A Study on GITR Signaling and Innate Lymphoid Cell Activation in an Atopic Dermatitis-Like Animal Model

고병철 서울대학교 대학원 2024 국내석사

Atopic dermatitis, a chronic allergic skin disease, is a result of the intricate interplay between disrupted skin barrier function and immunological irregularities. While previous research has mainly focused on the DC-Th2 axis to investigate the pathogenesis of atopic dermatitis, recent studies have unveiled the potential pathogenic involvement of innate lymphoid cells (ILCs). ILCs, a newly recognized class of immune cells residing in various tissues, produce a range of cytokines in response to immune stimuli. Although ILCs are primarily regulated by alarmins such as IL-33, there is emerging evidence indicating that immune checkpoint receptor-ligand interactions also modulate ILC function. Therefore, exploring the role of immune checkpoint-related molecules in ILCs is crucial for comprehending the pathogenesis and exploring new treatment approaches. In this study, I established two mouse models of atopic dermatitis using MC903 and house dust mite (HDM) ointment to investigate changes and the roles of ILCs in atopic dermatitis. Within atopic dermatitis lesions, the number of ILCs increased and the function of the cells enhanced, concomitant with a significant upregulation of GITR expression. Consistent with prior research, GITR serves as a co-stimulatory molecule, and there was a positive correlation between the level of GITR expression and the production of IL-5 and IL-13 by ILCs. Furthermore, GITR expression was positively correlated with disease severity indicators in atopic dermatitis, such as epidermal thickness and mast cell counts. GITRL, the specific ligand of GITR, was also found to be increased within atopic dermatitis lesions. To further investigate the specific cell type interacting with GITR+ ILCs, GITRL+ cells from skin tissue were analyzed using flow cytometry. Notably, GITRL was predominantly expressed on keratinocytes, and the interaction between GITR and GITRL stimulated the effector functions of ILCs. Blocking GITR- GITRL interaction with an anti-GITRL antibody attenuated the progression of atopic dermatitis, confirming the vital role of GITR in activating ILCs within the skin of atopic dermatitis. This study suggests that ILCs express higher levels of GITR in atopic dermatitis, and their interaction with GITRL+ keratinocytes activates ILCs, exacerbating atopic dermatitis. In summary, the interaction between GITR+ ILCs and GITRL+ keratinocytes leads to ILC activation and the exacerbation of atopic dermatitis. These findings enhance our understanding of the roles of ILCs in atopic dermatitis and may contribute to the identification of novel therapeutic targets. Keywords: Innate lymphoid cell, Glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR), Immune checkpoint receptor, Atopic dermatitis Student Number: 2022-21396 아토피 피부염은 피부 장벽 기능의 이상과 면역학적 이상의 복잡한 상호작용의 결과로 발생함. 아토피 피부염의 병인에 대해 이전 연구들은 수지상세포와 보조 T 세포 사이의 상호작용에 중점을 두었으나 최근 연구에서 선천성 림프구세포 역시 잠재적인 역할을 수행할 수 있다는 증거가 제시됨. 선천성 림프구세포는 다양한 조직에 상주하는 새로운 종류의 면역 세포로, 면역 자극에 대한 반응으로 다양한 사이토카인을 생성함. 선천성 림프구세포는 주로 IL-33와 같은 알라민에 의해 조절되지만 면역 관문 수용체 - 리간드 상호작용도 기능을 조절할 수 있음이 밝혀지고 있음. 따라서 선천성 림프구세포에서 발현하는 면역 관문 연관 분자의 역할을 탐구하는 것은 아토피 피부염의 병인을 이해하고 새로운 치료 방법을 발견하는 데 도움이 될 수 있음. 본 연구에서는 MC903과 집먼지 진드기 추출액 연고를 사용하여 두 가지 아토피 피부염 마우스 모델을 유도하였고 아토피 피부염에서 선천성 림프구세포의 변화와 역할을 분석함. 아토피 피부염 병변에서는 선천성 림프구의 수가 증가하고 그 기능이 강화되며, 상당한 수준의 GITR 발현 증가를 확인함. GITR이 선천성 림프구세포를 활성화한다는 이전 연구 결과에 맞게, GITR 발현 수준과 선천성 림프구세포의 IL-5 및 IL-13 분비능 사이에 양의 상관관계가 있었음. 게다가 GITR 발현 수준은 피부 두께 및 피부 비만세포 수와 같은 아토피 피부염의 중증도 지표와 양의 상관관계를 보였음. GITR의 리간드인 GITRL도 역시 아토피 피부염 병변 내에서 증가하였음. GITR을 발현하는 선천성 림프구세포와 상호 작용하는 세포를 확인하기 위해 유세포 분석을 사용하여 피부 조직 내 GITRL 발현 세포를 분류함. GITRL은 주로 각질형성세포에서 발현되었으며, GITR과 GITRL의 상호 작용은 선천성 림프구세포의 사이토카인 분비능을 자 극하였음. 이러한 결과는 아토피 피부염의 피부에서 더 높은 수준의 GITR을 발현하는 선천성 림프구세포가 각질형성세포와의 상호작용을 통해 활성화되고 아토피 피부염을 악화시키는 것을 시사함. 본 연구자는 GITR을 발현하는 선천성 림프구세포와 GITRL을 발현하는 각질형성세포 간의 상호작용은 선천성 림프구세포의 활성화와 아토피 피부염의 악화로 이어짐을 확인하였음. 따라서 본 연구를 통하여 아토피 피부염에서 선천성 림프구세포의 역할에 대한 이해를 증진시킬 수 있으며, 더 나아가 새로운 치료 목표를 제공하는데 도움이 될 것임.

림프구성백혈병 환아의 혈청에서 RNase 작용의 조절에 관한 연구

이철호 한양대학교 대학원 1995 국내박사

활성화된 사람의 림프구에 대한 전임상 및 임상에 대한 연구

조성훈 차의과학대학교 대학원 2007 국내박사

This study has been undertaken to investigated the efffects of activated autologous lymphocytes to lymphoma and various cancer cell lines in the pre-clinical and clinical research. In the pre-clinical research, PBMC was cultured for 14 days obtained from peripheral blood of healthy volunteers and cancer patients. Composition of cultured lymphocyte was analyzed by flowcytometry method, and the effects of activated lymphocytes to cancer cell lines was analyzed by LDH release and calcein AM dyeing method using Terascan. Activated human lymphocytes were injected to a tail vein of 6 weeks BALB/c nude mouse induced grafts by lymphoma cell, and the effects were investigated. For the clinical research, the blood was obtained from clinical trial volunteer lymphoma patients in Chonnam National University Hwasun Hospital (CNUHH). PBMC was cultured for 14 days, and activated autologous lymphocytes injected to patient vein in CNUHH, the effects of injections of autologous activated lymphocyte were investigated by CT. Cell composition was analyzed by flowcymety , LDH release method and Terascan(Calceim AM fluorescent substance using microscope) were used to analyze cytotoxocity of activated autologous lymphocytes to cancer cell lines. In animal experiments, size of graft and survival of mouse hans been investigated. The present results as follows, 1. In this culture method, PBMC of normal human and patient were separated and cultured, activated autologous NK cells were 27±4.08%, NKT cells were 35±4.37%, T cells were 39±4.05%. 2. NK cells tended to increased in numbers and T cells tended to decreasing in daily culture of PBMC. 3. As the cultured cell composition, cytotoxicity to K562 cell (Leukemia cell line) were the highest value at 24±3.2/38±2.4% NK/NKT cell composition and 42±3.1% T cell composition. 4. Comparative study was done to investigate the cytotoxicity to various cancer cell lines, composition of NK/NKT cell were 69±2.9/19±3.1%, T cell wes 10±1.1% (A), and NK/NKT cell were 24±3.2/38± 2.4%, T cell was 42±3.1% (B). Each formula reacted with cancer cells, and cytotoxicity was the best result in 40:1 ratio (Effector:Target). B experimental groups were more cytoxicity than A experimental groups, and the results showed different cytotoxicity depends on tumor cells. 5. Different results of cytoxicity efficiency has been shown against Korean lung cancer cell line. As distribution of lymphocytes composition was suitable, cytoxicities to lung cancer cell lines were high. 6. The survivors and the rate of reduction of size of tumor grafts of nude mouse group treatment with activated lymphocyte was higher than that of the group without treatment with activated lymphocyte. 7. Before the clinical trial, patients’ size and number of tumor grafts had been increasing. After activated autologous lymphocytes injection to patient, the size and number of tumorous edema has been reduced or disappeared. And there are not pathological changes in patients non-treated and after 6 times treated with autologous activated lymphocyte. Considering overall results , it may be suggested that the effects to cancer cell lines are different according to composition of NK cells, NKT cells and T cells in activated lymphocytes. In animal experimentation, though hard to calculate analysis of survivals but size and number of tumor grafts in mouse effectively decrease. In clinical trial, activated autologous lymphocytes are effectively decreasing tumor size and numbers, and are increasing of patients' life. This method has very little known side effects not like chemotherapy or radiotherapy, so it improves patients' quality of life during cancer therapy. Activated autologous lymphocytes is recommended for cancer therapy. Key Words: activated autologous lymphocytes, Natural Killer cell, Cytotoxicity, Cancer therapy 지난 30년동안 여러 많은 연구자들은 암을 극복하기 위해 노력을 기울여 왔다. 그러나 현재 암을 치유하기위한 방법으로는 수술이외에 큰 효과를 나타내지 못하는 것으로 알려져 있다. 이러한 수술외 방법에는 화학요법, 방사선요법등이 있지만, 이들 치료법은 부작용이 심각하여 치료의 효과적인 방법이 되지 않을 수도 있다. 최근 이러한 폐해를 줄이고 환자의 더 나은 삶의 질을 부여하기 위한 면역세포치료법이 대두되어 많은 발전이 이루어지고 있는 실정이다. 본 연구는 림프종 및 각종 암종에 대한 자기 활성화 림프구의 영향을 전임상 및 임상 연구를 통해 수행하였다. 전임상의 연구를 위하여 정상 또는 암환자로 부터 혈액을 공여받아 14일간 배양하여 배양된 세포의 성상을 확인하고, 암세포에 대한 활성화된 림프구의 영향을 조사하고, 림프종세포로 종괴를 유발시킨 6주령의 BALB/c 누드마우스에 사람의 활성화된 림프구를 정맥투여하여 그 영향을 조사하였고, 임상시험을 위해서 임상시험중인 림프종 환자의 혈액을 공여받아 배양하고, 14일후 전남대 화순병원을 통해 치료제를 6회 정맥 투여하고 CT를 통해 그 영향을 조사하였다. 세포의 성상을 조사하기 위해서 Flow cytometry로 분석하였으며, 암세포에 대한 자기활성화 림프구의 독성효과는 LDH release법과 Calceim AM 형광물질을 이용하여 TeraScan으로 분석하였다. 동물실험에서는 종괴의 크기와 마우스의 생존율을 조사하였다. 연구결과는 다음과 같다. 1. 본 실험의 배양법으로 정상인과 암환자의 혈액내 PBMC를 분리하여 배양한 결과 활성화 된 림프구의 성상은 Natural Killer(NK)세포인 경우 27± 4.08%, NKT세포의 경우 35± 4.4%, T세포의 경우 39± 4.1% 이었다. 2. 혈액공여자의 PBMC를 분리하여 배양하여 일별조사하면 NK세포의 배양된 세포내 분량이 점차 증가하는 경향을 보이며, T세포의 경우 점차 줄어드는 현상을 보였다. 3. 배양된 세포의 조성에 따라 K562(Leukemia cell line)세포에 대한 세포독성효과는 NK/NKT세포의 분량이 24±3.2/38±2.4%, T세포의 분량이 42±3.1% 일때 최고값을 나타내었다. 4. NK/NKT세포의 분량이 69±2.9/19±3.1%, T세포의 분량이 10±1.1%의 림프구(A)와 NK/NKT세포의 분량이 24±3.2/38±2.4%, T세포의 분량이 42±3.1%의 활성화된 림프구(B)가 기타 암세포에 미치는 영향을 조사한 결과, 각각 40:1의 비율로 반응시켰을 때 암세포에 대한 세포독성효과가 높음을 보였고 B실험군의 경우 A의 실험군의 각종 암세포에 대한 세포독성효과 보다 크게 나타났으나, 암세포의 종류에 따라 그 효과는 다르게 나타남을 보였다. 5. 한국의 폐암세포주에 대한 자기 활성화림프구의 세포독성효과는 세포주에 따라 각기 다른 양상을 보이고 NK세포의 분량이 많을 수록 높은 세포독성효과를 보였다. 6. 림프종의 종괴를 유발시킨 마우스에 자기활성화림프구를 투여하면 종괴의 크기가 줄어들며, 그 생존율에도 영향을 준다. 7. 림프종 환자의 혈액을 활성화시키고 임상시험의 과정에 따라 투여한 결과, 투여 전에 크기가 커지고 종괴의 수가 증가하던 환자에서 종괴의 크기가 줄어들고 또한 사라짐을 보였다. 또한 치료를 위해 자기 활성화 림프구의 투여전과 6회 투여후의 환자에서의 병리학적 변화는 없었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 자기 활성화림프구 세포치료제는 NK세포와 NKT세포 그리고 T세포가 분량에 따라, 그 효과는 다르며, 효과의 증가를 위한 치료제 내의 세포 분량이 적정 조성으로 배양되어야 하며, 그리고 각종 암세포에 대하여 세포독성효과도 증가함을 보인다. 동물실험의 경우 활성화된 NK세포로 인하여 생존율 분석의 어려운 점을 감안하여 보더라도 종괴의 크기 감소나 생존율에 큰 영향을 주며, 임상시험에서도 자기활성화림프구는 환자의 QOL(Quality Of Life)의 향상과 종괴의 감소 및 생존율의 증가에 큰 영향을 미치며, 또한 항암제 및 방사선치료등으로 유발되는 심각한 부작용에서 벗어나 더 나은 암치료법으로서 적용이 가능하다.

급성백혈병에서 조혈모세포이식 전후 조혈모세포와 미세환경 및 림프구의 변화 : 재발군과 비재발군의 비교분석

정재우 울산대학교 대학원 2012 국내박사

소아 급성림프구성백혈병과 고형종양 환아에서 항암 치료 종료 후 림프구의 변화

이정복 가천의과대학교 대학원 2006 국내석사

Purpose: After the chemotherapy of neoplasms is completed, a change of immunologic function is accompanied. Subsequently, the secondary infection follows frequently and sometimes causes the mortality. The change of immunologic function after completion of chemotherapy is influenced by the tumor itself and the modality of treatment especially chemotherapeutic agents. We analyzed the change of lymphocyte according to the time sequence after completion of treatment to investigate the immunologic state in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) and solid tumors following the completion of therapy. Methods: Eight cases of ALL and 6 cases of solid tumors were eligible for the evaluation of immunologic function. They were completed chemotherapy and evaluated the total lymphocyte count and subgroups of lymphocyte for every 6 months. Results: 1) As time passed after the completion of chemotherapy, the recovery of total lymphocytes count to normal range was statistically high in all ALL and solid tumors (p<0.0001). However, there was no difference between ALL and solid tumors in the recovery of total lymphocyte count. 2) In the subtype of lymphocyte, total B lymphocyte count and T lymphocyte were recovered statistically high in all ALL and solid tumors with the time passage after the completion of chemotherapy (p>0.016, p>0.046, respectively). However, there was no difference between ALL and solid tumors in the recovery of total B and T lymphocyte count. 3) The recovery of the total NK cell count and the T4/T8 ratio were not significantly high with the time passage after the completion of chemotherapy (p>0.27, p>0.11, respectively). In addition, there was no difference between ALL and solid tumors in the recovery of the total NK cell count and the T4/T8 ratio. Conclusion: As time passed after the completion of chemotherapy, the recovery of total lymphocytes count and the subtype of B and T lymphocyte to normal range was statistically high in all ALL and solid tumors. Although the recovery of the NK cell count and the T4/T8 ratio was not significantly high, generally the immune function was recovered with the time passage after the completion of chemotherapy until 24 months. Therefore, it would be advisable to be cautious infection after the completion of chemotherapy until 24 months. 목적: 혈액 종양 환자에서 종양치료 종료 후 면역 기능의 변화가 수반되며, 이에 따라 이차적인 감염이 문제가 된다. 치료 종료 후 면역기능의 변화는 일차적으로 원발 종양에 따라 다르며, 이차적으로는 사용한 화학요법 제제 및 치료 방법에 따라 다르다. 저자들은 면역기능의 중요한 역할을 하는 림프구 의 수와 아형의 변화에 대해 치료가 종료된 혈액계 종양인 급성림프구성백혈병과 고형종양 환자를 대상으로 조사하여 면역기능의 변화를 알아보고자 한다. 방법: 1998년 12월부터 2003년 12월까지 가천의과대학교 길병원 소아과에서 급성림프구성백혈병과 기타 고형종양으로 진단 받고 치료 종료 상태에 있으며 추적 관찰이 가능했던 급성 림프구성 백혈병 환아 8명, 고형 종양 환아 6명을 대상으로 치료 종료 후 림프구에 대한 검사를 6개월마다 시행하여 분석하였다. 결과: 1) 전체 대상의 경우 절대 림프구수는 치료 종료 후 기간이 증가함에 따라 절대 림프구수가 정상으로 회복되는 경우가 통계학적으로 의미 있게 많았다(p<0.0001). 그러나 급성림프구성백혈병과 고형종양에서 절대 림프구수가 정상이 되는 경우는 검사 시기에 상관 없이 두 군 사이에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다. 2) B 림프구수는 전체 대상의 경우 정상으로 회복되는 경우가 치료 종료 후 기간이 증가함에 따라 통계학적으로 의미 있게 많았다(p>0.016). 그러나 급성림프구성백혈병과 고형종양에서 B 림프구수가 정상이 되는 경우는 검사 시기에 상관 없이 두 군 사이에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다. 3) T 림프구수는 전체 대상의 경우 정상으로 회복되는 경우가 치료 종료 후 기간이 증가함에 따라 통계학적으로 의미 있게 많았다(p>0.046). 그러나 급성림프구성백혈병과 고형종양에서 T 림프구수가 정상이 되는 경우는 검사 시기에 상관 없이 두 군 사이에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다. 4) NK 세포는 전체 대상의 경우 치료 종료 후 기간이 증가함에 따라 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다(p>0.27). 또한 급성림프구성백혈병과 고형종양에서 NK 세포수가 정상이 되는 경우는 검사 시기에 상관 없이 두 군 사이에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다. 6) T4/T8비는 전체 대상의 경우 치료 종료 후 정상으로 회복되는 경우가 치료 종료 후 기간이 증가함에 따라 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다(p>0.11). 또한 급성림프구성백혈병과 고형종양에서 T4/T8비가 정상이 되는 경우는 검사 시기에 상관 없이 두 군 사이에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다. 결론: 종양 치료 종료 후 시간이 지남에 따라 절대 림프구수 및 여러 아형이 정상으로 회복되는 경우가 많아 치료 종료 후 24개월까지는 면역 기능이 시간에 비례하여 정상화되었다. 종양 치료 종료 후 24개월까지는 이차적인 감염을 주의하는 것이 중요할 것으로 생각된다. 한편 혈액계 종양과 고형 종양간의 종양 치료 후 면역 기능이 회복되는 양상에는 차이가 없었다.

편도 종자중심의 B 림프구 분석

김대진 중앙대학교 2000 국내석사

동충하초 투여가 운동시 면역체계에 미치는 영향

김주영 연세대학교 대학원 2003 국내석사

본 연구의 목적은 장기간(6주)의 동충하초 투여가 1회성 운동시 운동수행력 및 적응성 면역반응(CD4 T 림프구, CD8 T 림프구, CD4 T 림프구/CD8 T 림프구 비율)과 항산화 방어 능력 변화(ROS) 뿐 아니라 스트레스 호르몬(cortisol)의 활성 등에 미치는 효과를 과학적으로 검증하는데 있었다. 본 연구에 참여한 피험자들로는 건강한 10명의 남자 대학생을 대상으로 하였으며, 각각 동충하초 투여군 5명(S, n=5)과 위약 투여군 5명(P, n=5)으로 구분하여 6주간의 동충하초 투여 전과 후, 각각 3가지 형태의 1회성 운동(VO_(2)max, VO_(2)max 85%, 그리고 1-RM 85% 테스트)에 참여하였다. 운동수행력의 경우, 모든 실험조건에 있어서 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나(p>.05), 동충하초 투여군의 투여후 VO_(2)max 85% 테스트시 운동수행력이 투여전에 비하여 4.7% 정도 증가한 것으로 나타났다. 동충하초 투여군의 투여후 적응성 면역 세포 중 CD4 T 림프구와 CD8 T 림프구는 투여전에 비하여 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<.05), CD4 T 림프구 /CD8 T 림프구 비율 역시 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(p>.05). 동충하초 투여군의 투여후 1회성 운동시 나타나는 변화는 면역세포들(CD4 T 림프구, CD8 T 림프구, 그리고 CD4 T 림프구/CD8 T 림프구 비율) 사이에서 일정한 경향을 나타내지는 않았다. 즉, 동충하초 투여군의 경우 투여후 1회성 운동 직후에 혈중 CD4 T 림프구는 약간의 변화를 나타내었지만, CD8 T 림프구의 경우 현저한 증가를 보였다. 그러나 동충하초 투여군의 투여후 1회성 운동에 따른 면역세포들 사이의 변화는 위약 투여군의 투여후와 비교하여 유의한 차이를 나타내지는 않았다(p>.05). 또한, 본 연구에서 면역반응은 동충하초 투여군의 투여후 VO2max 85% 테스트의 운동종료시에 비하여 1-RM 85% 테스트의 운동종료시에서 보다 현저한 변화를 나타내었으며, CD4 T 림프구의 경우 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (p<.05). 동충하초 투여군의 투여후 활성산소(ROS) 생성은 투여전에 비하여 모든 측정시점시 감소하였으며, 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다(p<.05). 또한, 동충하초 투여군의 투여후 1회성 운동중 활성산소는 증가하는 경향을 보였고 운동종료후 회복에 따라서 감소하였으며, 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다(p<.05) 동충하초 투여군의 투여후 혈중 코티솔(cortisol) 수준 역시 투여전에 비하여 감소하였으며, 특히 1-RM 85% 테스트시 투여후 회복시에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<.05). 면역세포에서의 반응과 유사하게, 동충하초 투여군의 투여후 VO_(2)max 85% 테스트와 같은 유산소성 운동에 비하여 근력운동인 1-RM 85% 테스트의 경우 운동종료시 혈중 코티솔은 보다 현저한 반응을 보였으나, 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(p>.05). 본 연구의 결과를 종합하여 볼 때, 동충하초 투여는 운동수행력에 있어서 유의한 차이는 나타내지 않았으나, 사람에게 있어서 면역세포 기능에 유용한 효과를 가져왔으며, 또한 항산화체계와 내분비계의 기능을 향상시켰다는 것을 알 수 있었다. The purpose of this study was to investigate the six weeks of cordyceps militaris supplementation effects on exercise performance, adaptive immune response (CD4 T lymphocyte, CD8 T lymphocyte, and CD4 T lymphocyte/CD8 T lymphocyte ratio), antioxidant defensive capacity changing (ROS), and stress hormone response (cortisol). 10 healthy male university students were recruited in this study. All subjects were divided into two experimental groups; cordyceps militaris supplementation group (S, n=5) and placebo group (P, n=5). All the subjects in each groups participated in three different exercise trials: VO_(2)max, VO_(2)max 85%, and 1-RM 85% test. There were no significant cordyceps militaris supplementation effects on exercise performance in all experimental trials (p>.05). However, following cordyceps militaris supplementation, there was a 4.7% increase in exercise performance at VO_(2)max 85% test condition. In the case of the adaptive immune response after cordyceps militaris supplementation, there was a significant increase in CD4 T lymphocyte (p<.05) and CD8 T lymphocyte (p<.05) compared to pre-treatment trials. After cordyceps militaris supplementation, it was also showed a similar increase in CD4 T lymphocyte/CD8 lymphocyte ratio compared to pre-treatment trials, however it did not show statistical significant increase due to a large variation in experimental data (p>.05). In cordyceps militaris supplementation group, compared to pre-supplmentation, six weeks of supplementation showed a consistent increase in immune responses. Whereas, there was no consistent pattern on immune cells (CD4 T lymphocyte, CD8 T lymphocyte, and CD4 T lymphocyte/CD8 T lymphocyte ratio) response after exercise. For instance, there was only small changes in CD4 T lymphocyte levels but a sharp increase in CD8 T lymphocyte levels immediately after exercise in cordyceps militaris supplementation group. But, there was no significant difference in immune cell response between cordyceps militaris supplementation group and placebo group after exercise. The noble finding from this study was that 1-RM 85% test exerts more immune cells response than VO2max 85% exercise test in cordyceps militaris supplementation group. Especially, there was a significant difference in CD4 T lymphocyte(p<.05). Following 6 weeks of cordyceps militaris supplementation, there was significant ROS activity decrease occurred at all time points compared to pre-treatment trails(p<.05). The ROS activity was significantly increased during exercise trials after cordyceps militaris supplementation, however it showed that a significant drop after 30 min recovery period(p<.05). The level of cortisol was also dropped following 6 weeks of cordyceps militaris supplementation, however statistical significance was reached only at recovery following 1-RM 85% exercise test(p<.05). Similar with the response of immune cells, the response in cortisol was more notable following strength exercise (i.e. 1-RM 85% test) than aerobic exercise (i.e. VO2max 85% test) in cordyceps militaris supplementation group. However, there was no significant blood cortisol level differences between 1-RM 85% and VO_(2)max 85% test(p>.05). In conclusion, there was no significant exercise performance difference in all experimental trials. However, cordyceps militaris supplementation exerts a positive effect on imune cell changing, antioxidant capacity, and endocrine systems function.

실험적 낭창성신염의 발병과정에서 T 림프구의 역할

이경미 梨花女子大學校 2001 국내박사

목적: 낭창성 신염(lupus nephritis, LN)은 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE)의 질병 경과에 큰 영향을 미치는 중요한 신장 병변으로 낭창성 신염은 선천적 면역 이상과 바이러스 감염 등 여러 유전적, 환경적 복합요인에 의해 발현되는 질환이다. 본 연구는 Pristane으로 유도된 낭창성 신염 동물모델에서 낭창성 신염의 발병기전에 있어서 면역반응의 중심인 T 림프구의 역할을 규명하고자 한다 방법: C57BL/6와 BALB/c 생쥐에 pristane(2,6,10,14-tetramethyl-pentadecane)을 복강내 주사하여 낭창성 신염을 유도하였다. 실험군으로는 성숙 생쥐의 흉선적출술과 항CD4 항체, 항CD8 항체 및 항Thy-1 항체 등을 사용하여 말초 T 림프구를 제거한 군(이하 항체 투여군), 신생 생쥐의 흉선적출술로 T 림프구를 제거한 군(이하 신생쥐 흉선적출군), T cell receptor(TCR)- 쇄 결핍생쥐를 이용한 군(이하 TCR 결핍 생쥐군), CTLA-4-Ig를 이용하여 T 림프구의 활성화과정을 방해한 군(이하 CTLA-4-Ig 투여군)등 4군으로 하였으며, 양성 대조군으로는 T 림프구에 대한 처치 없이 pristane 단독 투여(이하 pristane 투여군)하였고, 음성 대조군으로는 pristane 대신 phosphate buffered saline (PBS)(이하 PBS 대조군)을 투여하였다. 각각의 군은 7-10마리의 생쥐를 사용하였다. 낭창성 신염의 평가는 IgG 형태의 항dsDNA 항체의 양을 측정하고, 신장조직의 광학 및 전자현미경 소견을 관찰하여 염증의 정도를 분석하였고, 신장조직의 면역조직형광법으로 사구체내의 면역복합체의 침착을 측정하였다. 이외에 말초 림프절, 간, 및 비장의 면역세포의 표현형 변화를 유세포분석기(flowcytometry)를 이용하여 분석하였다. 결과: Pristane 투여군(양성대조군)에서 PBS 대조군에 비해 항dsDNA 항체의 증가가 관찰되었고 (p<0.01), 항체가는 3개월 이후부터 지속적으로 증가하여 6개월 후 가장 큰 차이를 보였다. 이 시기의 pristane 투여군 생쥐 간 조직의 면역조절 T 림프구인 NKT 림프구(CD3+NK1.1+)가 PBS 대조군에 비해 감소되어 있었다 (5±0.6 vs. 11±1.4%; p<0.05). T 림프구를 제거하거나 활성화를 억제한 후 pristane을 투여한 군에서의 자가항체는 PBS 대조군에 비해 증가되었으나 pristine 투여군에 비해 감소하였다(p<0.05). 면역복합체의 사구체내 침착은 pristine 투여군에서 강하게 관찰되었으나 (3~4+), PBS 대조군에서는 관찰되지 않았다. 면역 복합체의 침착정도는 CTLA-4-Ig 투여군에서 감소하였으며 (1~2+), 항체 투여군에서 감소정도가 더 명확하였다(0~1+). 신생쥐 흉선적출군과 TCR 결핍생쥐군의 경우 항dsDNA 항체와, 면역복합체 침착이 pristane 투여군에 비해 감소되었으며, 말초내 성숙 T 림프구가 현저히 감소해 있었다 결론: Pristane으로 유도된 실험적 낭창성 신염(LN)의 발생에 면역조절 T 림프구의 감소가 관여하며 활성화된 T 림프구의 제거로 질병의 발생이 억제됨을 확인하였다. 자가반응 T 림프구와 면역조절 T 림프구의 균형이 질환발생에 중요한 인자로 작용할 것으로 생각되며 향후 이에 대한 보다 체계적인 연구가 필요하다. Lupus Nephritis(LN) is a chronic autoimmune disease characterized by the development of systemic autoimmunity and the production of autoantibodies. Although the etiologic agents that initiate LN are generally not defined, it is suggested that dysregulation of T cell function may be an initiating and/or maintenance mechanism of the autoimmune state. To elucidate the possible pathogenic roles of T cells, we have examined the development of murine LN by controlling T cell population and function. Peripheral T lymphocytes are sucessfuly eliminated with thymectomy and depleting antibodies which was shown by flowcytometry. LN was introduced by intraperitoneal injection of pristane (2,6,10,14- tetramethyl pentadecane) to BABL/c and C57BL/6 (B6) mice. Electron microscopy showed irregular thickening of the glomerular basement membrane, increased mesangial cells and mesangeal matrix, epitherial foot process effacement, and subepitherial dense deposits in pristane treated mouse. Comparative study of phenotype of T cells using early activating markers showed no significant differences between groups. Anti-dsDNA Ab titer decreased in mature T cell-depleted mice (adult thymectomized + anti CD3 Ab) and in costimulatory signal blocked mice (CTLA4-Ig treated) after pristane injection than in pristane alone treated mice. Glomerular immune complex deposition (ICD) was not noticeable in control mice but was evident in pristane treated mice (3+~4+). The intensities of ICD were attenuated significantly in CTLA4-Ig treated (1+~2+) and T cell depleted (0~1+) mice. NKT cells (CD3+NK1.1+) in liver mononuclear cell decreased in pristane treated mice than in contols (5+0.6 vs. 11+1.4%; p<0.05) . Severity of LN (Ab titer and ICD) in neonatally thymectomized mice (BALB/c) and TCR- KO mice (B6) after pristane injection lessened than in control mice. Also the mature T cells in peripheral blood decreased in these mice. Our results suggest that the development of LN would be associated wth the decrease of regulatory T cells and prevented by removal of activated T cells. Balance between regulatory and autoreactive T cells would have a pivotal role in the development of LN.

인간 제대혈 림프구 체외 증폭시 조절 T 림프구의 변화 양상 및 특징

정의 울산대학교 2006 국내박사

목적: 조절 T 림프구는 CD4와 CD25를 표현하는 특정 T 림프구를 일컬으며, 자아에 대한 면역반응을 억제하는 역할을 하고 있다. 성인에서도 림프구는 그 자체가 실험실 배양 및 증폭이 까다롭다는 점 때문에 연구에 많은 제한을 받고 있지만 제대혈에서 분리해 낸 림프구, 특히 T 림프구는 적절한 배양 환경만 확립된다면 다양한 기능을 가진 여러 세포로 분화할 수 있고, 자기 복제능이 탁월하다. 본 연구는 만삭 산모와 정상 성인 여성의 말초 혈액, 그리고 제대혈내의 조절 T 림프구의 분포에 차이가 있는지 확인함으로써 산모와 태아간 면역 관용상태에 조절 T 림프구가 관여하고 있는지 알아보고, 또한 제대혈 림프구의 체외 증식이 조절 T 림프구의 분포에 어떤 영향을 미칠 것인가를 확인하여 조절 T 림프구를 다량으로 획득할 수 있는 방법을 확립해 장차 세포치료 등 임상적 이용을 앞당기고자 하였다. 대상 및 방법: 각각 10 명의 비임신 성인 여성과 만삭 산모의 말초혈액 및 제대혈에 항 CD3 항체, 항 CD4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD152 항체를 첨가한 후 FACSort flow cytometry를 이용하여 세포 표식자 분석을 시행하였다. 제대혈은 Ficoll-Hypaque 밀도 기울기 원심 분리법으로 단핵구 세포를 분리하여 항 CD3 항체와 IL-2를 이용한 체외증폭을 시행한 후, 배양 제 0, 4, 11, 21일에 세포 표식자 분석과 FoxP3의 발현도를 측정하였다. 또한 MACSTM kit를 이용하여 CD25-와 CD25+ T 림프구를 분리하여 CD25+ 림프구의 조절 T 림프구 여부를 FoxP3의 발현을 통해 확인하였다. 결과: 제대혈내의 CD4+CD25++ T 림프구는 정상 성인 여성과 산모의 말초혈액보다 높은 분포를 나타냈으며, 만삭 산모는 비임신 여성보다 CD4+CD25++ T 림프구가 유의하게 적었다 (p <0.05). 제대혈 림프구를 체외 배양했을 때 CD4+CD25++ 그리고 CD152+ T 림프구의 비율은 4일째 현저하게 높아지고 11일째 이후로 감소하는 소견을 보였고 (p <0.05), 이는 FoxP3의 발현 정도와도 일치한 결과를 보였다. 분리된 CD4+CD25+ T 림프구는 CD4+CD25- T 림프구에 비해 FoxP3 발현량이 의미있게 높았다 (p <0.05). 결론: 제대혈은 성인의 말초혈액보다 CD4+CD25++ 조절 T 림프구의 비율이 높으며, 체외 증폭하였을 때 조절 T 림프구의 비율이 4일째까지 증가하다가 이후로 감소되는 소견을 보인다. 이 결과는 향후 조절 T 림프구의 임상적 이용에 유용한 자료로 사용될 수 있다고 사료된다. 중심단어: 조절 T 림프구, 임신, 제대혈, 체외 증폭, CD25, FoxP3 Objectives: Regulatory T cells, which expressing CD4 and CD25, have a crucial role in suppressing immune systems to self-antigens and preventing autoimmune diseases. This study aims to evaluate the role of regulatory T cells in maternal tolerance to the fetus by comparing the proportion of regulatory T cells in peripheral blood of pregnant and non-pregnant women with those in umbilical cord blood. Also we analyze the changes of proportions of regulatory T cells of umbilical cord blood according to ex vivo expansion. Materials and methods: An immunophenotypic study on 10 peripheral blood of pregnant and non-pregnant women and 10 cord blood was performed by means of FACSort flow cytometry using anti-CD4, anti-CD25 and anti-CD152 antibodies. Fresh cord blood mononuclear cells (MNCs) were isolated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. The MNCs were cultured in anti-CD3 Ab-coated flasks for 4 days. The cells were then transferred to non-coated flasks with IL-2 175 U/ml and were cultured for another 17 days. The expression of CD4, CD25, CD152 and FoxP3 PCR were analyzed in accordance with days in culture. We also performed FoxP3 PCR in isolated CD25+ and CD25- T cells using MACSTM kit. Results: Umbilical cord blood had a higher proportion of CD4+CD25++ regulatory T cells than adults, and term-pregnant women had a lower proportion than non-pregnant women (p <0.05). After ex vivo expansion in anti-CD3 Ab coated flask with IL-2, we observed a significantly increased expression of CD4, CD25, CD152 at 4th day after culture and decrease thereafter. The result was the same as the expression of FoxP3 PCR. Conclusion: Umbilical cord blood contained a high proportion of CD4+CD25++ regulatory T cells and regulatory T cells increased on culture day 4 and declined thereafter. Umbilical cord blood may serve as a readily available source of regulatory T cells for immunotherapy. Key words : Regulatory T cell, Pregnancy, Umbilical cord blood, Ex vivo expansion, CD25, FoxP3

원발성 및 재발성 난소암 환자의 복수 내 림프구 체외증폭 시 CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) 조절 T 림프구 분포의 비교

이신화 울산대학교 일반대학원 2007 국내석사

목적: 암세포는 세포성장을 조절하는 기전의 파괴로 인하여 발생하며 적절한 면역반응의 실패로 암세포가 제거되지 못할 때 과도한 증식을 하게 된다. 암세포의 생성과 억제에 관여하는 인체의 면역반응에는 항종양 효과를 나타내는 체액성 항체, 자연 살해 세포 (natural killer cell, NK cell), 활성화된 거대세포, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte), 수지상 세포(dendritic cell) 등이 있으며, 다양한 작용으로 암세포들에 대한 면역반응을 일으키고 있다. 이때 암세포에 대한 면역반응을 주도하는 세포매개성 면역체계가 억제되고, 체액성 면역체계가 활성화되는 불균형 상태가 발생하면서 암세포가 활성화된다. 최근 조절 T 림프구(regulatory T lymphocyte)는 암세포에 대한 면역관용(immune tolerance)을 일으켜 특정 항원에 대한 T 림프구의 작용을 감소 또는 상실시킴으로써 암세포의 빠른 성장, 국소 침입과 혈행성 전이에 관여하는 것으로 발표되었다. 많은 연구들은 난소암 환자의 복수에서 채취한 TAL(tumor associated lymphocytes)과 암 조직 자체에서 획득한 TIL(tumor infiltrating lymphocytes)을 IL-2(interleukin-2)를 이용하여 증폭시킴으로써 입양면역치료(adoptive immunotherapy)를 위한 T 림프구를 개발하여왔다. 그러나 아직까지 IL-2를 이용한 체외 증폭이 조절 T 림프구의 증식과 면역 억제 기전에 어떠한 변화를 일으키는지 명확히 밝혀진 바가 없다. 이 연구의 목적은 난소암 환자의 복수 내 림프구를 체외증폭 하였을 경우, 조절 T 림프구의 분포의 변화를 파악하고, 이러한 변화가 원발성 환자들과 재발성 환자들에서 어떠한 차이를 보이는지를 확인함으로써 향후 입양면역치료의 발전을 위한 정보를 제공하는 것이다. 대상 및 방법: 2005년 1월부터 2006년 8월까지 서울아산병원에 입원하였던 19명의 치료를 시행 받지 않은 진단 초기의 원발성 난소암 환자와 7명의 일차치료 후 재발한 난소암 환자들의 복수에서 Ficoll-Hypaque 밀도 기울기 원심 분리법으로 림프구를 분리한 후 항CD3 항체, 항 CD4 항체, 항 CD8 항체, 항 CD16/56 항체, 항 CD25 항체, 항 FoxP3 항체로 flow cytometry를 이용하여 세포 표식자 분석을 시행하였다. 또한 분리된 림프구는 IL-2를 이용하여 체외증폭을 시행하고 배양 2~3주 사이에 같은 방법으로 세포 표식자 분석을 시행하였다. 결과: 복수내의 림프구 체외증폭 결과 진단 초기의 환자들보다 재발한 환자들에서 세포의 증가 폭이 유의하게 더 컸다(p <0.05). 각 림프구의 분포를 살펴보면, CD4^(+) T 림프구가 증가하고(p <0.05), CD8^(+) T 림프구는 감소하였으며 (p <0.05), CD3^(-)CD16^(+)56^(+) NK cell의 경우 유의한 차이는 없었다. 그리고 이러한 양상이 재발한 환자들의 경우에서 더욱 두드러지기는 하였으나 통계적 유의성은 없었다(p =0.254). 한편, CD4^(+) T 림프구 내에서 CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) 조절 T 림프구가 차지하는 비율이 체외배양 후 유의하게 증가하였으며 (p <0.05), 재발한 환자들의 경우에서 증가 폭이 더 컸다(p <0.05). 결론: 이상의 결과로 난소암 환자에서, 특히 재발한 환자들의 경우 입양면역치료를 위해 림프구 체외증폭을 시도할 때 림프구의 증식은 더 많이 이루어질 수 있으나 세포독성 림프구나 NK cell 보다 오히려 면역억제를 일으키는 조절 T 림프구의 증식이 활발할 것이라는 사실을 추정할 수 있다. 이 같은 결과는 현재 시도되고 있는 난소암 환자에서의 항암면역치료에 기초적인 자료로 이용될 수 있다고 사료된다. Objectives: The emergence of a tumor results from the disruption of cell growth regulation as well as from the failure to provoke a sufficient immunological response to tumor cells. The immune response associated with growth and suppression of tumor cells is controlled by antibodies, natural killer cells (NK cells), activated macrophages and cytotoxic T lymphocytes; they perform immunological antitumor responses through diverse methods. The unbalanced immune state, suppressed cell-mediated immunity associated with antitumor action and activated humoral immunity, result in growth of tumor cells. Especially, regulatory T lymphocytes evoke immune tolerance and cytotoxic T lymphocytes are suppressed and inactivated, therefore it is possible that tumor grows rapidly, invades locally and metastasizes to distant organ. A number of investigators have developed T cell lines by expanding tumor associated lymphocytes (TAL) from ovarian ascites or tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from solid tumors with IL-2. But, it is not clear what change occurred in proliferative and suppressive function of regulatory T lymphocytes after ex vivo expansion with IL-2. In order to improve adoptive immunotherapy, we have to know the change of regulatory T lymphocytes after ex vivo expansion of TAL or TIL. The aims of this study were to evaluate the proportions of CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) regulatory T lymphocytes before and after ex vivo expansion of ascites and the difference in the proportions of regulatory T lymphocytes between primary and recurrent ovarian carcinoma. Materials and methods: Ascitic fluid samples were obtained from 26 patients with ovarian carcinoma treated in Asan medical center from January 2005 to August 2006, among whom 19 patients were primary and 7 patients were recurrent. We isolated lymphocytes from ascites with Ficoll-Hypaque density gradient centrifuge method and analyzed phenotypes of lymphocytes through flow cytometry by using anti CD3 antibodies, anti CD4 antibodies, anti CD8 antibodies, anti CD16/56 antibodies, anti CD25 antibodies and anti FoxP3 antibodies. We cultured these lymphocytes ex vivo with IL-2 for 2~3 weeks and analyzed phenotypes of lymphocytes with same methods. Results: Lymphocytes increased by larger scale in the recurrent group than in the primary group (p <0.05). The proportion of ex vivo expanded lymphocytes changed as these; CD4^(+) T lymphocytes increased (p <0.05), and as CD8^(+) T lymphocytes decreased (p <0.05). CD3^(-)CD16^(+)56^(+) NK cells showed no change in proportion. This phenomenon was more outstanding in the recurrent group, but not statistically significant. The proportion of CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) regulatory T lymphocytes in CD4^(+) T lymphocytes increased after ex vivo expansion (p <0.05) and by larger scale in the recurrent group (p <0.05). Conclusion: This study suggests that regulatory T lymphocytes, not cytotoxic T lymphocytes or NK cells, will be expanded by larger scale after immunotherapy for activating immune system, especially in recurrent ovarian carcinoma. These results might play a role in designing immunotherapeutic approaches against ovarian carcinoma.