 수용체 NKG2D, NKp30, NKp46 및 IL-2 수용체 CD25, CD132의 발현은 감소시키고, 억제 수용체 중 유일하게 CD96의 발현을 증가시킴으로써 NK 세포 활성 조절에 기여하는 것으로 여겨진다. NK 세포 내부에서는 ADSC 분비단백체가 음성 조절 단백질 CIS와 DUSP4의 발현을 증가시켜 IL-2의 신호 전달 경로 중 JAK1, JAK3의 인산화는 CIS가, STAT5, AKT의 인산화는 DUSP4가 저해함으로써 NK 세포의 활성을 특이적으로 억제할 것으로 여겨진다. 2장에서는, 먼저 실험용 생쥐 유래 NK 세포를 이용한 시험관 내 실험에서 ADSC 분비단백체 처치 효과를 확인하였다. 생쥐의 NK 세포 역시 ADSC 분비단백체에 의해 사람의 NK 세포와 동일한 변화를 나타냈다. 다음으로 자가면역질환인 루푸스 신염 동물모델 생쥐를 이용하여 루푸스 신염 환경의 NK 세포의 특성과 ADSC 분비단백체에 의한 생체 내 변화를 관찰하였다. 루푸스 신염의 NK 세포는 표적 장기인 신장으로 상당히 축적되었는데, 온전한 기능을 하지 못하는 탈진 표현형 (exhaustion phenotype)을 나타냈다. 이는 NK 세포가 자가반응성 세포들을 제거함으로써 루푸스 환경에서 조직 보호 기능을 수행하나, 오랜 기간 지속적인 염증 자극으로 인해 기능 장애가 나타난 것으로 여겨진다. 게다가 ADSC 분비단백체를 투여하면 염증 반응이 완화되고 신장 구조와 기능이 온전하게 유지되었는데, 이는 ADSC 분비단백체가 비장과 신장 내 염증 세포들의 증식을 억제하면서, 동시에 NK 세포를 정상 표현형으로 회복시킴으로써 억제되었던 NK 세포의 조절 기능을 상향조절하는 것으로 여겨진다. 결론적으로, ADSC 분비단백체는 NK 세포의 활성이 일시적으로 증가할 때에는 효과 기능을 특이적으로 억제하고, 만성 염증으로 인해 제 기능을 하지 못할 때에는 효과 기능을 향상시킴으로써 주변의 환경에 따라 면역 반응을 조절하는 것으로 여겨진다. 따라서 MSC 분비단백체는 NK 세포 기능 조절을 통해 염증성 및 자가면역질환을 표적으로 하는 면역조절제로서의 잠재력을 기대할 수 있다.