제대 정맥 혈관내피세포와 골수 유래 간엽줄기세포 혼합배양을 이용한 생인공 골 형성에 관한 연구

김만식 東國大學校 大學院 2004 국내석사

일반적으로 혈관내피세포는 골모세포의 분화와 신생혈관 형성에 있어서 매우 중요한 역할을 한다고 널리 알려져 있다. 본 실험의 목적은 골모세포와 혈관내피세포의 3차원 혼합배양을 통해 뼈 형성을 관찰하고자 하였다. 골모세포는 골수유래 중간엽 줄기세포를 분화 유도하였고, 혈관내피세포는 제대의 정맥으로부터 분리 및 배양하였다. 골모세포와 혈관내피세포는 콜라젠과 삼인산칼슘으로 제조된 스캐폴드내에서 혼합배양 하였다. 골모세포와 혈관내피세포의 접종 비율은 1:1, 1:0.8 및 1:0.6으로 하였다. 혼합배양동안 배지내의 혈관내피세포성장인자는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 생체 외에서 14일간 혼합배양된 스캐폴드는 누드마우스의 등 부위 피하에 포켓 삽입 형식으로 이식하였고, 2주, 4주, 그리고 6주 간격으로 생검을 실시하였다. 조직학적 염색과 면역조직화학적 염색을 통해 신생혈관 형성, 칼슘 침착, 콜라젠 침착, 그리고 콜라젠 타입을 알아보았다. 생체 외 배양에서 혼합배양은 단일 배양보다 약 5배 증가된 혈관내피세포 성장인자(1,120 pg/ml)의 분비를 보였다. 1:1의 세포접종비율로 혼합배양 되었던 스캐폴드에서 이식기간이 연장됨에 따라 가장 높은 칼슘과 콜라젠 침착을 보였다. 따라서 골모세포와 혈관내피세포 상호작용의 상승효과가 뼈 형성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나, 혈관내피세포의 높은 항원성 때문에 스캐폴드내에 배양되었던 세포들을 제거하였다. 이렇게 세포가 제거된 스캐폴드(cell conditioned scaffold)는 배양되었던 세포들에 의해 분비된 혈관내피세포 성장인자를 포함한 풍부한 세포외기질만 남게 되어 면역문제를 해결할 수 있게 된다. 그리하여 이러한 혼합배양 되었던 스캐폴드의 뼈 형성 능력을 관찰해보기 위하여 인위적으로 뼈 부분결손을 준 토끼의 척골에 정소이식을 하였다. X-ray사진과 H&E 염색 결과 이식한 혼합배양 되었던 스캐폴드는 토끼의 뼈와 잘 부착되어 새로운 뼈 형성이 촉진됨을 확인하였다. 결론적으로 3차원 혼합배양 되었던 스캐폴드는 뼈 형성 및 뼈 치료에 응용될 수 있을 것으로 사료된다. It is well known that endothelial cells play very important roles in the osteoblast differentiation and angiogenesis. The aim of this study was to observe the bone formation in a 3-dimensional co-culture using osteoblastic cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The osteoblastic cells were differentiated from the human bone marrow mesenchymal stem cells (hBM-MSCs), and HUVECs were isolated and expanded from the umbilical cord. The osteoblastic cells and HUVECs were co-cultured in scaffolds which are composed of collagen and β-tricalcium phosphate. The inoculation cell density ratio (osteoblastic cells: HUVECs) was varied from 1:1 to 1:0.6. In order to detect the vascular endothelial growth factor (VEGF) through an enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), media supernatant was collected during co-culture. Co-cultured scaffolds for 14 days of culture in vitro, were implanted subcutaneously as a pocket type on the dorsal region of nude mice. A biopsy was then performed at 2th, 4th and 6th week. Histological and immunohistological staining was performed to detect the capillary network formation, calcium deposition, collagen deposition and collagen type characterization in the implanted scaffolds. The in vitro co-culture secreted approximately about 5 times the VEGF (1,120 pg/ml) than a single culture in the media containing vitamin D3. The co-cultured scaffolds of the inoculation cell density ratio at 1:1 showed much higher collagen and calcium deposition as a prolonged implantation period (4 weeks). Therefore, this study showed that the synergistic effects of the cell-cell interaction (paracrine factor, heterotypic gap junction) can improve bone formation. However, we removed the cultivated cell in scaffolds, because of the antigenicity of endothelial cells. These cell conditioned scaffolds have an enriched ECM including VEGF inside the structure of scaffold. These cell-conditioned scaffolds were implanted orthotophically in partial defect of rabbit ulna to detect bone forming ability. From the X-ray and H&E staining, implanted scaffolds were well regenerated new bone networking with host bone. In conclusion, these results demonstrate that a 3-dimensional co-culture system can significantly enhance the bone formation and bone healing after implantation.

각막부전 토끼 모델에서 유도만능 줄기세포에서 유래된 각막 내피유사세포와 중간엽 줄기세포의 동시주입

정호석 울산대학교 일반대학원 2025 국내박사

내피세포의 배양조건 확립과 부착력 증가에 관한 연구

이수현 建國大學校 大學院 2000 국내석사

내피세포는 모든 혈관 내벽에 단일층으로 존재하며 이들이 가진 항응혈성을 비롯한 다양한 기능으로 인해 현재까지 많은 연구가 진행되어 왔다. 본 실험에서는 내피세포의 무혈청 배양을 위해 성장 촉진 인자, 혈장 알부민, 인슐린을 기본 배지에 첨가하여 혈정과 대치될 수 있는 농도를 조사하였으며 전단 응력과 여러 첨가물에 의한 부착력을 평가하였다. HUVEC의 계대 배양 시 첨가되는 ECGS는 성장인자들간의 조합에 의해 완벽하게 대치 될 수 있었으며 혈청의 역할도 성장인자, 혈장 알부민, 인슐린에 의해 부분적으로 대치되었다. 단기 배양에서 조사된 배지 성분으로 계대 배양을 수행한 결과 성장인자 만으로는 계대수 3에서 성장이 멈추고 degeneration되었으며 여기에 혈장 알부민, 인슐린을 함께 첨가한 경우 complete에 비해 증식은 느렸으나 내피세포 전형적인 조약돌 모양의 세포형태를 유지하며 3주 동안 비교적 안정된 배양이 가능했다. 전단 응력 하에서 내피세포의 부착능을 평가한 결과 cell spreading과 부착강도가 증가했으며 ECM의 합성을 촉진하는 첨가물을 세포부착에 큰 영향을 주지 못했다. 따라서 내피세포의 표면 부착성은 ECM 성분보다는 자체의 세포골격 단백질의 재배열이 더 주요한 요인으로 생각된다. Endothelial cells bind, process, and transport bioactive molecules and thus provide an interactive interface between the plasma and adjacent tissues. Various hormones and factors induce endothelial cells to synthesize and secrete interactive factors. However, study these bioactive molecules has been impeded because of the serum requirement for cell growth. Many of these bioactive molecules are derived from or are modified by serum components. In this study we identified a short-term culture system that supports sequential subculturing of endothelial cells in a serum-free conditions. The influence of bovine serum albumin(BSA), insulin, growth factors were studied in relation to cell proliferation. The effect of fetal bovine serum(FBS) could be replaced partially by BSA, insulin, and growth factors. And using this defined serum-free medium, we have grown human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) for up to 4 weeks. We also examined cell adhesion by measuring attached cells following exposure of cells to shear stress in microplate shaker. HUVECs were allowed to adhere to 24well plate with or without vascular endothelial cell growth factor(VEGF) for 24hr before exposure to shear stress. Following exposure to shear stress the number of attached cells were counted. Shear stress resulted in a greater number of bounds between the surface and the cell, which in turn cell spreading and increased the adhesive strength of the cell.

(The) effect of magnesium lithospermate B on endothelial dysfunction in diabetes mellitus

김소헌 Graduate School, Yonsei University 2008 국내박사

Impaired function of the endothelium is thought to be a precursor of atherosclerosis and a predictor of future vascular events. In diabetes, endothelial vasodilator function is compromised and this characterizes a proatherogenic state. This study was designed to investigate the effects of magnesium lithospermate B (LAB) on endothelial dysfunction associated with diabetes mellitus in cultured endothelial cells and in an animal model of type 2 diabetes.LAB effect on hyperglycemia induced changes in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity, phosphorylation of eNOS at serine 1177 and apoptosis was examined in cultured human endothelial cells. In human aortic endothelial cells (HAECs), hyperglycemia inhitibed eNOS activity by 86 %. LAB (50 μM) treatment was able to significantly prevent the decrease in eNOS activity by hyperglycemia. eNOS phosphorylation was decreased by hyperglycemia and this decrease was prevented by LAB treatment. High glucose treatment for 48 hours increased apoptosis by 2 folds in HAECs. LAB treatment was able to decrease apoptosis in high glucose treated HAECs at doses of 12.5 μM and greater. 25 μM treatment decreased apoptosis induced by hyperglycemia by 36%. LAB effect on hyperglycemia and cytokine induced THP-1 monocyte adhesion to endothelial cells was also examined. THP-1 monocyte adhesion to HUVECs were increased by hyperglycemia and TNF-α treatment. This was decreased by LAB treatment. As an animal model of type 2 diabetes, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats were treated with LAB (20mg/kg/day) for 20 weeks, starting at 12 weeks of age and compared with age-matched placebo treated OLETF rats. In OLETF rats, endothelium-dependent vasodilation was decreased compared to control lean Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats at 32 weeks of age. LAB treated OLETF rats showed improved endothelium-dependent vasodilation compared to OLETF rats treated placebo.In conclusion, LAB showed favorable effects on hyperglycemia induced endothelial dysfunction in cultured endothelial cells and showed to have preventive effects on endothelial dysfunction in OLETF rats. 혈관내피세포 기능장애는 동맥경화의 전구단계이자 미래의 대혈관 합병증의 예측과 관련이 있다. 당뇨병에서는 혈관내피세포 기능장애가 나타나며 이는 동맥경화를 조장하는 특성을 가지게 된다. 이 연구에서는 Magnesium lithospermate B (LAB)가 당뇨병과 관련된 혈관내피세포 기능장애에 미치는 영향을 혈관내피세포와 제 2형 당뇨병 모델 동물인 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) 쥐를 이용하여 규명하고자 하였다.고혈당에 의한 endothelial NOS (eNOS)의 활성 및 eNOS 의 serine 1177 위치의 인산화의 감소 및 세포 사멸에 대한 LAB의 효과를 살펴 보았다. 고혈당 및 TNF-α에 의한 THP-1 단핵구와 혈관 내피세포의 부착에 대한 LAB의 효과도 관찰하였다. 제 2형 당뇨병 동물모델에서의 LAB 효과를 보기 위하여 OLETF 쥐 모델을 사용하여 12 주부터 LAB (20mg/kg/day) 또는 위약을 20주간 투여하였고 정상 대조군인 Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) 쥐를 비교하였다. 32주에 동물들을 희생하고 흉부대동맥을 분리하여 혈관 확장능을 확인하였다.인간대동맥 내피세포에서 고혈당은 eNOS의 활성을 86% 감소시켰다. 50μM의 LAB는 고혈당에 의한 eNOS 활성의 감소를 유의하게 억제하였다. LAB에 의해 고혈당에 의한 eNOS 의 serine 1177 인산화의 감소가 회복되었다. 48시간 동안 HAEC을 48시간 동안 고혈당에 노출시켰을 때 세포 사멸은 2배 증가 하였다. LAB는 고혈당에 의한 세포사멸을 12.5uM 이상의 농도에서 예방하였다. LAB는 고혈당과 TNF-α에 의한 THP-1 단핵구와 혈관내피세포 부착의 증가를 감소시킬 수 있었으며 이는 VCAM-1 발현의 감소와 연관이 있었다. OLETF 쥐에서는 LETO 쥐와 비교했을 때 32주에 혈관내피세포 의존성 혈관확장능의 감소를 보였는데, LAB투여가 이를 일부 예방할 수 있음을 확인할 수 있었다.결론적으로, LAB는 배양된 인간혈관 내피세포에서 고혈당에 의한 혈관내피세포 기능장애에 긍정적인 효과를 미쳤고 OLETF 쥐에서도 혈관 내피세포 기능장애를 예방할 수 있었다. 따라서, LAB는 향후 당뇨병관련 혈관 합병증의 치료제로서 사용될 수 있는 가능성이 있다고 할 수 있겠다.

내피세포로 덮여 있는 암종세포색전에 관한 형태학적 연구

이태광 전남대학교 2008 국내박사

배경: 악성종양세포가 전이하기 위해서는 암세포가 먼저 혈관이나 림프관 안으로 침입해 암색전을 만들어야 하나 대부분의 암색전은 숙주 면역 방어에 의해 제거되는 것으로 알려져 있다. 저자는 수술로 절제한 사람 위암종에서 암색전이 정상 내피세포로 덮여 있는 경우를 관찰하였으며 이런 암색전은 숙주 면역 방어로부터 보호받을 수 있을 것으로 생각하였다. 이러한 소견은 지금까지 잘 알려져 있지 않은 내용이다. 이에 일차적으로 내피세포로 덮여 있는 암색전의 빈도와 형태를 병리조직학적 및 면역병리조직학적 방법으로 조사할 필요가 있어 본 연구를 수행하였다. 방법: 진행성 장형 위암종 148례의 원발 병터에서 두개씩의 파라핀 포매 조직괴를 선택하여 상피세포 표지자인 cytokeratin과 간엽세포 표지자인 vimentin, 맥관 내피세포 표지자인 CD31과 CD34, 림프관 내피세포 표지자인 D2-40, 그리고 기저막 표지자인 제4형 교원질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 염색으로 암색전의 빈도와 형태를 확인하였다. 또한 세포분열 표지자인 MIB-1 항체를 이용한 면역조직화학적 염색으로 암색전을 덮고 있는 내피세포의 세포분열을 확인하였다. 성적: 진행성 장형 위암종 148례 중 31례에서 암색전을 확인할 수 있었고 그 중 5례(3.4%)의 24 군데에서 암색전이 혈관 또는 림프관 내피세포로 덮여 있음을 확인할 수 있었다. 내피세포는 암색전의 표면 전체를 전부 덮고 있는 경우도 있었으나 부분적으로만 둘러싸는 경우가 더 많았다. 암색전을 덮고 있는 내피세포는 상당수 MIB-1에 양성반응을 보여 내피세포가 세포분열을 하고 있음을 알 수 있었다. 결론: 저자는 위암종에서 내피세포로 덮여 있는 암색전이 빈도는 높지 않으나 분명히 존재하며 그런 내피세포는 세포분열을 하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 지금까지 잘 기술되어 있지 않은 현상으로 암색전의 생존에 긍정적 역할을 할 것으로 생각된다. Background: For metastasis, vascular invasion and formation of tumor emboli by cancer cells are prerequisite, though most of the tumor emboli are destroyed by host immune defense mechanisms. However, the tumor emboli coated with host endothelial cells, which the author noticed in surgical specimens of gastric adenocarcinoma, may have greater chance of metastasis by escaping host immune defense mechanisms. In this study, the incidence, morphology, and possible precursor lesion of endothelium-coated tumor emboli were investigated. Material and Methods: From the archival tissue blocks of 148 cases of advanced gastric adenocarinoma of intestinal type, two representative tissue blocks of the primary lesion for each case were selected and serially sectioned for immunohistochemical staining. The targeted antigens were cytokeratin (epithelial marker), vimentin (mesenchymal marker), CD31 and CD34 (endothelial markers), D2-40 (lymphatic endothelial marker), collagen type IV (basement membrane marker), and MIB-1 (cell division marker). Results: Tumor emboli were noticed in 31 cases of the 148 cases, Among them, the surface of 24 tumor emboli in 5 cases were identified to be coated with endothelial cells, mostly of lymphatic origin, either wholly or partly. The over-all incidence of the endothelium-coated tumor emboli were 3.4%. Endothelium-coated papillary ingrowth of cancer cells into the vascular lumen was also noted, suggesting a possible process of endothelium-coated tumor emboli formation. Conclusion: This study shows clearly the presence of endothelium-coated tumor emboli in conventional gastric adenocarcinoma, although the incidence is low. The endothelium-coating may have a positive effect on survival of tumor emboli and subsequent metastasis.

배양된 인체 혈관내피세포에서 유해산소군에 대한 polyphenol의 보호 효과

김주봉 연세대학교 대학원 2003 국내석사

혈관내피세포는 허혈 및 재관류 손상 시 일차적으로 영향을 받으며, 장기 이식이나 보존에 중요한 역할을 한다. 또한 피판의 생존율을 높이거나 괴사의 가능성을 줄이기 위해서는 혈관내피세포의 보존이 중요할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 조직이나 장기의 허혈 및 재관류에 의한 손상에 유해산소군이 중요한 원인이라고 생각하고 혈관내피세포에 대한 유해산소군의 세포독성 정도를 관찰하였다. 그리고 녹차(green tea) polyphenol이 혈관내피 세포 활성도에 미치는 영향과 녹차 polyphenol의 전처리(pretreatment)가 유해산소군에 의한 혈관내피 세포 손상을 억제할 수 있는지를 in vitro 실험을 통해서 알아보았다. 인체 혈관내피세포(HMVEC, Clonetics, Catalog No. CC-2502)를 EGM-2 MV BulletKit(Clonetics, Catalog No. CC-3202) 배지를 사용해 배양한 후 내피세포 현탁액을 4×10^(4)개 농도가 되도록 24-well plate의 각 well에 넣고 1, 3, 5, 7일 동안 배양하여 ELISA reader 흡광도 측정을 이용하여 세포증식률을 측정하였다. 녹차추출물인 polyphenolic compounds(GtPP)를 L929 mouse fibroblasts 세포주에 처리한 뒤 ELISA reader 흡광도 측정을 이용하여 세포독성 여부를 확인하였다. 배양된 혈관내피세포 현탁액을 2×10^(5)개의 농도로 각각 24-well plate에 배양한 후 H_(2)O_(2)는 최종 0.1mM, 1mM, 10mM 의 농도로 처리하였고 0.25mM xanthine과 함께 xanthine oxidase를 0.1U/L, 1U/L, 10U/L로 처리하여 효소의 작용을 통해 산화적 스트레스를 유발시켰다. 처리 후의 내피세포의 형태를 광학현미경으로 관찰하였고 flow cytometry(FCM) 분석을 이용해 세포의 생장능(viability)을 확인하였다. 또한, 혈관내피세포를 2×10^(5) 농도로 24-well plate에 부착시킨 후 24시간 배양하고 GtPP를 최종농도 0.25, 0.5, 1, 2mg/ml로 1시간 동안 각각 전처리하여 배지를 갈아주고 산화적 스트레스-유도제를 첨가한 후 하루 동안 배양하였다. 그 후 광학현미경으로 내피세포의 형태를 관찰하였고, FCM 분석을 이용해 세포의 생장능을 확인하였다. 세포증식률 측정결과 배양된 인체 혈관내피세포는 정상적인 성장을 보이는 것을 관찰할 수 있었고 polyphenol의 세포독성실험 결과 실험에 사용된 농도의 polyphenol은 세포의 생장능에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 혈관 조직에 H_(2)O_(2)를 처리하거나, xanthine oxidase(+ 0.25 mM xanthine)를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 후 내피 세포의 생장능 및 형태적 변화를 각각 관찰한 결과, H_(2)O_(2)와 xanthine oxidase의 농도가 높아짐에 따라 내피세포의 생장능은 약 25%이상 감소되는 것을 관찰할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 유해산소군이 내피세포에 미치는 영향을 확인할 수 있었다. GtPP로 전처리한 후 산화적 스트레스-유도제인 H_(2)O_(2) 또는 xanthine oxidase(+ 0.25 mM xanthine)를 첨가한 경우의 내피세포의 형태와 생장능을 확인한 결과 GtPP 전처리는 내피세포의 보존에 우수한 효과를 나타내었다. 이로써 polyphenol이 유해산소군으로부터 내피세포를 보존하는 효과가 우수하다는 것을 입증할 수 있었으며 장기 및 조직보존 약제로서의 사용가능성을 확인할 수 있었다. Endothelial cells are most sensitively affected by ischemic-reperfusion injury, and also the endothelial cells have very important role in immune reaction of organ transplantation and preservation of the organ. To improve the survival rate of a flap, and also to reduce the possibility of flap necrosis, the protection and preservation of the endothelial cells are very important. Because reactive oxygen species(ROS) are thought to be an important cause of ischemic reperfusion injury, we studied the cytotoxicity of ROS on endothelial cells. We performed an in vitro study to document whether green-tea polyphenol pretreatment play an important role in preventing cytotoxic damage from ROS. Neonatal Dermal Microvascular Endothelial Cells were cultured in EGM-2 MV BulletKit. Endothelial cell suspension in concentration of 4×10^(4), was distributed into the wells of 24-well plate, cultured for 1, 3, 5, 7 days and the growth rate of the cells were measured with ELISA reader. Green-tea polyphenolic compounds(GtPP) were administered on L929 mouse fibroblasts and the possible cytotoxicity was measured with ELISA reader. Cultured endothelial cells in th e concentration of 2×10^(5) cells were treated with 0.1mM, 1mM, 10mM H_(2)O_(2) and also with 0.25mM xanthine and xanthine oxidase to induce oxidative stresses. Then the morphological findings of the endothelial cells were observed under the light microscope and the growth rate was analyzed with flow cytometry. To evaluate its protective effect, 0.25, 0.5, 1, and 2 mg/ml of GtPP were administered to endothelial cells in the concentration of 2×10^(5) cells, one hour before administration of the oxidative agents, and then the cells were cultured for 24hours. Afterwards, the morphology of endothelial cells were observed under the light microscope and the growth rate was analyzed with flow cytometry. The results are as the followings. The growth of human endothelial cells were normal, and polyphenol of each concentration administered in this study did not show cytotoxicity. As a result of oxidative stress induced by H_(2)O_(2) or xanthine oxidase(+ 0.25mM xanthine), the endothelial cell viability decreased by more than 25%, thus confirming the effects of ROS to endothelial cells. The GtPP pretreatment before H_(2)O_(2) or xanthine oxidase(+ 0.25mM xanthine) administration, resulted significant protective effects for endothelial cells in morphology and growth rate study. Through these studies, the authors confirmed the protective effects of polyphenol against ROS. We also conceived that the polyphenol can possibly be implemented as an agent for organ or tissue preservation.

각막내피세포 뮤신층의 성상과 생성기원

박중원 연세대학교 대학원 2001 국내박사

각막내피세포는 각막의 투명성 유지에 중요한 역할을 한다. 현재 안과 영역에서 흔한 질병인 백내장 수술시 발생할 수 있는 내피세포의 과도한 소실은 시력을 잃게 하고, 나아가 각막이식수술을 받게 되는 주요 요인이 되고 있다. 그러므로 안과수술 중 각막내피세포의 보호는 항상 중요한 과제로 여겨지고 있다. 최근 각막내피세포의 표면이 점액 층으로 싸여 있다는 보고가 있었고, 이에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 이 점액 층의 성상과 생성기전에 관해 알아보고자 하였고, 이러한 연구는 추후 각막내피세포의 보호방안과 점탄성 물질의 개발 시 중요한 자료가 될 것으로 사료된다. 점액층의 주성분은 뮤신이고, 뮤신은 중앙의 단백질을 중심으로 주변에 많은 당질이 붙어있는 형상을 하고 있으므로, 이 당질 층의 조성을 알아보기 위해 lectin을 이용하여 성분염색을 하였다. 각각 특정 당질과 부착하는 11가지의 lectin 염색에서 모두 양성반응을 보였고, 그중 RCA-1, PHA-E, SNA, WGA, MAA, CON-A는 강한 양성반응을 보였으며, PNA 의 경우 중등도 반응을, SBA, LCA, DBA, UEA-I에서는 약한 양성반응을 보였다. 즉 각막내피세포를 덮고있는 점액 층은 뮤신을 구성하는 요소인 여러 종류의 당질로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 뮤신의 위치와 구조상의 특성을 알아보기 위해 WGA lectin-gold complex를 이용하여 투사 전자현미경 관찰을 한 결과, WGA lectin-gold 입자가 각막 내피세포 내 주머니 형태, 내피세포 표면, 그리고 세포밖에 존재하는 뮤신층 내에서 관찰되었다. 즉 뮤신이 각막내피세포에서 생성되고 내피세포 내에서 주머니 형태로 존재하다가 세포 밖으로 배출되는 것임을 알 수 있었다. 그리고 뮤신이 각막내피세포막 밖을 덮고 있는 점액층의 구성성분임을 알 수 있었다. 인체 각막내피세포 뮤신층의 생성기전과 생성원류를 알아보고자 각막에서 비교적 흔하며, 각막상피세포에서도 발견되는 뮤신인 MUC1의 존재를 밝히고자 하였고, 3가지의 분자생물학적 실험을 하였다. 인체 각막내피세포의 역전사 중합효소 연쇄반응결과 기존에 알려진 MUC1 mRNA와 같은 크기의 산물을 관찰할 수 있었다. 각막내피세포의 MUC1의 역전사 중합효소 연쇄반응산물인 368 bp의 밴드를 정제하여 E. coli(DH-5α)에 부차클로닝 한후 자동염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 분석한 결과 이미 밝혀져 있는 MUC1의 염기서열과 일치하여, 증폭된 역전사 중합효소 연쇄 반응산물의 염기서열이 MUC1임을 확인하였다. 그리고 in situ hybridization을 이용하여 MUC1 mRNA의 분포를 살펴본 결과 MUC1 mRNA가 각막 내피세포 핵 주위에 존재함을 알 수 있었다. 또한 기존의 MUC1의 존재가 입증되어 있는 인체 각막상피를 양성 대조군으로 사용하여 시행한 웨스턴 블롯팅에서 각막내피세포도 같은 크기의 MUC1 단백질이 존재함을 알 수 있었다. MUC1에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 염색상 인체 각막내피 세포의 안쪽과 바깥쪽에서 염색 양성 소견을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 각막내피세포 표면에는 여러 종류의 lectin과 반응하는 당질이 풍부한 층이 있음을 확인할 수 있었고, 적어도 뮤신의 일종인 MUC1이 존재하는 것을 알 수 있었다. Corneal endothelial cells play a major role in the maintenance of corneal transparency. Excessive loss of corneal endothelial cells during ECCE (Extracapsular cataract extraction), which is one of the most common operations in ophthalmology, results in loss of vision and eventual corneal transplantation. Therefore, the protection of corneal endothelial cell during ECCE is indeed significant. Recently, there have been reports showing that the corneal endothelial cell surface is covered by a mucous layer. In this study, we investigated the nature of this corneal endothelial mucous layer and the biochemical mechanism of mucin production. These data may be useful in the search for a new viscoelastic material and an innovative protection method for the corneal endothelial cells. The major component of the mucous layer is mucin and this mucin consists of a core protein with peripheral carbohydrate branches. We stained the carbohydrate of mucin with specific lectin to find out the component of the carbohydrate. All the lectin staining results showed positive findings. (RCA-1, PHA-E, SNA, WGA, MAA, Con-A atrong positive; PNA: moderate; SBA, LCA, DBA, UEA-I: weak.) The results obtained showed that the mucous layer covering the corneal endothelial cells consists of various kinds of carbohydrate which constitute mucin. To determine the location and structural characteristic of mucin, we observed WGA lectin-gold complex with transmission electron microscopy. WGA lectin-gold particle was found in the endothelial cell as a vesicular shape located on the surface of endothelial cell and in the separated mucous layer. This suggested that mucin was produced in the corneal endothelial cells, remained in the vesicle, and secreted. The results confirmed that mucin is one of the components of mucus layer overlying the corneal endothelial cell. To confirm the biochemical mechanism of mucin production by corneal endothelial cells, we performed 3 kinds of molecular biologic studies using MUCl, which is present in the cornea. We had detected a MUC1 mRNA band from the RT-PCR results of human corneal endothelial cells, which coincides with the positive control band. Using in situ hybridization, silver grains were observed around the nucleus in human corneal endothelial cells representing the expression of MUC1 mRNA in the corneal endothelium. According to Western blot, MUC1 antibodies produced positive signals. Immunohistochemical studies on human corneal sections showed positive statining for the protein product of MUC 1 in corneal endothelium . The results of this study showed that there was a carbohydrate-rich layer which reacts to various lectins on the corneal endothelial surface and MUC 1 is one of the components of this layer.

Regulatory mechanisms of RAGE in endothelial permeability and its therapeutic potential

정지수 Graduate School, Yonsei University 2016 국내석사

혈관내피세포는 혈관의 항상성을 유지하는데 있어 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 혈관내피세포의 기능이 상실되면 동맥벽의 손상이 초래되는데 이것을 혈관내피세포의 기능장애 (Endothelial dysfunction)라 하며 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 심부전증 및 흡연자 등의 환자에게서 주로 발생된다. 이러한 혈관내피세포 기능장애는 동맥경화 발생 초기에 발생하는 생리적 변화로 관상동맥질환의 발병에 중요한 역할을 한다. 혈관내피세포 기능장애의 초기 발생 신호 인자 중 하나로 잘 알려진 내피세포 장벽 투과성이 증가 하는 현상은 고혈압과 죽상경화성 심혈관 질환의 발생과 관련이 있다. 관 내피 캐드헤린 (Vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)과 같은 내피세포 부착연접의 파괴를 통한 내피세포 투과성의 증가는 고혈압과 죽상경화성 심혈관 질환의 일반적인 특성이다. RAGE (receptor for advanced glycation end product)는 대부분의 세포 및 조직에 존재하며 초기 면역반응의 일환으로 염증반응을 일으키는 중요한 세포막 수용체의 한 종류이다. 최근에는 RAGE의 대표적인 ligands인 AGE를 처리 하여 내피세포 투과성을 높이는데 기여한다는 가설이 발표되었다. 또한 혈압증가 및 과도한 염증반응을 일으키는 안지오텐신 II (Angiotensin II)가 내피세포 스트레스 섬유의 형성을 증가시킴으로써, 내피세포 투과성이 증가 된다는 가설도 발표되었다. 그러나 아직까지 안지오텐신 II에 의해 유도된 내피세포 투과성 및 이를 조절하는 RAGE의 하위 신호전달 기전이 밝혀진 것이 거의 없다. 그리하여 본 연구에서는 human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)을 이용하여 안지오텐신 II 에 의한 혈관내피세포 기능장애를 확인하고, 내피세포 투과성을 조절하는 RAGE의 분자생물학적 기전을 규명함과 동시에, RAGE의 decoy receptor인 soluble RAGE (sRAGE)을 사용하여 혈관내피세포 기능장애의 보호효과를 조사하였다. 본 연구에서는 안지오텐신 II 에 의한 혈관내피세포 투과성을 확인하고자 안지오텐신 II 를 농도 별, 시간 별로 처리하여 endothelial permeability assay 와 trans-endothelial electrical resistance (TEER) 방법을 통해 안지오텐신 II 가 혈관내피세포 투과성을 유도함을 확인 하였다. 또한 sRAGE를 처리 하였을 때 안지오텐신 II 에 의해 증가된 혈관내피세포 투과성이 상당히 약화된 것을 확인하였다. 게다가 본 실험에서 공초점 레이저 현미경을 사용하여 HUVEC에서 sRAGE가 안지오텐신 II 에 의해 유도된 VE-cadherin의 분열을 회복시키는 것을 확인하였다. 안지오텐신 II 자극에 의해 증가된 AT1R과 RAGE의 단백질 발현양은 sRAGE 처리에 의해 상당히 억제되었다. 게다가, 본 연구에서는 HUVEC에서 안지오텐신 II 에 의해 유도된 Src, β-catenin 그리고 VE-cadherin의 활성을 sRAGE가 약화시킴을 증명하였다. 결론적으로 본 연구에서는 안지오텐신 II 에 의해 활성화된 AT1R가 HMGB1을 세포막 밖으로 분비함으로써 RAGE를 활성화하고 Src/β-catenin/VE-cadherin 신호전달을 활성화함으로써 혈관내피세포의 투과성을 증가시키는 것을 알 수 있었다. 그리고 sRAGE가 안지오텐신 II 에 의한 AT1R-RAGE 에 의해 매개된 신호전달 기전을 약화시키는 것도 확인하였다. 본 연구의 결과들은 혈관내피세포 기능장애를 조절하는 새로운 중요 조절 단백질로서 RAGE의 가능성을 제시할 수 있을 것이다. Endothelial cells play a very important role in maintaining the homeostasis of blood vessels. When the endothelial cells lose their functions, the arterial wall is damaged, which is called endothelial dysfunction. An increase in endothelial barrier permeability has been known as one of the earliest signs of endothelial dysfunction, which is associated with future development of hypertension and atherosclerotic cardiovascular disease. The increase in endothelial permeability via disruption of endothelial cell adherens junctions, such as vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin), is a common feature of these diseases. Receptor for advanced glycation end-product (RAGE) activation has been demonstrated to crosstalk with renin-angiotensin system (RAS), especially Angiotensin II type I receptor (AT1R), in the progression of atherosclerosis. In addition, a recent study showed that treatment of AGE increases the endothelial permeability. Also, Angiotensin II (Ang II) induces the formation of endothelial stress fiber, thus resulting in an increase of endothelial permeability. However, it has rarely been investigated whether Ang II can regulate the endothelial permeability and on its mechanisms, especially related with RAGE-mediated signaling. Here we investigated regulatory mechanisms of RAGE under Ang II-induced endothelial permeability using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The present study demonstrated that Ang II increased endothelial cell permeability using two different methods, endothelial permeability assay and trans-endothelial electrical resistance, where sRAGE, a decoy receptor for RAGE, significantly attenuated the increase of endothelial permeability. Moreover, confocal laser microscopic examination confirmed that sRAGE restored Ang II-induced VE-cadherin disruption in HUVECs. Protein expression levels of AT1R and RAGE, which are increased by Ang II stimulation, were significantly inhibited by sRAGE treatment. Furthermore, we examined that sRAGE attenuated Ang II-induced activation of Src, β-catenin and VE-cadherin in HUVECs. In summary, Ang II was capable to increase the endothelial permeability through HMGB1 secretion, which activated RAGE and Src/ β-catenin/VE-cadherin signaling pathway. And sRAGE showed attenuation of AT1R-RAGE mediated signaling under Ang II. These data may suggest the possibility of RAGE as a new investigational target for endothelial dysfunction

Directed Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Endothelial Cells Having Ikaros-Mediated Immune Tolerance Properties : Establishment of Allogenic Endothelial Cell Source with Best Engraftment

신영철 서울대학교 대학원 2022 국내박사

I previously reported the direct conversion of fibroblasts into functional endothelial cells (ECs). However, the converted old ECs retain their cellular age with limited proliferative capacity. In addition, the whole process starting from harvesting autologous fibroblasts takes long time, limiting the usage of converted ECs for ready-to-use clinical purpose. To overcome these limitations, I aimed to make a highly efficient protocol for directed differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into ECs using forced induction of key transcription factors. I examined whether three transcription factors (ER71, KLF2, TAL1) used for the conversion of human fibroblasts into ECs could differentiate embryonic stem cell-derived MSCs into functional ECs. After factor screening, I found that only one transcription factor, ER71, was required for efficient derivation of MSC-derived induced endothelial cells (MiECs). Addition of SB431542, a transforming growth factor-β inhibitor, vascular endothelial growth factor, and ascorbic acid to the culture media enhanced the differentiation efficiency. Finally, 75.7±2.4% of the MSCs were differentiated to mature functional ECs defined by double-positivity for VE-cadherin / PECAM1 after one week of induction protocol. The resultant MiECs showed the endothelial characteristics including cobblestone morphology, in vitro tube formation, and expression of endothelial markers on RNA and protein level. Transplantation of MiECs into ischemic hindlimbs of mice enhanced limb perfusion and salvaged the limbs. Immune tolerance properties of MSCs were potentiated after MiEC derivation. MiECs highly expressed human leukocyte antigen (HLA)-G, interleukin-6, endothelial nitric oxide synthase, and indoleamine 2,3-dioxygenase 1, and repressed HLA-DR expression under interferon-γ stimulation. Transplantation of MiECs to immunocompetent mice showed higher survival compared with that of control ECs. I inferred and verified that this immune tolerance properties of MiECs were mediated by expression of Ikaros which was positioned downstream of ER71. Collectively, I established the efficient protocol for directed differentiation of MSCs into mature functional ECs based on forced induction of ER71. MiECs possessed immune tolerance properties mediated by Ikaros, suggesting their potential usage for ready-to-use allograft regeneration. 나는 이전의 연구에서 인간 피부섬유모세포를 기능적 혈관내피세포로 직접전환 시킬 수 있음을 보고했다. 하지만 직접전환에 의해 유도된 혈관내피세포는 나이든 세포이기 때문에 증식에 한계가 있었고, 자가 피부섬유모세포를 채취하는 것으로부터 시작되는 일련의 과정은 오랜 시간이 소요되기 때문에, 피부로부터 전환된 혈관내피세포를 임상목적으로 즉시 사용하기에는 한계가 있었다. 나는 이러한 한계를 극복하기 위하여 인간 중간엽줄기세포(MSC)에 핵심 전환 유전자를 도입하여 혈관내피세포로의 분화를 유도하는 고효율의 프로토콜을 개발하였다. 나는 인간 피부섬유모세포를 혈관내피세포로 직접전환하기 위해 사용했던 세 가지 전사인자(ER71, KLF2, TAL1)들이 중간엽줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있는지 확인하였고, 전사인자 스크리닝을 통해 ER71 단 하나의 전사인자만을 사용하여 중간엽줄기세포 유래 유도혈관내피세포(MiEC)로의 분화를 효율적으로 유도하였다. 전환 과정 중 세포 배양액에 형질전환성장인자(TGF)-β 억제제인 SB431542, 혈관내피세포성장인자(VEGF), 아스코르브산을 첨가함으로써 유도 분화의 효율을 향상시킬 수 있었다. 최종적으로, 중간엽줄기세포를 1주일간의 분화 프로토콜을 통해 75.7±2.4%의 효율로 VE-cadherin/PECAM1 이중 양성으로 정의된 성숙하고 기능적인 혈관내피세포로 분화시킬 수 있었다. 분화된 MiEC는 혈관내피세포 특이적 형태인 조약돌 형태를 보여주었고, 마트리젤에서 튜브를 형성하였으며, RNA 및 단백질 레벨에서 혈관내피세포 특이마커의 발현을 포함하는 내피세포적 특성들을 보여주었다. 하지 허혈성 마우스에 MiEC를 이식하면 하지 혈류 흐름이 향상되었고 하지 손실이 감소하였다. MSC가 보유한 면역 관용 특성은 MiEC로 분화된 후 더 강화되었다. MiEC는 인간 백혈구 항원(HLA)-G, 인터루킨(IL)-6, 내피 산화질소 합성 효소(eNOS) 및 인돌아민 2,3-디옥시지나제(IDO1)를 다량 발현하였고 인터페론-γ 자극 하에서 HLA-DR는 대조군보다 더 적게 발현하였다. MiEC를 면역 반응성의 마우스에 이식하였을 경우 대조군으로 사용한 혈관내피세포보다 더 높은 생존율을 보였다. 나는 MiEC의 이러한 면역 회피 기능이 ER71의 하위에 위치한 Ikaros의 발현에 의해 매개되었음을 생명정보학적 관점에서 추론하였고 in vitro 실험을 통하여 증명하였다. 정리하면, 나는 이번 연구에서 중간엽줄기세포에 유도 분화의 핵심 유전자인 ER71을 도입하여 성숙하고 기능적인 혈관내피세포로 분화시키는 효율적인 프로토콜을 개발하였다. MiEC는 Ikaros에 의해 매개되는 면역 관용 특성을 가지고 있어서, 즉시 사용 가능한 동종이식 재생 치료제로서의 가능성을 제시한다.

정렬된 나노섬유를 이용한 내피세포배양

김용수 아주대학교 2021 국내석사

세포배양은 일반적으로 2차원 환경에서 진행을 하게 되지만 실제 임상실험에서 나타날 수 있는 결과는 차이가 나기 때문에 임상실험과 비슷한 조건에 3차원 구조를 같고 있는 배양환경을 조성하여 실제와 비슷한 결과를 확인할 수 있다. 이를 위해 사용한 3차원 환경으로 구축한 나노 섬유를 제작하였으며 이것을 관찰하였을 때 나타나는 특징으로 실처럼 방사되며 무작위적 상태를 보여주었다. 이와 같은 방법으로 정렬된 나노섬유를 제작하였고 이는 체내 혈관과 유사한 모습을 나타낸다. 제작한 나노섬유에 내피세포를 배양하여 두 가지 나노섬유에 차이와 배양된 세포의 모습을 관찰할 수 있다. 나노섬유는 chloroform을 용매로 사용하여 Poly ε-caprolactone(PCL)을 전기방사로 진행하여 제작되며(C-PCL), 정렬된 Poly ε-caprolactone(Aligned-C-PCL)과 함께 제작하여 3차원 나노섬유를 구축하였다. 세포 성장에 대한 차이를 비교하기 위해 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor)를 적당한 농도로 처리하였다. 완성된 C-PCL에 배양한 내피세포는 무작위적 특징의 나노섬유를 따라 넓게 퍼져 자란 형태가 나타났으며 Aligned-C-PCL(이하 AC-PCL)에 배양한 내피세포는 정렬된 형태의 나노섬유를 따라 한 방향으로 자라는 모습을 나타나게 되었다. 혈관 내피 성장인자(이하 VEGF)를 처리한 세포배양 군이 VEGF를 처리하지 않은 세포배양 군 보다 많은 성장을 하였다. 실험 모델로 3차원 배양의 특징을 살려 세포배양을 확인할 수 있다. 핵심어: 나노섬유, 전기방사, 정렬된 나노섬유, 3차원 세포배양, 내피세포, 혈관 내피세포 성장인자