마크로라이드 유도내성 및 획득내성이 Mycobacterium abscessus 폐질환 치료성적에 미치는 영향과 치료실패 시 유전형의 변화

정병호 성균관대학교 일반대학원 2015 국내박사

Background: The prevalence of lung disease due to non-tuberculous mycobacteria (NTM) is increasing worldwide. Among the rapidly growing mycobacteria, Mycobacterium abscessus complex is the most significant cause of NTM lung disease. Based on recent whole-genome sequencing studies, the M. abscessus complex is divided into three subspecies (subsp.): M. abscessus subsp. abscessus (hereafter referred to as M. abscessus), M. abscessus subsp. massiliense (hereafter referred to as M. massiliense), and M. abscessus subsp. bolletii. Compared to the highly negative culture conversion rate of ~90% in patients with M. massiliense lung disease, the culture conversion rate in patients with M. abscessus lung disease is ~30%. Inducible macrolide resistance by functional erm(41) gene and acquired macrolide resistance by mutation of the rrl gene are believed to contribute to the low success rate of antibiotic treatment in patients with M. abscessus lung disease; however, the extent to which these factors truly contribute to treatment failure is unknown. Additionally, little is known regarding the associations between treatment outcome and colony morphotypes or genetic variations that arise upon antibiotic treatment. Objectives: The aim of this study was to assess the effect of colony morphotype, inducible resistance conferred by erm(41), and acquired resistance due to rrl mutations on treatment outcome. We also aimed to characterize genetic variations that arise upon antibiotic treatment. Methods: Treatment outcomes were analyzed in 67 patients with M. abscessus lung disease who underwent antibiotic treatment for more than one year between January 2002 and December 2012. Genetic analyses of stored M. abscessus clinical isolates were performed on the final failure group consisting of 24 patients with treatment failure after one year of antibiotic treatment and 5 patients with positive M. abscessus culture(s) after treatment with negative conversion. These results were compared with the final success group consisting of 15 patients with negative cultures to M. abscessus after treatment completion with negative conversion. Measurements and Main Results: Among the 67 patients with M. abscessus lung disease that received antibiotic treatment for more than one year, the culture conversion rate was 41.8% (28/67) after one year of treatment, and the final success rate was 40.3% (27/67). Final success rates were more common in patients with a negative smear result, non-cavitary disease, and no prior history of pulmonary tuberculosis at the beginning of antibiotic treatment. Smooth colony morphotypes and C28 sequevars of erm(41) were more common in the final success group compared to the final failure group (8/15 [53.3%] vs. 3/29 [10.3%]; p = 0.011, 6/15 [40.0%] vs. 1/29 [3.4%]; p = 0.004, respectively). All colonies with the C28 sequevar of erm(41) were susceptible to clarithromycin. A single colony harboring a 19C→T point mutation in the T28 sequevar of erm(41) was also susceptible to clarithromycin, and the others with the T28 sequevar of erm(41) were resistant to clarithromycin. The incidence of acquired resistance due to rrl mutations was 10% (3/29) in the final failure group. According to repetitive sequence-based PCR results in the final failure group, polyclonal infections were detected in 72.4% (21/29). Conclusions: The low success rate of antibiotic treatment in patients with M. abscessus lung disease may not be caused by mutations in rrl, but rather, appear to be caused by the inducible resistance conferred by functional erm(41) and polyclonal infections. Thus, the identification of erm(41) sequevars from infecting strains is important for efficiently treating patients with M. abscessus lung disease. In addition, further research on environmental interventions might be necessary to reduce reinfection. 최근 Mycobacterium abscessus complex는 전장유전체염기서열분석법 등을 통하여 M. abscessus subspecies (spp.) abscessus (이후로는 M. abscesus), M. abscessus spp. massiliense, M. abscessus spp. bolletii 등 3가지 아종으로 나뉘고 있다. M. abscessus 폐질환은 30% 내외의 낮은 객담배양음전 성공률을 보이는데, 치료성적이 낮은 것은 erm(41) 유전자에 의한 마크로라이드 유도내성 때문인 것으로 알려져 있다. 하지만 erm(41) 유전자에 의한 유도내성과 rrl 유전자 돌연변이에 의한 획득내성이 치료성적에 어느 정도 영향을 미치는지 알려진 바가 적다. 또한 M. abscessus의 집락형태형에 따른 치료성적이나 원인균의 시간에 따른 유전형 변화에 대해 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 본 연구는 M. abscessus의 집락형태형, erm(41) 유전자에 의한 유도내성 발현 여부, rrl 유전자의 돌연변이에 의한 획득내성 여부가 치료성적에 미치는 영향을 분석하고, 치료실패군에서 원인균의 시간에 따른 유전형 변화에 대해서 알아보고자 하였다. 2002년부터 2012년도까지 M. abscessus 폐질환으로 1년 이상 항생제치료를 받은 환자 67명을 대상으로 치료 성적을 분석하였다. 1년 이상 항생제치료에도 객담배양음전에 실패한 환자와 객담배양음전에 성공한 상태로 치료종결 후 다시 객담배양에서 M. abscessus가 확인된 환자를 최종치료 실패군으로 정의하였고, 객담배양음전에 성공한 상태로 치료종결 후 재발이 없었던 환자를 최종치료 성공군으로 정의하였다. 보관균주가 확보된 환자는 최종치료 실패군에서 29명, 최종치료 성공군에서 15명이었다. 67명의 M. abscessus 페질환 환자 중 1년째 객담배양음전에 성공한 환자는 28명(41.8%)이었고 최종치료 성공군은 27명(40.3%)이었다. 임상적으로는 도말음성, 공동이 없는 경우, 결핵 치료력이 없는 경우에 최종치료 성공률이 높았다. 최종치료 성공군에서 실패군에 비해 치료 전 집락형태형이 평활형인 경우가 더 흔하였다(8/15 [53.3%] vs. 3/29 [10.3%], P = 0.011). erm(41) 유전자의 C28 sequevar 비율은 최종치료 성공군에서 실패군에 비해 높았다(6/15 [40.0%] vs. 1/29 [3.4%], P = 0.004). 여기서 C28 sequevar의 erm(41) 유전자를 갖는 모든 집락은 클래리스로마이신 감수성을 보였다. T28 sequevar의 erm(41) 유전자를 갖는 경우 19C→T 돌연변이를 보인 한 집락에서만 클래리스로마이신 감수성을 보였고 나머지는 모두 유도내성을 보였다. 최종치료 실패군에서 rrl 유전자 돌연변이에 의한 마크로라이드 획득내성 발생 빈도는 10% (3/29)로 낮았다. Rep-PCR을 이용한 유전형 분석 결과 최종치료 실패군에 속한 환자 29명 중 21명(72.4%)에서 다양한 유전형에 의한 감염으로 확인되었다. 이상의 결과로서, M. abscessus 폐질환의 낮은 치료성공률에는 rrl 유전자 돌연변이에 의한 마크로라이드 획득내성 발현보다는 erm(41) 유전자에 의한 마크로라이드 유도내성 발현과 다양한 유전형에 의한 재감염 혹은 복합감염이 중요하다고 볼 수 있겠다. 따라서 M. abscessus 폐질환 환자에 대한 효율적인 치료를 위해서는 erm(41) 유전자의 C28 sequevar 여부 확인이 중요하겠으며, 생활환경 중재요법에 대한 연구가 필요하겠다.

宿主菌이 streptomycin 耐性獲得이 phage의 各種 性質에 미치는 影響

김원기 全南大學校 大學院 1983 국내박사

著者는 Klebsiella phage-宿主菌系를 供試하면서 SM耐性菌에서 phage가 繁殖할 때 나타나는 各種現象을 調査하여 다음 結果를 얻었다. SM耐性菌의 生菌 및 加熱菌體物質에의 phage吸着率은 正常菌의 그것들에 對한 吸着率보다 多少 더 높았다. SM耐性菌通過 phage 및 正常 phage가 각종 SM耐性菌에서 나타내는 檢出狀況은 正常菌에서의 그것과 비슷하였다. SM耐性菌에서의 phage繁殖은 正常菌에서보다 多少 더 不良하였으며, SM耐性菌 通過phage의 SM耐性菌內繁殖은 正常菌內繁殖 때보다 多少 더 旺盛하였다. SM耐性度가 比較的 낮은 菌에서 phage가 나타내는 plaque 外觀은 正常菌에서의 그것과 비슷하였으나 高度의 SM耐性菌에서 나타내는 plaque 外觀은 正常菌에서의 그것과는 全然 다른 大型鮮明 plaque를 形成하였으며, SM耐性菌에서의 plaque halo 形成은 大端히 不良하였다. SM耐性菌 및 正常균의 莢膜性多糖類는 다같이 phage 活性에 별다른 作用을 하지 못하였다. SM耐性菌을 通過시킨 phage의 抗原性은 正常 phage의 그것과 相當히 달랐다. The author has investigated, using the Klebsiella phage-host bacteria system, the various phenomena resulted from phage multiplication in streptomycin(SM) resistant bacteria. The following results were obtained. The phage adsorption rate to the live cell or heat extracted-bacterial substance of SM resistant bacteria was a little higher grade than that to those of normal bacteria. The efficiency of plating of normal and SM resistant bacteria-passed phageon various SM resistant bacteria was similar to that on normal bacteria. The phage growth in SM resistant bacteria was worse than that in normal bacteria. The growth of SM resistant bacteria-passed phage in SM resistant bacteria was a little more vigorous than that in normal bacteria. If the SM resistance of host cell is lower grade, the appearance of phageplaque was similar to that in normal bacteria. The plaque, however, formed in the cells of higher grade-SM resistance was larger and clearer and the appearance was completely different from that formed in normal cell. And also, the plaquehalo in SM resistant bacteria was much reduced. The capsular polysaccharides of normal and SM resistant bacteria did not show any influence to the phage activity. The antigeniity of SM resistant bacteria-passed phage was considerably different from that of normal phage.

臟器液의 結核菌 SM耐性獲得에 미치는 影響에 관한 硏究

강원자 서울대학교 大學院 1961 국내박사

Stenotrophomonas maltophilia의 획득내성유전자 분석

송정훈 忠南大學校 大學院 2009 국내석사

Background: S. maltophilia is a non-fermentative, Gram-negative bacillus, increasingly identified as a nosocomial pathogen in immune compromised patients, Trimethoprim/sulfamethoxazole is one of the most potent agents for treating S. maltophilia infection. But, resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole is increasing. In this study, we have investigated the relation between the incidence of trimethoprim/ sulfamethoxazole resistance and the presence of sul1, class1 integron, and between the incidence of ciprofloxacin resistance and the presence of Smqnr gene. Materials and methods: Seventy-six S. maltophilia isolates were collected at the Chungnam National university Hospital, Chungbuk National university Hospital, Eul-Ji university Hospital during April-November 2007. Antibiotics susceptibility were tested by Disk diffusion method. PCR and DNA sequencing were conducted for the detection of sul1 gene, class1 integron and Smqnr gene. Results: Eleven of 76 isolates were resistant for Trimethoprim/ sulfamethoxazole. Harbouring rate of sul1 gene, class1 integron were about 81.8%, 72.7% in resistant isolates and about 16.8%, 10.9% in susceptible isolates, respectively. Twenty-nine of 76 isolates were resistant for ciprofloxacin. 10/29(34.5%) of ciprofloxacin resistant S. maltophilia were positive for Smqnr. 19/44(43.2%) of ciprofloxacin susceptible S. maltophilia were positive for Smqnr. Conclusion: S. maltophilia harbouring Su1 gene, class 1 integron were higher resistant for trimethoprim/ sulfamethoxazole (P-value:<0.01). S. maltophilia harbouring Smqnr were not higher resistant for ciprofloxacin (P-value=0.41).

宿主菌의 Streptomycin 耐性獲得이 phage의 各種 性質에 미치는 影響

김원기 全南大學校 1983 국내박사

최근 2년간 Ciprofloxacin에 대한 Methicillin-restant staphylococcus aureus(MRSA)의 신속한 내성획득에 관한 고찰

최철원 고려대학교 1992 국내석사

분변에서 분리된 Vancomycin-resistant Enterococcus의 항생제내성 유전자형 분석 및 내성획득기전

김희정 부산가톨릭대학교 생명과학대학원 2009 국내석사

배경 : 장구균은 장내세균총의 위장관의 정상 상재균으로 대부분 대변배양을 통하여 분리되며 소수에서 구강 내 또는 여성생식기의 질내 상재균으로 분리되는 비교적 독성이 약한 병원성균이다. 임상에서 분리되는 장구균의 80-90%는 E. faecalis이고 5-10%는 E. faecium이지만 수년전부터 미국의 대형 병원을 중심으로 다약제내성을 보이는 E. faecium이 등장해 중요한 병원감염균으로 대두되고 있다. 프랑스와 영국에서 Vamcomycin에 내성을 나타내는 vanA를 가진 E. faecium가 처음 보고된 이래 VRE는 각 병원의 면역이 저하된 중환자실 환자들을 중심으로 급증하고 있고 이런 VRE의 내성유전자는 다른균으로 전이가 가능하여 임상적으로 심각한 문제가 되고 있다. 목적 : 본 연구에서는 최근 환자에서 분리되는 VRE을 검출하여 VRE의 항생제 내성유전자형과 내성획득기전에 대해 알아보고 VRE가 vancomycin이 존재하지 않는 환경에서 내성유전자가 자연적으로 소실이 가능한지와 반대로 표준균주 E. faecalis와 E. faecium이 vancomycin 존재 하에서 자연적 내성유전자의 획득이 가능한지를 항생제 감수성과 내성유전자 분석을 통해 알아보고자 한다. 방법 : 2008년 6월부터 2009년 1월까지 종합병원에서 분리된 Enterococcus균주를 Gram stain, Catalase test, 디스크확산법(disk diffusion), 자동동정기기인 Vitek GPI, GPS-451와 PCR을 이용하여 VRE의 항생제 내성의 표현형과 유전자형을 동정하였으며 동정된 VRE은 자연계대배양을 통해 VRE 유전자의 지속성검사를 하였고 항생제 내성획득실험을 위해 표준균주 E. faecalis와 E. faecium을 vancomycin 농도별 차이를 두어 성장속도 변화와 항생제 감수성검사를 실시하였다. 분리된 VRE을 표준균주에 전이시키기 위해 Liquid mating(1:4), Solid mating(1:1)과 Filter mating(1:10)을 이용하여 유전자 전이를 실시하였다. 결과 : 동정된 VRE는 E. gallinarum이 45.4% E. faecium이 54.5%로 검출되었고 E. faecalis는 연구기간동안 검출되지 않았다. 동정된 VRE는 모두 vanA를 가지고 있었고 DNA와 plasmid에서 동시에 가지고 있었다. 표현형이 VanB이지만 vanA을 가지고 있는 vanB-phenotype vanA genotype도 동정되었다. VRE는 표준균주에 비해 다약제내성을 가지고 있었고 B-lactam계의 항생제들과 Imipenem은 모두 내성을 보였다. Chloramphenicol, Tetracycline과 Streptomycin 2000은 대부분 감수성을 보였고 세균의 리보솜에 작용하여 필수단백질 합성을 저해하는 Quinupristin/Dalfopristin과 Linezolid에는 모두 감수성을 보였다. Enterococcus의 species에 따른 항생제 연관성은 없었다. VRE로 동정된 E. faecium과 E. gallinarum을 자연계대배양시 van유전자는 지속성을 보였고 E. gallinarum에서는 감소하였으나 항생제에 의해 다시 회복 되었다. 표준균주가 vancomycin이 함유된 배양에서 걸리는 시간은 E. faecium이 E. faecalis보다 빨리 자랐고 van유전자의 획득 없이도 vancomycin에 내성 또는 중간내성을 보였다. 결론 : 임상에서 자주 분리되는 VRE의 검체는 stool이고 vanA를 가지고 있다. Vancomycin 내성유전자 획득은 자연환경에 의해 이루어지는 것은 아니라 항생제 내성유전자의 전이에 의해 이루어지고 있으며 vancomycin 환경에 따라 vancomycin에 내성이나 중간내성을 보이기도 한다. 특히 E. faecium이 E. faecalis에 비해 항생제 존재 하에 생존 및 항생제 내성유전자 전이가 용이한 것으로 판단된다. 최근 보고된 VRE는 다약제내성을 보이고 있으며 다양한 van gene casette을 구성하고 있으나 아직 어떤 유전자의 변이에 의해 다약제내성이 나타나는지에 대한 연구가 필요하다. Vancomycin-resistant Enterococcus spp (VRE) were isolated from clinic stools, analyzed antibiotics resistant profiles and van gene cassette to determine antibiotics phenotype and genotype. Interactions between insertion of IS1216V and IS1542 genes and antibiotics susceptibility to teicoplanin were compared. Consistence of van gene in VRE cultured in broth without vancomycin by serial passage was determined. Growth time and antibiotics susceptibility of reference strains passaged in broth with different concentration of vancomycin were studied. Finally, gene transfer of van gene from VRE to reference strains(E. faecium and E. faecalis) and two types of Stapylococcus aureus(MSSA and MRSA). VRE strains isolated from stools were E. faecium and E. gallinarum but not E. faecalis. There were 10 VanA and 1 VanB phenotypes among 11 VRE isolates which were classified as vanA genotype with only vanA gene. vanA gene was detected on both of chromosome and plasmid from all of isolates. Isolated VRE showed multi-drug resistant to antibiotics with β-lactamase and imipenem, but sensitive to quinupristin/dalfopristin. There was no relationship between Enterococcus species and multi-drug resistant. IS1216 gene in VRE showing sensitive intermediate to teicoplanin was not detected or weakly detected. Copy numbers of vanA were decreased in E. gallinarum cultured in broth without antibiotics but not in E. faecium. Copy numbers of vanA were recovered in condition of vancomycin. Growth time of reference E. faecium is faster than that of reference E. faecalis in broth with vancomycin. Reference strains cultured in broth with vancomycin showed antibiotics resistant or intermediate without acquisition of van genes. Gene transfer of van gene from VRE to reference strains and two types of Stapylococcus aureus was failed by agar mating, broth mating and filter mating.

(The) Comprehensive Analysis of Genomic, Transcriptomic, and Pathologic Changes after Acquisition of Resistance to Immune Checkpoint Inhibitors

유신혜 서울대학교 대학원 2020 국내박사

Introduction: Immune checkpoint inhibitors (ICI) have emerging role in many cancer types. A certain proportion of patients who are treated with ICI have long-term durable response but finally progress and show acquired resistance to ICI. However, acquired resistance mechanism of ICI has not yet been elucidated. This study analyzed the changes after acquisition of resistance to ICI through genomic, transcriptomic, and pathologic analyses of tumor samples of patients who were diagnosed as ICI-eligible type of cancer such as head and neck cancer or genitourinary cancer, in a comprehensive manner that takes into account both tumor-side (tumor-intrinsic) and immune-side (tumor-extrinsic) Materials and Methods: The patients with immunogenic tumors (renal cell carcinoma, urothelial cell carcinoma, and head and neck squamous cell carcinoma) who received ICI between Dec 2013 and June 2017 were retrospectively analyzed. The patients who experienced response to ICI (complete response, partial response, or stable disease > 6 months) followed by progression and had available formalin-fixed paraffin-embedded tissues were enrolled. Whole exome sequencing, RNA sequencing and multiplex immunohistochemistry were performed on pre-treatment and resistant tumor samples. Tumor mutation burden, mutational signature and acquired resistance-associated somatic mutation were identified. Immune infiltrates, immune-related parameters such as immune checkpoints and immune activation markers, and the components of tumor microenvironment were evaluated. Evaluated parameters were classified into tumor-intrinsic and tumor-extrinsic – local immunity and systemic immunity. Results: A total of 6 patients were analyzed. The median time to acquired resistance was 370 days (range, 210 to 739 days). Patient #1, who was diagnosed as human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma, exhibited evident APOBEC-associated mutational signature in both pre-treatment and post-treatment samples. Resistance tumor tissue of the patient harbored a missense mutation (E542K) in gene encoding PI3KCA, which can activate PI3K-Akt signaling pathway and may result in AR. In this patient, tumor mutational burden increased after ICI, whereas levels of cytotoxic CD8-positive T cells and immune checkpoints such as PD-1, LAG3, or TIM3 were all decreased during AR. In patient #2, multiplex immunohistochemistry and RNA sequencing revealed the higher level of expression of alternative immune checkpoints including PD-1, LAG3 and TIM3 as well as CD8-positive tumor infiltrating lymphocytes were observed in post-treatment tumor than in pre-treatment tumor. Patient #3 showed a stop-gain mutation in gene encoding AXIN2, and patient #4 showed a frameshift deletion mutation in gene encoding TET2. In any of the patients, no significant mutations or copy number alterations of antigen presenting machinery or interferon-γ pathway were detected. Conclusion: This study found that alternative immune checkpoint molecules were elevated after acquisition of resistance to ICI. Moreover, APOBEC-mediated PIK3CA mutagenesis might be a potential mechanism of acquired resistance. 서론: 면역관문억제제는 여러 암종에서 떠오르는 역할을 하고 있다. 면역관문억제제로 치료받은 환자들의 일부에서 장기간 치료 반응이 유지되지만 결과적으로 암이 진행하며 면역관문억제제에 대한 획득 내성을 보인다. 그러나 아직 획득 내성 기전은 잘 알려지지 않았다. 본 연구에서는 면역관문억제제 치료 전후의 유전체, 전사체 및 병리학적 변화를 종양 내적 측면과 종양 외적(면역) 측면에서 통합적으로 보고자, 면역관문억제제에 대해 반응한 이후 획득 내성을 경험한 환자들의 면역관문억제제 치료 전후 암조직을 분석하였다. 방법: 2013년 12월부터 2017년 6월까지 서울대학교병원에서 면역관문억제제를 투여 받은 면역학적 암종 (신세포암, 요로상피세포암 및 두경부암) 환자들을 후향적으로 분석하였다. 면역관문억제제에 대해 반응 (완전 반응, 부분 반응, 혹은 6개월 이상의 안정 병변)을 보인 후 진행하였고, 분석 가능한 포르말린 고정 파라핀 조직이 있는 경우 연구에 포함되었다. 치료 전과 치료 후 내성 조직에 대하여 엑솜시퀀싱 (whole exome sequencing), RNA 시퀀싱 및 다중 면역화학염색 (multiplex immunohistochemistry)를 시행하였다. 암 돌연변이 부담, 돌연변이 원 (mutation signature) 및 획득 내성과 관련된 체성 돌연변이를 조사하였다. 면역세포 침윤, 면역관문 및 면역 활성 인자와 같은 면역 관련 인자들, 종양 미세환경의 구성요소를 분석하였다. 평가된 인자들은 종양 내적 요인 및 종양 외적 요인으로(국소 면역, 전신 면역) 나누어 분류되었다. 결과: 본 연구는 총 6명의 환자에 대해 분석을 하였다. 획득 내성 발생까지의 기간은 중앙값 370일 (범위, 210일 – 739일)이었다. 첫번째 환자는 인유두종 바이러스 양성인 두경부 편평세포암 환자로, 치료 전후 암조직에서 뚜렷한 APOBEC 관련 돌연변이원을 보였다. 이 환자의 내성 시점 암 조직에서는 PIK3CA 유전자에 missense mutation인 E542K가 발생하였는데, 이는 PI3K-Akt 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 획득 내성을 야기할 수도 있다. 이 환자에서는 치료 후 내성 시점에서 종양 돌연변이 부담이 증가한 반면, 세포독성 CD8 양성 T 세포와 PD-1, LAG3, TIM3와 같은 면역관문의 발현은 내성을 획득하는 동안 모두 감소하는 것을 보였다. 반면, 두번째 환자의 다중 면역화학염색과 RNA 시퀀싱 결과에서 치료 전에 비해 치료 후 조직에서 CD8 양성 종양침윤 림프구뿐만 아니라 PD-1, LAG3, TIM3을 포함하는 면역억제성 인자들의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 세번째 환자는 AXIN2 유전자에 stop-gain mutation이, 네번째 환자는 TET2 유전자에 frameshift deletion mutation이 발생하였다. 전체 환자에서 항원 제시 구성 요소 혹은 인터페론 감마 관련 경로에 대한 의미 있는 돌연변이나 복제 수 이상은 발견되지 않았다. 결론: 본 연구에서는 면역관문억제제 치료 후 내성을 획득한 시점에서 면역억제성 인자들의 상승이 관찰되었다. APOBEC에 의해 매개되는 PIK3CA 돌연변이 발생 과정은 획득 내성에 대한 잠재적인 기전이 될 수 있다.

이상 증식 신호 제어를 통한 획득 내성 극복 항암치료 요법에 관한 연구

정성백 서울대학교 대학원 2022 국내박사

임상에서 1차 항암 치료 요법으로 화학항암제가 사용된다. 그러나 독성이 크다는 단점이 있다. 이에 대한 대체 치료제로 표적항암제가 사용된다. 기존의 화학항암제보다 독성이 적다는 장점이 있으나 장기간 투여 받을 시 환자는 이에 대한 내성을 획득하게 되어 재발하는 경우가 빈번하다. 암세포는 항암제에 노출될 때 생존 신호 억제, 세포내 스트레스 유발, 세포사멸 또는 자가포식작용 촉진 등이 나타나는데 이에 대한 회피 기작으로 암세포는 이상 증식 신호를 활성화 시켜 항암제 내성을 획득하게 된다. 유방암은 국내 여성암 중 가장 많이 발병되는 질환이다. 여성 호르몬인 에스트로겐은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER) 양성 유방암의 발달과 성장에 직접적으로 작용한다. 따라서 유방암 치료에 가장 보편적으로 사용되는 요법은 항 호르몬 요법이다. 타목시펜은 에스트로겐 수용체 양성 유방암 진단 환자에게 대표적으로 사용되는 항 에스트로겐 표적항암제이다. 타목시펜은 ER-α에 결합하여 구조 변형을 일으킨 후 신호를 차단하여 유방암의 성장을 억제한다. 그러나 타목시펜을 장기간 투여 받은 환자의 30%가 타목시펜에 대한 항암제 저항성을 획득하게 되는데 현재까지 명확한 대체 치료요법이 없어 이에 대한 기전 연구가 필요하다. 폐암은 국내외 암 발생율이 1위인 종양질환이며 5년생존율은 15%로 암중 사망률 1위이다. 폐암, 특히 비소세포성폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)에서 발암 원인 중 하나는 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 신호의 과도한 활성화이다. 따라서, 이 신호를 매개하는 티로신 키나아제 (tyrosine kinase)의 ATP 결합 부위를 억제하는 ATP 경쟁적 억제제로 EGFR 인산화효소억제제 (tyrosine kinase inhibitor, TKI)가 폐암 치료의 표적항암제로 사용된다. 그러나 EGFR의 tyrosine kinase domain의 활성 돌연변이가 발견된 환자에서 EGFR-TKI에 대한 반응률이 낮고, 반응성이 좋았던 환자도 치료제 복용 10개월 전후로 EGFR-TKI에 대한 내성을 획득하게 되므로 이에 대한 극복 방안에 대해 연구가 필요하다. 폴로유사인산화효소 1 (Polo-like kinase 1, Plk1)은 세포 증식 과정의 세포분열 있어서 핵심적인 키나아제 이다. 본 논문에서 타목시펜 저항성 유방암 세포에서 Plk1 신호가 활성화 되어있으며 이를 억제 시 G2/M 기 진행이 차단되어 세포 증식이 억제되고, 더불어 암 줄기세포능의 억제를 동반하는 암 전이의 억제효과를 관찰하였다. 비장-간 전이 모델을 통하여 동물모델에서 전이가 억제됨도 확인하였다. 따라서 Plk1이 타목시펜 저항성 유방암의 치료 표적이 될 수 있음을 제시 하였다. Plk1의 Polo-box domain (PBD)는 신호전달의 중요한 요소인 기질 결합 부위이다. Plk1 억제제의 개발과정에서 PBD를 표적으로 하는 Plk1 억제 신규 물질은 기존의 Plk1의 ATP 경쟁적 저해제보다 선택성이 우월하여 우수한 효능과 최소화된 부작용이 예측되는 유망한 치료표적이다. 본 논문에서는 404종의 신규 천연물 기원 유도체들을 스크리닝하여 Plk1 Polo-box domain(PBD)를 억제하는 LDD-3051, LDD-3052 화합물들을 도출하였다. LDD-3051, LDD-3051은 Plk1 PBD를 억제하여 S기 차단을 동반하는 암세포 증식의 억제효과를 나타내며, 타목시펜 저항성 유방암 이종이식 모델에서 경구 투여 시 항암효과가 있음을 규명하였다. 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor 1, IGF-1) 노출 시 인슐린유사성장인자 1 수용체(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)의 활성화는 소아 성장과 발달 과정에 중요한 역할을 담당하며 성인에도 지속적으로 작용하여 신체 유지에 필수적인 역할을 하는 호르몬이다. 암세포에서 IGF-1R는 과발현 되어있으며 세포증식 및 전이를 촉진하고 세포사멸을 억제한다. 본 논문에서는 EGFR-TKI에 대한 획득 내성 극복에 관련된 인자를 밝히고자, EGFR-TKI인 제피티닙(gefitnib), 엘로티닙(erlotinib) 혹은 오시머티닙(osimertinib)을 폐암 세포주에 장기간 처리하여 획득 내성을 보이는 암세포주를 구축하였다. 이 세포주들은 IGF-1 포함 8종의 암세포 증식에 관여하는 대표 성장인자를 처리시 EGFR-TKI 저항성 세포에서 IGF-1 대한 감수성이 특이적으로 증가함을 성장신호인Akt 활성화로 확인하였다. 또한, IGF-1R 신호를 억제 시 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복되고 세포자가사멸이 유도됨을 확인하였다. 소포체(endoplasmic reticulum, ER)은 리보솜에서 합성된 단백질들을 샤페론들의 도움으로 안정적인 형태로 완성시키고 미접힘 혹은 잘못 접힌 미성숙 단백질들은 세포질로 운송하여 분해시킨다. 암세포의 특징인 제어되지않는 세포 증식은 과도한 단백질 생합성을 야기한다. 세포는 미성숙 단백질이 누적될 경우 소포체 스트레스(ER stress)가 유발되어 세포사멸을 일으킨다. 암세포는 이에 대한 보호기작으로 미접힘 단백 반응(unfolded protein response, UPR) 신호 및 GRP78을 포함하는 샤페론 단백질들을 활성화하여 과도한 소포체 스트레스로 인한 세포사멸을 회피한다. 또한, UPR 및 샤페론 활성화는 항암제로 인한 세포사멸 유도를 억제하여 항암제 저항성을 유발한다. 본 논문에서는 EGFR-TKI 저항성 세포에서 소포체 스트레스를 수반한 GRP78의 발현 증가를 확인하였으며, IGF-1 처리 시 UPR 신호 활성화 및 GRP78의 발현 증가가 나타난다는 사실을 발견했다. IGF-1R 저해제 처리 시 GRP78의 발현이 억제되어 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복됨을 확인하였고, 이종이식 동물실험을 통해 EGFR-TKI 저항성 세포에서 proteasome 기능 억제를 통한 ER stress 유발물질인 bortezomib과 IGF-1R 저해제 병용투여 시 상승효과가 나타난다는 사실을 밝혔다. 본 논문에서는 항암제 저항성 세포에서 활성화 되는 이상 증식 신호 Plk1과 IGF-1R가 내성 극복의 치료표적임을 규명하였다. 타목시펜 저항성 유방암 세포에서 Plk1신호 억제 시 CSC억제를 수반하는 EMT 억제를 확인하였고, 신규 화합물 LDD-3051, LDD-3052가 Plk1 PBD를 억제하여 항암 효능을 보인다는 사실을 규명하였다. EGFR-TKI 저항성 폐암 세포에서 IGF-1R 신호를 억제 시 소포체 스트레스 조절을 매개하여 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복됨을 확인하였다. 따라서 항암제 획득 내성 암세포의 내성을 제어하는 신규 표적으로 Plk1과 IGF-1R을 제시하며, 이를 활용시 기존 항암제에 대한 내성 극복 치료 방안을 도출 할 수 있을 것으로 기대한다. Although chemotherapy is most commonly used as first-line treatment in cancer patients, disadvantages such as high toxicity is an issue. On the other hand, target therapy carries varied benefits such as higher efficacy/potency, lower cytotoxicity, and orally availability. Despite their various advantages, some patients exhibit innate resistance, or acquire resistance within 10 months or more after receiving treatments. Breast cancer is number one cancer that is most diagnosed in women. Estrogen plays a pivotal role in progression of breast cancer. Anti-hormone therapy is the first-line treatment in breast cancer. Tamoxifen, a selective estrogen receptor modulator, is an anticancer agent that is ubiquitously used for breast cancer. However, within 5 years, ~30% patients who received the treatment acquire resistance and experience relapse. EGFR-TKIs (epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors) are world-widely used target therapy for lung cancer treatment. However, ~80% of patients who showed initial response, acquire resistance to them within 10 months. Thus, studies in underlying mechanism of acquire resistance to EGFR-TKIs are necessary. Therefore, elucidation of the mechanism and discovery of novel target for overcoming target-therapy resistance is necessary. This dissertation demonstrates elucidation of acquired resistance of targeted agents in cancers. Polo-like kinase 1 (Plk1) is a key oncogenic regulator of completion of G2/M phase of the cell cycle. We assessed Plk1 expression in five chemo-resistant cancer cell types and found that Plk1 and its downstream phosphatase Cdc25c were selectively overexpressed in tamoxifen-resistant MCF-7 (TAMR-MCF-7) breast cancer cells. Real-time monitoring of cell proliferation also showed that TAMR-MCF-7 cells were more sensitive to inhibition of cell proliferation by the ATP-competitive Plk1 inhibitor BI2536 than were the parent MCF-7 cells. Moreover, BI2536 suppressed expression of epithelial–mesenchymal transition marker proteins and 3D spheroid formation in TAMR-MCF-7 cells. Using TAMR-MCF-7 cell–implanted xenograft and spleen–liver metastasis models, we showed that BI2536 inhibited tumor growth and metastasis in vivo. In human, Plk family consist of five isoforms (Plk1-5). Plks are serine/threonine kinases characterized by the presence of a C-terminal Polo-Box Domain (PBD), which mediates protein interactions with substrates and regulators. Although Plk1 is an oncogene, other Plk isoforms such as Plk2, Plk3, and Plk5 are tumor suppressors. Several studies reported that Plk1 inhibitor mediates Plk3 inhibition which leads to diminution of anti-tumor effect. In order to overcome undesired inhibition of Plk3, PBD has been suggested as druggable target in several reports. In here, out of 404 compounds we identified novel Plk1 PBD inhibitors, LDD-3051 and LDD-3052, through high-throughput screening (HTS) Plk1 PBD binding assay. LDD-3051 and LDD-3051 suppressed cell proliferation of breast cancer cells via Plk1 PBD inhibition mediated S phase arrest. In TAMR-MCF-7 cell–implanted xenograft, we showed that LDD-3051 and LDD-3052 inhibited tumor growth when orally administrated. Taken together, our results suggest that Plk1 could be a novel target for the treatment of tamoxifen-resistant breast cancer and LDD-3051 and LDD-3052 are novel small-molecules with therapeutic potential for selectively inhibiting PBD of Plk1 in breast cancer. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) signaling pathway contributes in cell development, proliferation, and apoptosis in cancer cells. We assessed IGF1-R expression in 11 lung cancer cells and found that IGF-1R was upregulated in EGFR-TKI acquired resistant cells and selectively sensitive to its ligand, IGF-1. We found that ER (endoplasmic reticulum) stress involved UPR (unfolded protein response) was highly upregulated by IGF-1R activation in EGFR-TKI resistant cells. Combination efficacy of EGFR-TKIs and IGF-1R inhibitors showed that sensitivity to EGFR-TKIs were rescued by IGF-1R inhibition via ER stress regulation in EGFR-TKI resistant lung cancer cells. In this study we demonstrated two bypass/alternative pathways (Plk1 and IGF1-R) that accounts for acquired drug-resistance in cancer. Targeting Plk1 overcome tamoxifen-resistance in breast cancer cells in vitro, in vivo. We reported anticancer effect of the novel natural product derived derivatives; LDD-3051 and LDD-3052. LDD-3051 and LDD-3052 possess inhibitory activity against Plk1, resulting in decreased in proliferative capacity, viability and tumor growth in vivo. Blockade of IGF-1R inhibited Akt activation and restored sensitivity against EGFR-TKIs in EGFR-TKI acquired resistant lung cancer cells. In EGFR-TKI acquired resistant lung cancer cells, UPR/ER stress was upregulated. When we inhibited IGF-1R pathway UPR/ER stress was suppressed and sensitivity against EGFR-TKIs was rescued. Our studies provide chemical and pharmacological information useful in the field of drug-resistance research with regard to anticancer target.

상피성장인자 수용체 억제제 획득 내성 비소세포폐암의 차별적인 에너지 대사 특성을 활용한 치료법 연구

김선태 서울대학교 대학원 2022 국내박사

상피성장인자 수용체(EGFR)는 세포의 생장, 분열, 생존 및 사멸을 조절하는 세포막 수용체이다. 특히 폐암에서 EGFR의 발현이 높고 이는 종양의 생장, 전이를 촉진하고 항암 화학 요법(conventional chemotherapy)에 저항성을 나타낸다. 상피성장인자 수용체 억제제(EGFR-TKIs)는 EGFR 활성 변이에 선택적으로 작용해 폐암환자의 전체 생존율을 올려주었다. 1세대 EGFR-TKIs (게피티닙, 얼로티닙)는 EGFR 엑손 19번 결손 혹은 엑손 21번 L858R 변이에 효과적이다. 하지만 EGFR-TKI의 장기 복용은 10-14 개월 내에 내성을 유발했다. EGFR 엑손 20번의 T790M 변이는 획득 내성에서 가장 빈번하게 발견되는 변이로 3 세대 EGFR-TKI인 오시머티닙은 T790M변이를 표적화하여 등장하였다. 하지만 3 세대 EGFR-TKI 또한 엑손 20번의 C797S변이 등으로 내성 발생이 보고되는 상황이다. 따라서 EGFR-TKI의 획득 내성에 관여하는 신규 표적에 대한 추가 연구가 필요하다. 대사 리프로그래밍(metabolic reprogramming)은 암의 생존을 위한 주요 특성 중 하나이다. 빠른 생장에 수반되는 에너지, 아미노산, 핵산 그리고 산화·환원의 스트레스를 해결하기 위해 변형된 당 대사나 글루타민 대사가 나타난다. 최근 이러한 에너지 대사는 항암제의 주요 타겟으로 활발하게 연구 중이다. 본 연구에서는 1세대 EGFR-TKI 저항성 폐암에서 차별적인 대사적 특징을 찾고자 하였고 이러한 특성을 통해 효과적으로 저항성을 극복할 수 있다는 가능성을 제시한다. 이를 증명하기 위하여 EGFR-TKI 저항성 폐암세포에서 변형된 당 대사와 글루타민 대사의 특징을 탐구하고 해당 대사 특징을 억제하는 약물로 효과적인 항암 억제 효과를 나타내는 지 평가하는 것을 연구 목표로 설정하였다. 먼저 EGFR 표적항암제인 게피티닙과 얼로티닙을 장기간 처리하여 배양한 비소세포성 폐암세포주인 게피티닙 저항성 HCC827 (HCC827 GR), PC9 (PC9 GR)과 얼로티닙 저항성 H292 (H292 ER), H1993 (H1993 ER)을 구축한 후 세포 성장과 EGFR 신호전달 변화를 평가하여 내성 발현을 확인하였다. EGFR-TKI 획득 내성 세포주는 모세포와 비교하여 포도당의 흡수율과 소모량, 그리고 해당과정 수용력(glycolysis capacity)이 낮았다. 주사 전자현미경에서 미토콘드리아의 크기는 비숫하나 전자전달계 조절자에 의한 세포 호흡의 변동폭이나 미토콘드리아 막 전위는 저항성 세포주에서 더 높았다. 또한 총 ATP 생산 대비 미토콘드리아 유래 ATP생산 비중이 모세포보다 높음을 확인하였다. 이러한 EGFR-TKI 저항성 폐암세포주에서 미토콘드리아의 재활성화는 complex 1 억제제인 펜포르민의 타겟으로 작동하며, 실제 펜포르민은 저항성세포에서 모세포보다 더 큰 성장 억제를 보였다. 펜포르민의 처리는 NAD+/NADH 비율과 아스파르트산의 생합성을 억제하고 폐암 이종이식 누드 마우스 모델에서도 EGFR-TKI 저항성 폐암세포에 대한 차별적 암 성장 억제 효과를 나타냈다. EGFR-TKI 저항성 폐암세포에서 해당과정의 핵심효소인 헥소키나아제2과발현은 해당과정 재활성화를 일으켰고, 펜포르민의 성장 억제효과를 회복시켰다. 해당과정과 산화적 인산화 사이에 암세포의 대사적 가소성은 펜포르민의 반응성에 영향을 미친다는 사실을 관찰하였다. 이를 통해 XFp 분석기로 측정한 세포의 대사적 특징을 기반으로 대사적 가소성을 규정하고, 펜포르민의 생장 억제 효과와의 관계를 텐서플로우 기법으로 예측하였다. 글루타민 고갈시 EGFR-TKI 저항성 세포인 HCC827 GR과 H292 ER에서 모세포와 차별적인 생장 억제가 나타났다. 13C5-글루타민을 이용한 GSH의 안정동위원소(isotopologue) 분석에서 GSH 합성에 HCC827 GR이 더 의존적임을 관찰하였다. 글루타민의 고갈은 HCC827 GR에서 더 큰 GSH의 고갈을 수반하였고 세포내 ROS 발생에 취약함을 확인하였다. 반면 H292 ER에서 글루타민은 모세포보다 알파 케토글루타르산으로의 전환율이 높았다. 이에 글루타민의 고갈은 TCA 중간체 감소 및 전자전달계의 활성 감소로 이어져 세포내 총 ATP 생성과 미토콘드리아 유래 ATP 생성 비중의 감소가 나타났다. CB-839는 글루타미나제 억제제로 세포 내 글루타민의 글루탐산으로의 전환을 억제한다. HCC827 GR과 H292 ER은 글루타민 이용에 이질성을 나타내지만 글루타민 대사의 초기 단계를 억제하는 CB-839의 처리는 EGFR-TKI 저항성 세포에서 차별적으로 생장을 억제하고 암세포 증식 표지자인 Ki-67 면적을 감소시켰다. 이상을 종합하면 1) EGFR-TKI획득 내성 세포에서 미토콘드리아의 재활성화가 나타나고 글루타민의 의존도가 높아지며, 2) 이러한 대사적 특징을 통해 기존 임상진입 약물들인 펜포르민과 CB-839가 EGFR-TKI 저항성 폐암세포 치료를 위한 신약 재창출 후보가 될 수 있음을 새롭게 규명하였다. 또한 암세포의 대사 이질성을 확인하고, 이에 따라 달라지는 약물 반응성을 기계학습을 통해 예측할 수 있는 초기 방안을 제시한다. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a cell membrane receptor that regulates cell growth, division, survival, and death. In particular, the expression of EGFR is high in non-small cell lung cancer (NSCLC) and active mutations of EGFR are frequently found, which promotes tumor growth and metastasis, and eventually induce resistance to conventional chemotherapies. EGFR-tyrosine kinase inhibitors (TKis) selectively act on the EGFR mutations and increase overall survival rate in NSCLC patients. First generation agents of EGFR-TKis (e.g., gefitinib and erlotinib) have been effective on NSCLC harboring EGFR exon 19 deletion or exon 21 L858R mutation. However, long-term treatment of EGFR-TKis induces the acquired resistance within 10-14 months. T790M mutation in EGFR exon 20 is the most frequently detected in the resistant tumor tissues, and osimertinib, third generation EGFR-TKi, is highly effective by targeting the T790M mutation. However, clinical results have revealed that long-term use of osimertinib also resulted in resistance due to the C797S mutation in exon 20. As acquired resistance to EGFR-TKi shows a poor clinical prognosis, so further studies are needed. Metabolic reprogramming is one of the key characteristics of cancer survival in tumor microenvironment. Altered glucose or glutamine metabolism appears to meet demands for energy, amino acid, nucleic acids, and oxidation/reduction stress accompanying rapid cell growth. Recently, several energy metabolism pathways have been being studied as potential new targets for the intractable cancer. This study tried to find the distinct metabolic characteristics of EGFR-TKI-resistant NSCLC cell lines, and propose a hypothesis that the resistance can be effectively overcome by interfering these. In order to prove this hypothesis, I tried to identify the characteristics of altered glucose and glutamine metabolisms in EGFR-TKI-resistant NSCLCs and to assess whether the pharmacological inhibitors targeting the altered metabolisms exhibit significant anti-tumor effects in vitro and in vivo. First, gefitinib-resistant HCC827 (HCC827 GR), PC9 (PC9 GR), and erlotinib-resistant H292 (H292 ER), H1993 (H1993 ER) were established by long-term culture with gefitinib or erlotinib, and resistance to the EGFR-TKis was confirmed by cell growth inhibition tests and EGFR signaling changes. EGFR-TKI-resistant NSCLC cell lines (HCC827 GR, H1993 ER) showed the less glucose uptake and glycolysis capacity compared to their parental cell lines. Although morphology of mitochondria was similar in transmission electron microscopy, the oxygen consumption rate (OCR) and the mitochondrial membrane potential (MMP) were higher in the resistant cancer cell lines. Furthermore, in comparison to the parental cells, the contribution ratio of mitochondria derived ATP was higher. Mitochondria reactivation can be targeted by phenformin, a complex 1 inhibitor, and cell proliferation of EGFR-TKI-resistant NSCLC cells was more potently inhibited by phenformin than parental cells. Phenformin treatment suppressed the NAD+/NADH ratio and aspartic acid biosynthesis in HCC827 GR. Xenograft assays using HCC827 and HCC827 GR confirmed that tumor growth inhibition by phenformin was only found in HCC827 GR-implanted mice. In hexokinase-deficient H292 ER, stable overexpression of hexokinase 2 increased glycolysis activity and reversed the growth inhibitory effect of phenformin. Considering a hypothesis that the metabolic plasticity between glycolysis and oxidative phosphorylation determines the anti-cancer effect of phenformin, metabolic plasticity was defined as the metabolic characteristics (OCR and ECAR values) assessed by the XFp analyzer, and the relationship between the growth inhibitory effect of phenformin and metabolic plasticity was analyzed and predicted by TensorFlow. Cell growth of the two acquired-EGFR-TKI-resistant lung cancer cells lines (HCC827 GR and H292 ER) depends on glutamine. In HCC827 GR, glutamine deficiency caused reduced GSH synthesis and, subsequently, enhanced ROS generation relative to their parental cells, HCC827. On the other hand, in H292 ER, glutamine mainly acted as a carbon source for TCA-cycle intermediates, and its depletion led to reduced mitochondrial ATP production. CB-839, a specific GLS inhibitor, inhibited the latter’s conversion of glutamine to glutamate and exerted enhanced anti-proliferating effects on the two acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer cell lines versus their parental cell lines. Moreover, oral administration of CB-839 significantly suppressed HCC827 GR tumor growth in the xenograft model. These findings suggest that glutamine dependency in acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer is heterogeneous and that inhibition of glutamine metabolism by CB-839 may serve as a therapeutic tool for acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer. Collectively, I newly identified in this thesis that 1) oxidative phosphorylation and glutamine metabolism are increased in the several acquired EGFR-TKI-resistant NSCLC cells and 2) safety-proven two agents, phenformin targeting mitochondria complex 1 and CB-839 targeting glutaminase could be considered potential therapeutic agents against EGFR-TKI resistant NSCLC.