Effects of follicular factors on in vitro maturation of bovine cocytes

김광식 Kyoto University 1997 해외박사

본 연구는 소 난자의 체외성숙, 수정, 발생에 있어서 난포액과 난포세포의 효과에 대하여 실험하였다. 1. 우난자의 체외성숙에 있어서 우난포액의 효과 1-5㎜의 소난포로부터 난포액을 채취하여 체외성숙 배지에 10, 30, 60% 첨 가하고, 난자성숙용 배양액으로 하고, 1-5㎜ 난포로부터 채취한 난자를 난자 성숙용 배양액 200㎕당 30개를 도입하여 24시간 성숙배양하고, 동결 융해시킨정자와 6시간 수정, 과립막세포의 단층과 체외수정 후 9일간 체외배양하였다.그 결과 10% 난포액을 첨가한 배양액에서 성숙시킨 난자는 수정후 배반포배 발생율이 대조구(PVP)와 동일하였으나, 60%에서는 유의하게 저하되었다(P<0.05) 한편 난포액중에서 성숙시킨 난자로부터 발생한 배반포배의 세포수는 대 조구에 비하여 유의하게 증가되었으며 (P<0.01), 난포액을 분자량에 의해 분 획하여 성숙배양액에 첨가한 결과, 분자량 10,000이상의 분획중에서 성숙시킨난자가 체외수정후 배반포의 발생율이 대조구와 분자량 10,000이하에 비하여 유의하게 증가되었다(P<0.01). 2. 우난자의 체외수정에 있어서 유난세포의 효과 난자에 부착된 난구세포 (방사관세포부착난자 ; CO) 또는 방사관세포(裸化 卵子 ; DO)를 성숙 배양전에 난자로부터 분리하고, 분리된 세포를 재첨가하여난자를 성숙배양하였다. 그 결과 CO에 있어서는 분리된 세포를 첨가하지 않 은 CO와 동일하였다. 그러나 DO는 세포의 재첨가에 의하여 수정후 8-16세포 의 발생율이 증가되었다. 소난자의 체외성숙개시와 난구세포가 부착된 난자 가 DO 또는 CO에 비하여 늦게 개시되었으나, 24시간 성숙시킨 난자의 수정율 도 동일하였다. 한편, 난자로부터 난구세포를 성숙배양개시 후, 16시간 이내에 분리할 경우, 수정후의 배발생율이 유의하게 저하되었다. 이상의 결과에 서, 우난자의 충분한 세포질성숙에는 적어도 방사관세포의 부착이 필요하며, 난자의 발생능력을 조절하는 인자는 성숙배양개시 후 16시간 이내에 세포로부터 난자에 부여되는 것으로 추측된다.

돼지 난자의 성숙에서 표피 성장 인자에 의해 조절되는 EGFR, COPG2, Sec61β와 골지체의 효과

오해인 강원대학교 2016 국내석사

난자는 성숙하는 동안 다양한 이벤트를 겪게 되고, 많은 물질들이 난자 성숙에 필요하다. 특히 풍부한 포도당(glucose)는 난자의 핵과 세포질이 성숙되는 동안 필수적으로 필요한 물질이다. 더불어 난자가 성숙되는 동안 세포 골격과 세포 소기관의 재구성에 의해 난자는 아데노신 3인산(adenosine triphosphate, ATP)를 필요로 하게 되고, 결과적으로 다양한 세포 소기관은 난자가 성숙되는 동안 참여하여 성숙과정을 이루어질 수 있도록 도와준다. 따라서 미토콘드리아의 기능이 상실될 경우 감수분열 시 염색체의 분리, 성숙과 수정의 실패로 인해 난자의 전반적인 발달에 장애를 일으키게 된다. 소포체의 경우에는 Ca2+을 저장소이며 다양한 세포의 신호들을 통하여 세포질로 Ca2+을 방출한다. 이 이벤트는 난자가 성숙되는 동안 난자의 호르몬, 성장인자, 항산화제 분비를 자극한다. 또한 성장인자는 난자의 핵 성숙을 자극시킨다. 예를 들면 돼지 난자에서 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)는 난자의 핵 성숙을 자극시킨다. 따라서 본 실험의 목적은 돼지의 난자가 체외성숙 되는 동안 EGF에 의하여 조절되는 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 골지체, COPG2(Coatomer Protein Subunit Gamma 2)와 Sec61β(secretory 61 beta)의 발현 및 위치 변화를 알아보는 것이다. 그 결과 EGFR의 발현은 난자의 세포질에서 이루어졌으며 유의적인 차이는 없었으나 처리군(7.41±2.14) 보다 대조군 그룹(10.93±0.68) 에서 더 높은 발현율을 나타냈고, GM-130의 발현 또한 난자의 세포질에서 이루어졌고 처리군(14.54±0.42)보다 대조군(17.30±0.82)에서 유의적으로 더 높게 나타났다(p<0.05). Sec61β의 발현도 난자의 세포질에서 이루어졌고 처리군(10.16±0.57)보다 대조군(17.81±1.17)에서 유의적으로 높게 발현되었으며(p<0.05), COPG2의 발현 또한 난자의 세포질에서 이루어지며 대조군(12.01±1.21)에서 처리군(7.16±0.50)에서 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 또한 double stain한 결과 대조군에서는 EGFR의 발현이 GM-130의 발현보다 강하였고, 처리군에서는 EGFR의 발현이 미약하게 나타났다. 또한 Sec61β의 경우 처리군보다 대조군에서 더 강하게 발현되었으며, COPG2와 GM-130의 경우 두 인자의 발현수준은 비례적으로 증가되었으며, 대조군에서 처리군보다 강하게 발현되었다. 또한 이러한 메커니즘이 최종적으로 난자의 핵성숙에 영향을 미쳤는지 확인하기 위하여 핵형검사를 실시한 결과 난자의 성숙율은 EGF를 metaphase I과 II 모두에 첨가한 대조군 그룹이(60.0±2.2) 모두 첨가하지 않은 그룹(13.2±7.3) 보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 결론적으로, COPG2인자의 활성화가 증가함에 따라 골지체의 활성화 또한 비례적으로 증가하는 사실을 알 수 있었고, Sec61β와EGFR의 활성화가 돼지 난자에서도 비례적으로 증가된다는 사실을 규명할 수 있었다. 최종적으로 난자의 성숙동안 여러 가지 소기관들 중 골지체의 역할이 잠재적으로 나타나고 있음을 알 수 있는 결과였으며, 골지체가 역할을 수행하기 위하여 지원 역할을 해주는 인자들인 EGFR, Sec61β와 COPG2 또한 성숙과정이 이루어짐에 따라 더욱 활성화된다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 사실들을 종합해보았을 때, 표피 성장 인자 수용체, 골지체, COPG2와 Sec61β는 표피 성장 인자의 첨가에 기인하여 난자의 성숙과정 일부에 잠재적으로 기여했다는 결과를 도출할 수 있었다.

생쥐卵子의 核成熟과 透明帶硬化가 體外受精과 胚發生에 미치는 影響

이상진 建國大學校 大學院 1990 국내박사

本 硏究에서는 ICR 系統의 생쥐로 부터 排卵直後의 성숙한 卵子와 卵巢內 未成熟 卵子를 채취하여 固定, 染色한 다음, 核成熟度, 體外受精率 및 胚發達率을 검토하는 한편, 卵子의 體外培養時 발생하는 透明帶 硬化現狀의 原因을 파악하고, 이를 극복하기 위한 방법으로 透明帶 硬化環狀을 억제하는 peroxidase inhibitors와 tyrosine analog를 培養液에 첨가하여 그 효과를 분석함과 동시에 zona drilling 技法을 활용하여 體外受精의 효율을 증진시키고자 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 體外受精用 卵子의 一般的 特性 1) 排卵은 hCG 주사후 11-13시간째에 일어나기 시작하여 14시간째에는 모든 생쥐에서 排卵이 유도되었으며, 排卵된 卵子의 核成熟度는 metapse Ⅰ, anaphase Ⅰ, telophase Ⅰ 및 metaphase Ⅱ의 상태였고, 주로 metaphase Ⅰ과 metaphase Ⅱ 단계의 卵子가 대부분이었다. 또 metaphase Ⅰ의 核狀을 가진 卵子는 시간의 경과와 더블어 성숙하는 경향을 보였다. 2) 受精能을 획득한 精巢上體尾部의 精子로 hCG 투여후 12, 13, 14 및 15시간째에 채취한 卵子를 體外受精시킨 결과, 受精率은 각각 77.4, 76.1, 76.9 및 68.1%이였으나, 채취 시간이 hCG투여 20시간까지 지연될수록 受精率은 감소하는 경향을 보였으며, 受精이 되지않는 卵子의 核狀은 주로 metaphase Ⅰ(2.4-31.1%)과 metaphase Ⅱ(32.0-38.8%) 단계가 대부분이었다. 3) 排卵된 卵子를 체외에서 0, 3, 6, 9 및 12시간 동안 培養했을 때의 體外受精率은 卵丘細胞가 부착된 것은 각각 70.4, 65.0, 57.1, 65.1 및 20.5%였고, 卵丘細胞가 제거된 것은 각각 67.5, 46.2, 43.6, 34.8 및 22.3%로써, 卵丘細胞가 부착된 것이 양호했으며, 兩者 다같이 培養시간이 연장됨에 따라 體外受精率은 감소하는 경향을 보였다. 즉 體外培養 3, 6, 및 9시간째의 體外受精率은 0시간째의 그것과 유사하였으나, 培養 12시간째는 有意하게 낮아졌다(P<0.01). 4) 체외에서 0시간 동안 培養된 다음, 受精된 卵子가 胚盤胞期로 발달하는 比率은 卵丘細胞가 부착된 것은 43.5%였고, 卵丘細胞가 제거된 것은 34.0%로써, 前者가 後者보다 양호하였으나, 有意差는 인정되지 않았다. 그러나 培養時間을 6시간과 9시간으로 연장했을 때에는 卵丘細胞가 부착된 것이 제거된 것보다 有意하게 높았다(P<0.01). 2. 卵子의 核成熟과 體外受精 1) 排卵된 卵子를 供試하여 卵丘細胞가 體外受精에 미치는 영향을 검토한 결과, 卵丘細胞를 제거하지 않은 卵子의 體外受精率은 52.4%인데 대하여 卵丘細胞를 제거한 卵子의 그것은 49.8%로 兩者사이에 有意差가 인정되지 않았다. 또 第 1 極體를 가진 成熟卵子와 그것을 가지지 많은 未成熟 卵子의 體外受精率은 平均 50.0%와 45.7%로 兩者사이에는 역시 有意差가 없었다. 2) 체외에서 성숙된 卵巢內 卵母細胞의 核狀은 GV, condensing GV, prometaphase Ⅰ, metaphase Ⅰ, anaphase Ⅰ, telophase Ⅰ, chromatin mass, prometaphase Ⅱ 및 metaphase Ⅱ等이었으며, 이들 중, metaphase Ⅰ의 核狀은 培養 3시간째 부터 나타나기 시작하여 8시간째에는 30.0%로 증가하였다. metaphase Ⅱ의 核狀은 培養 10시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간부터 17시간사이에는 32.8-53.7%로 증가하였다. 3) 卵丘細胞를 제거한 다음, 체외에서 성숙시킨 卵巢內 卵母細胞는 培養 3시간째부터 metaphase Ⅰ의 核狀이 나타나기 시작하여 培養 17시간째에는 3.6-46.7%로 차츰 증가하다가 그후 다시 감소하는 경향을 나타내었고, metaphase Ⅱ의 核狀은 培養 10시간째 부터 관찰되기 시작하여 17시간째에는 38.6%로 시간의 경과와 더불어 계속 증가하였다. 또 hCG 투여후 12시간 까지 매 時間別로 卵巢內 卵母細胞를 회수하여 체내에서 성숙한 卵母細胞의 核狀을 관찰한 결과, metaphase Ⅰ은 6시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간째에는 4.5-31.5%로 증가하였고, metaphase Ⅱ 단계의 卵子는 9시간째 부터 나타나기 시작하여 12시간째는 56.1%에 달했다. 4) hCG 투여후 매 2시간 간격으로 卵子를 채취하여 즉시 授精시킨 다음, 培養 5시간째에 회수하여 受精 여부를 관찰한 결과, 모든 核狀의 卵子에서 精子의 침입이 확인되었으며, hCG 투여후 0, 2, 4, 6, 8 및 10시간째에 채취된 卵子의 精子侵入率은 각각 13.3, 16.7, 22.4, 16.1, 26.8 및 47.5%로 hCG 투여후 卵子 채취까지의 시간이 지연될수록 精子 侵入率도 점차 증가하였다. 5) HCG 주사후 7, 8, 9 및 10시간째에 회수된 卵子를 체외에서 授精시틴후 1시간째에 회수하여 培養한 결과, 受精된 卵子가 2-細胞期로 발달하는 比率은 각각 29.6, 30.7, 36.0 및 47.7%였으며, 胚盤胞로의 發達率은 각각 4.2, 11.1, 8.3 및 11.5%로써, hCG 투여후 卵子를 회수하기 까지의 시간이 연장될수록 體外發生率은 높아지는 경향을 보였다. 6) hCG 주사후 10시간째에 회수된 排卵直前의 卵母細胞틀 0, 2, 4 및 6시간 동안 前培養 처리를 실시한 결과, 第 2 減數分烈의 中期까지 성숙한 卵子의 比率은 각각 15.8, 36.4, 47.5 및 66.7%로 前培養 시간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였으며, 특히 前培萎 6시간째에 회수된 卵子의 66.7%는 排卵卵子의 62.3%보다도 오히려 양호하였다. 7) hCG 주사후 10시간째에 회수한 排卵直前의 卵母細胞를 0, 2, 4 및 6시간 동안 前培養 處理를 실시한 다음, 體外受精을 유도한 결과, 卵丘細胞가 제거되지 않은 卵子의 경우는 각각 41.0, 58.7, 68.7 및 75.6%였고, 卵丘細胞가 제거된 裸化卵子의 경우는 각각 50.0, 45.1, 37.8 및 39.2%로써, 특히 卵丘細胞가 부착된 卵子의 授精率은 前培養 시간의 연장과 더불어 증가했으나, 裸化卵子의 경우는 이와는 반대 경향을 보였다. 또 이렇게 受精된 卵子를 체외에서 培養할 결과, 桑實胚와 胚盤胞까지 발달하는 比率은 卵丘細胞가 제거되지 않은 경우는 각각 48.4, 57.1, 57.5 및 65.5%와 28.1, 39.3, 42.5 및 44.0%었고, 裸化卵子의 경우는 각각 23.4, 32.6, 35.6 및 34.5%와 12.5, 32.6, 24.4 및 15.5%로저, 受精率의 경우와 마찬가지로 卵丘細胞의 긍정적 효과가 인정되었다. 8) PMSG 투여후 채취한 卵巢內 卵母細胞를 채외에서 15-17시간 동안 培養한 다음 體外受精을 유도한 결과, 卵丘細胞가 부착된 卵子의 體外受精率은 31.7%였고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 그것은 22.2%로써, 排卵된 卵子를 供試한 對照區의 76.9% 보다는 有意하게 낮았으나(P<0.05), 卵丘細胞의 有·無에 따른 차이는 인정되지 않았다. 또 이렇게 受精된 受精卵이 체외에서 발달하는 比率은 각각 17.1%와 3.3%로써, 排卵된 卵子의 54.2%보다 有意하게(P<0.01) 낮았다. 3. 透明帶 硬化現狀과 體外受精 1) 未受精卵, 授精後 受精에 실패한 老化卵子 및 前核期 受精卵의 透明帶의 溶解에 소요되는 시간은(t_(50))는 각각 10.0±4.9, 20.2±5.8 및 32.2±5.9분으로써, 溶解速度는 未受精卵이 가장 빨랐고, 이어 受精에 실패한 老化卵子였으며, 前核期 受精卵이 가장 늦었다. 2) 排卵된 卵子를 체외에서 0, 3, 6, 9 및 12시간 동안 培養했을 때, 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 卵丘細胞가 부착된 卵子는 각각 13.8±6.2, 11.0±4.5, 20.7±3.1 및 28.0±3.0분이었고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 그것은 각각 22.3±3.5, 21.0±4.1, 30.0±1.0 및 33.5±3.5분으로써, 兩者 다같이 培養시간이 길어질수록 溶解速度는 떨어졌다. 그리고 total hardening은 卵子細胞가 부착된 卵子의 경우, 培養 6시간째 까지는 인정되지 않았으나, 9시간째 부터 나타나기 시작했고, 卵丘細胞가 제거된 卵子의 경우는 透明帶 硬化現狀이 더욱 신속하게 그리고 현저하게 나타났다. 3) PMSG 처리후, 46-48시간째에 회수한 卵巢內 卵母細胞물 체외에서 0, 5, 10 및 15시간 동안 培養한 결과, 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 卵丘細胞가 부착된 卵母細胞는 각각 3.0±2.5, 10.5±4.5, 18.3±5.7 및 24.5±1.5분이었고, 卵丘細胞가 제거된 卵母細胞는 각각 3.0±2.5, 14.0±1.6, 26.2±3.3 및 32.0±4.1분으로써, 卵丘細胞의 有·無에 관계없이 體外成熟 시간이 연장될수록 溶解速度는 떨어졌고, 특히 卵益細胞가 제거된 卵子의 경우가 현저했는데 이는 卵丘細胞가 透明帶 硬化現狀을 억제하기 때문인 것으로 생각된다. 4) Ca-ionophore를 처리한 다음, 1, 2 및 3시간 동안 培養한 卵子의 透明帶 溶解에 소요되는 시간은 각각 25.0±1.9, 31.6±4.2 및 40.5±4.5분이었고, DMSO 處理卵子의 그것은 각각 9.7±3.7, 10.8±1.5 및 15.5±1.8분으로써, Ca-ionophore의 處理에 의해 有意하게 透明帶 硬化現狀이 유기되었다. 5) Ca-ionophore(20μM) 培養液에 peroxidase inhibitors인 phenylhyrazine, glycine ethyl ester, sodium sulfite 및 sodium azide를 첨가한 결과, 透明帶 硬化現狀의 抑制效果가 가장 높은 것은 glycine ethyl ester였고, 이어 sodium sulfite였으며, phenylhydrazine과 sodium azide가 가장 낮았다. 또 Ca-ionophore로 처리된 卵子에 tyramine(12.5mM)을 첨가하여 2시간 동안 培養한 결과, 透明帶 硬化現狀이 억제되었으며, 그 抑制效率은 14.3%였다. 6) 培養液에 外因性 peroxidase인 horseradishperoxidase를 첨가한 결과, 透明帶 溶解에 소요되는 시간이 연장되는 것으로 보아 透明帶 硬化現狀을 일으키는 原因物質은 ovoperoxidase라고 판단되었다. 7) Peroxidase inhibitors와 tyrosine analog를 體外受精用 培養液에 첨가한 결과, glycine ethyl ester, sodium sulfite 및 sodium azide 等과 같은 inhibitors 添加區에서는 受精에 供試된 모든 卵子가 퇴행하였고, phenylhydrazine과 tyramine添加區의 受精率은 각각 62.3%와 88.2%로써 透明帶 硬化現狀의 실질적인 抑制效果가 인정되었다. 그러나 이러한 효과도 體外成熟 卵巢內 卵母細胞에 대해서는 인정되지 않는 점으로 보아 受精卵 혹은 單位發生卵의 경우와는 달리 體外成熟 卵巢內 卵母細胞의 透明帶 硬化現狀에는 ovoperoxidase가 관여하지 않는 것으로 생각된다. 4. Zona Drilling과 醴外受精 1) 體外受精에 있어서 精子濃度를 10^(6), 10^(5), 10^(4), 및 10^(3)/ml로 조정했을 때의 體外受精率은 zona drilling 처리를 실시하지 많은 卵子의 경우는 각각 58.0, 52.0, 12.0 및 8.0 %였고, Drilling 處理를 실시한 卵子는 각각 86.0, 81.0, 70.0 및 50 %로 모든 精子濃度에서 處理區의 성적이 對照區의 그것보다 有意하게 높았다(P<0.01). 특히 處理區의 경우, 精子濃度가 가장 낮은 10^(3)/ml에서도 50% 이상의 높은 受精率이 얻어졌다. 그러나 多精子 侵入率은 精子濃度에 관계없이 對照區와 處理區 다같이 10%이하였다. 또 精子濃度別로 受精된 卵子가 胚盤胞로 발달하는 比率은 處理區는 각각 51.4, 40.5, 23.3 및 17.4%인데 비해 對照區의 그것은 각각 35.7, 26.3, 0 및 0%로 處理區의 성적이 양호하였다. 2) PMSG을 처리한 후, 46-48시간째에 채취한 卵巢內 卵母細胞물 체외에서 15-17시간 동안 성숙시킨 다음, 卵丘細胞를 제거하고, zona driling處理를 실시하여 受精된 卵子의 體外發生을 조사한 걸과, 對照區의 體外受精率은 31.7%인데 비해 zona drilling 處理區의 그것은 51.4%로써, 有意(P<0.05)하게 높았다. 處理卵子中에서도 第 1 極體를 가진 成熟卵의 體外受精奉率은 58.3%인데 대해 第 1 極體를 가지지 않은 未成熟卵의 그것은 23.3%로써, 成熟卵의 受精率이 未成熟卵의 그것보다 有意하게 높았다(P<0.05). 또 zona drilling된 卵子가 受精後, 2-細胞期 까지 발달하는 比率은 第 1 極體를 가진 成熟卵의 경우는 60.0%인데 비해 第 1 極體를 가지지 않은 未成熟卵의 그것은 45.2%로써, 兩區間에 有意차는 인정되지 않았다. 그러나 第 1 極體의 有·無에 관계없이 zona drilling處理後 受精된 卵子가 2-細胞期로 발달하는 比率은 平均 57.5%로 對照區의 84.3%보다 有意하게 낮았다(P<0.01). 또 桑實胚와 胚盤胞期로 발달하는 卵子의 比率은 處理區의 경우, 각각 23.8%와 19.0%로써, 對照區의 22.9%와 17.1%와는 有意差가 인정되지 않았다. 3) hCG 주사후 14-16시간째에 회수된 排卵卵子를 體外受精시킨 후, 受精에 실패한 卵子을 zona drilling한 다음, 再授精을 실시한 결과, 體外受精率은 83.5%로써, 對照區의 34.7%보다 有意하게 높았으나(P<0.01), 受精된 卵子가 胚盤胞로 발달하는 比率은 18.6%로써, 對照區의 27.3%보다 낮았다. These experiments were carried out to investigate whether the nuclear maturation and zona hardening of oocytes affect in vitro fertilization and whether the application of zona drilling elevate tile rate of in vitro fertilization of oocytes recovered from ICR strained mice. The rates of nuclear maturation, in vitro fertilization, and embryonic development were examined in the ovulated mature and the ovarian immature oocytes after fixing and staining them. In addition, it was investigated to explain the phenomena and causes of zona hardening which occurred in cultured oocytes in a chemically defined medium. Finally, to study the effect of micromanipulation and acid tyrode's solution, the rates of in vitro fertilization and embryonic development of oocytes were examined after zona drilling and after adding peroxidase inhibitors and tyrosine analogues to culture medium. The results from these experiments are summarized as follows : 1. Physiological characteristics of mouse oocytes for in vitro fertilization. 1) Ovulation began at 11-l3hr and occured in all mice at 14hr after hCG injection. In the nuclear maturation of recovered oocytes, most of them were at metaphase Ⅰ and metaphase Ⅱ stages and the rest were at anaphase Ⅰ and terophase Ⅰ stages, indicating that oocytes at metaphase Ⅰ were further developed with de laying the oocyte recovery. 2) When oocytes were inseminated with capacitated epididymal spermatozoa, the rates of in vitro fertilization of oocytes recovered at 12, 13, 14, and 15hr after hCG injection were 77.4, 76.1, 76.9, and 68.1%, respectively, showing the declined rates with delaying the time of oocyte recovery to 20hr after hCG injection. Most of unfertilized oocytes were at the stages of metaphase Ⅰ (2.4-31.1%) and metaphase Ⅱ (32.0-38.8%). 3) The rates of in vitro fertilization of oocytes cultured for 0, 3, 5, 9, and 12hr were 70.4, 65.0, 57.1, 65.1, and 20.5%, respectively, in cumulus-intact oocytes and 67.5, 46.2, 43.5, 34.8, and 22.3%, respectively, in cumulus-free oocytes, showing the higher rates in cumulus-intact oocytes and the declined rates with increasing the time of culture regardless of the presence or absence of cumulus eel Is. In fact, the fertilization rates were no differences between the cultured oocytes for 3-9hr and for Ohr(control) hut the rates of cultured oocytes for 12hr were significantly decreased comparing to those of control (P<0.01). 4) The embryonic developmental rates of fertilized oocytes without preincubation to blastocysts were 43.5% in cumulus-intact oocytes, and 34.0% in cumulus-free oocytes. These rates were slightly higher in cumulus-intact oocytes than in cumulus-free oocytes but were no significant differences. However, in 1.he cultured oocytes for 6 and 9hr, the rates of cumulus-intact oocytes were significantly higher than those of cumulus-free oocytes (P<0.01). 2. The nuclear saturation and in vitro fertilization of oocytes. 1) In the experiment to investigate the effect of cumulus cells on in vitro fertilization, the fertilization rates were 52.4% in cumulus-intact oocytes and 49.8% in cumulus-free oocytes, showing no significant effect of cumulus cells. Similarily, there were no significant differences between the rates, 50.0%, of mature oocytes with first polar body and 45.7% of immature oocytes without first polar body. 2) The stages of nuclear maturation of ovarian oocytes matured in vitro were germinal vesicle(GV), condensing GV, prometaphase Ⅰ, metaphase Ⅰ, anaphase Ⅰ, terophase Ⅰ, chromatin mass, prometaphase Ⅱ, and metaphase Ⅱ. The oocytes at metaphase Ⅰ appearing at 3hr of culture increased to 80% of examined oocytes at 8hr of culture, while the oocytes at metaphase Ⅱ appearing at 10hr of culture increased to 32.8-53.7% at 12hr of culture. 3) Of the ovarian oocytes matured in vitro without cumulus cells, the metaphase Ⅰ oocytes appearing at 3hr of culture gradually increased to 3.5-46.7% of examined oocytes at 17hr of culture and then decreased. The metaphase Ⅱ oocytes appearing at 10hr of culture increased to 38.6% at 17hr of culture, In the nuclear maturation of ovarian oocytes recovered every hours for 12hr after hCG injection, the oocytes at metaphase Ⅰ appearing at 6hr of culture increased to 4.5-31.8% at 12hr, while the oocytes at metaphase Ⅱ appearing at 9hr increased to 56.1% at 12hr. 4) In the fertilization of oocytes inseminated with spermatozoa and incubated for 5hr, the sperm penetrated oocytes were found at every stages of nuclear maturation. The peneration rates of oocytes recovered at 0, 2, 4, 6, 8, and 10hr after hCG injection were 13.3, 16.7, 22.4, 16.1, 26.8, and 47.5%, respectively, shooing the increased rates with delaying the time of oocyte recovery. 5) Of fertilized egg of oocytes recovered at 7, 8, 9, and 10hr after hCG injection, inseminated, and cultured for 1hr, the developmental rates to 2-cells were 29.6, 30.7, 36.0, and 47.7%, and to blastocysts were 4.2, 11.1, 8.3, and 11.5%, respectively, according to the tire of oocyte recovery. These results suggested that the developmental rates were increased with delaying the time of oocyte recovery after hCG injection. 6) Of preovulatory oocytes recovered 10hr after hCG injection and preincubated for 0, 2, 4, and 6hr, the oocytes at metaphase Ⅱ were 15.8, 36.4, 47.5, and 65.7%, respectively, shoring the more metaphase Ⅱ oocytes among them preincubated for longer time. Especially, the oocytes preincubated for 6hrs were 66.7% at metaphase Ⅱ more than 62.3% of the ovulated oocytes. 7) Of preovulatory oocytes recovered 10 after hCG injection and preincubated for 0, 2, 4, and 6hr, the rates of in vitro fertilization were 41.0, 58.7, 68.7, and 75.6%, respectively in cumulus-intact oocytes and 50.0, 45.1, 37.8, and 39.2%, respectively in cumulus-free oocytes. These data indicated that the rates were improved with increasing the incubation time in cumulus-intact oocytes but decreased in cumulus-free oocytes. Moreover, the embryonic developmental rates of these fertilized oocytes to morula and to blastocysts were 48.4, 57.1, 57.5, and 65.5%, and 28.1, 39.3, 42.5, and 44.0%, respectively in cumulus-intact oocytes, and 23.4, 32.6, 35.6, and 34.5%, and 12.5, 32.6, 24.4, and 15.5%, respectively in cumulus-free oocytes. As shown in the fertilization rates, the positive effect of cumulus eel Is was observed. 8) Of ovarian oocytes recovered after PMSG infection and preincubated for 15-l7hr, the rates of in vitro fertilization were 31.7% in cumulus-intact oocytes and 22.2% in cumulus-free oocytes, respectively. These rates were significantly lower than 75.9% of ovulated oocytes(P<0.05) but not different between the cumulus intact and free oocytes. Their embryonic developmental rates to blastocysts were 17.1 and 3.3% in the cumulus intact and free oocytes, respectively, showing the significant lower rates than 54.2% of ovulated oocytes(P<0.01). 3. Zona hardening and in vitro fertilization. 1) The time for zona lysis(t_(50)) of unfertilized oocytes, unfertilized oocytes at first insemination, and zygotes were 10.0, 20.2, and 32.2min., respectively, shoring the fast lysis occured in unfertilized oocytes. 2) T_(50) of ovulated oocytes incubated for 0, 3, 6, 9, and 12hr were 13.8, 11.0, 20.7, and 28.0min., respectively in cumulus-intact oocytes, and were 22.3, 21.0, 30.0, and 33.5min., respectively in cumulus-free oocytes. These results showed the longer oocytes incubated, the greater t_(50) were, regardless of the presence or absence of cumulus cells. In addition, total hardening was not observed at 6hr but at 9hr of culture in cumulus-intact oocytes. This phenomenon appeared obviously at the shorter times of culture in cumulus-intact oocytes compared to cumulus-free oocytes. 3) Of ovarian oocytes recovered 46-48hr after PMSG injection and incubated for 0, 5, 10, and 15hr, t_(50) were 3.0, 10.5, 18.3. and 24.5 nin., respectively in cumulus-intact oocytes and 3.0, 14.0, 26.2, and 32.0min., respectively in cumulus-free oocytes, shoring the greater t_(50) with increasing the incubation time of oocytes. T_(50) in cumulus-free ooeytes were apparently greater than those in cumulus-intact oocytes, shoring that cumulus cells prevented zona hardening. 4) Of incubated oocytes for 1, 2, and 3hr after Ca-ionophore treatment, t_(50) were 25.0, 31.6, and 40.5min., respectively. T_(50) of those oocytes after DMSO were 9,7, 10.8, and 15.5min., respectively. These data were shown that Ca-ionophore induced zona hardening more effectively than DMSO. 5) In the experiment to study the effects of reroxidase inhibitors, i.e. phenylhydrazine, glycine ethyl ester, sodium sulfite, and sodium azide on zona hardening of ionophore treated oocytes, glycine ethyl ester were the most effective to block zona hardening and sodium sulfite was followed, while phenylhydrazine and sodium azide had a little effect. In addition, the inhibition of zona hardening of Ca-ionophore treated oocytes by 2hr incubation with tyramine(12.5mM) was observed and its rate was 14.3%. 6) Addition of exogeneous peroxidase, horseradishperoxidase to culture media increased the t_(50) of oocytes, indicating that the ovoperoxidase is a inducing factor of zona hardening. 7) In the experiment to examine the effect of peroxidase inhibitors and tyrosine analogue on in titre fertilization, the treated oocytes with glycine ethyl ester, sodium sulfite, or sodium azide were degenerated, while the treated oocytes with penylhydrazine or tyramine were fertilized in vitro at 62.3 and 88.2%, respectively, showing that tyrosine analogue inhibited the zona hardening. However, they had no significant effect on oocytes matured in vitro. Therefore, ovoperoxidase may not be involved in zona Hardening of in vitro matured oocytes but in zona hardening of embryos or parthenogenetic oocytes. 4. Zona drilling and in vitro fertilozation. 1) The fertilization rates of oocytes inseminated with different concentrations 10^(6), 10^(5), 10^(4), and 10^(3)/ml of sperm were 55.0, 52.0, 12.0, and 8.0%, respectively without zona drilling and 86.0, 81.0, 70.0, and 54.0%, respectively with zona drilling, shoring the significantly higher rates after zona drilling(P<0.01). Remarkably, the rates of zona drilled oocytes were more than 50% at the lowest concentration, 10^(3)/ml of sperm. The polyspermy rates of intact and zona drilled oocytes were similarly less than 10% regardless of sperm concentration. The embryonic developmental rates of fertilized oocytes to blastocysts were 51.4, 40.5, 23.3, and 17.4%, respectively in zona drilled oocytes and 35.7, 26.3, 0, and 0%, respectively In intact oocytes according to sperm concentrations. 2) The fertilization rates were 51.4% in oocytes recovered 4G-48hr after PMSG injection, removed cumulus cells, drilled zona pallucida, and then inseminated with sperm. These rates were significantly higher than the rates, 31.7% of untreated oocytes(P<0.05). Among the treated oocytes, the fertilization rates of oocytes with first polar body were 58.3%, while the rates of immature oocytes without first polar body were 46.2%, showing the significantly higher rates in the treated oocytes. There were no significant differences in the developmental rates to 2-cells between oocytes with and without first polar body, showing the rates, 60.0% and 46.2, respectively. However, the mean of these rates of zona drilled oocytes was 57.5% and showed the significantly lower rate than the rates, 84.3% in the untreated oocytes. Furthermore, there were no significant differences in the developmental rates to molura and blastocysts between 23.8 and 19.0%, respectively in the treated oocytes and 22.9 and 17.1%, respectively in the untreated oocytes. 3) Unfertilized oocytes at first insemination among recovered oocytes 14-16hr after hCG injection were reinseminated after zona drilling. The fertilization rates of these oocytes were 83.5% and showed the significantly higher rates than the rates 34.7% in the untreated oocytes(P<0.01). However, the developmental rates of these oocytes to blastocysts were 18.6%, and showed the lower rates compared to control (27.3%).

생쥐 난자의 체외배양에서 루틴과 칸타잔틴이 난자의 질에 미치는 영향

정나현 인제대학교 일반대학원 2018 국내석사

활성세포종을 제거하는 항산화제를 이용해 정자와 난자의 질을 높이기 위한 다양한 연구가 보고되고 있다. 항산화제인 루틴과 칸타잔틴은 돼지, 양 등 다양한 가축 종의 난자에 영향을 준다. 그러나 대표적인 실험 모델인 생쥐의 난자 체외배양에 미치는 영향에 대해 알려진 바는 없다. 본 연구에서는 루틴과 칸타잔틴이 생쥐 난자의 체외배양에서 난자의 질에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 난자의 배양액에 0.1 µg/ml 루틴 또는 40 µM 칸타잔틴을 첨가했을 때 활성산소종의 수준이 상당히 낮아졌으며, MII기로 성숙한 난자의 비율이 증가하였다. 그러나 루틴과 칸타잔틴의 처리가 투명대 경화 지연과 처녀생식에서는 효과가 없었다. 피층 과립 분포를 관찰한 실험과 노화 억제 유전자인 sirt1 유전자의 real-time PCR 실험 결과에서 루틴은 난자의 노화 지연에 효과가 없었고 칸타잔틴은 난자의 노화를 지연시키는 것을 확인하였다. 결과적으로 생쥐 난자의 체외배양 과정 중 루틴 또는 칸타잔틴의 처리는 난자에 일정 한도 내의 긍정적인 효과가 있다. The antioxidants have an ability to remove reactive oxygen species (ROS). It is reported that antioxidents improve sperm and oocyte quality with antioxidant in various livestock such as pig and sheep. However, the effect of antioxident on the in vitro culture of mouse oocyte, the representative model organism, has not been reported. Therefore, this study investigated the effects of rutin and Cx on mouse oocyte quality during in vitro culture. The 0.1 µg/ml Rutin or 40 µM Cx treated ooctyes significantly decreased the ROS level and increased the rate of in vitro maturation. The treatment of rutin or Cx was not able to delay zona pellucida(ZP) hardening and had no effect on parthenogenesis. The results of CG distribution and real-time PCR of sirt1 show that Rutin has no effect on suppression of aging but Cx delays aging of oocyte. In conclusion, the treatment of rutin or Cx has positive effects on mouse oocyte during in vitro culture.

돼지난자의 체외성숙단계에서의 hrG-CSF 처리가 배아발달능력에 미치는 영향 : The effects of human recombinant granulocyte-colony stimulating factor (hrG-CSF) treatment during in vitro maturation of porcine oocyte on subsequent embryonic development

채련 충북대학교 2015 국내석사

과립구 클로니 자극 인자 (G-CSF)는 세포의 증식, 분화 그리고 생존에 필요한 인자이다. 본 인자는 또한 인간 배아착상에 있어서 난자의 발달 능력을 판단할 수 있는 바이오 마커 이기도 하다. 사람에서 G-CSF의 농도는 전반 난소 주기가운데 배란시기에서 제일 높게 나타나고 있다. 본 연구는 우선 먼저 과립 막 세포(GCs), 황체(CL), 난구세포 (CCs) 그리고 난자에서 G-CSF와 G-CSFR의 유전자 발현여부를 분석하였다. 그 후 난구세포-난자 복합체(COC)를 각각 1–3 mm (작은 난포) 와 3–6 mm (중간 난포)인 난포에서 채취한 뒤 무 단백질 체외성숙배지에 G-CSF(0, 10 and 100 ng/mL)를 여러 농도 별로 처리하여 배양하였다. 실시간 PCR분석을 진행한 결과 GCs, CL, CCs 그리고 난자에서 모두 G-CSF와 G-CSFR의 유전자 발현이 나타났고 흥미로운 것은 난자 내의 G-CSF의 유전자 발현양은 다른 유래 세포에서의 발현양보다 유일하게 낮게 관찰 되였지만 난자 내 G-CSFR의 유전자 발현양은 GCs에서 발현양과 거의 비슷하게 관찰 되였다. 난자를 44시간 동안 체외에서 배양한 뒤 세포핵 성숙도를 평가한 결과 각군에서 유의적 차이는 없었지만 세포질 성숙도를 평가한 결과 작은 난포유래와 중간 난포유래의 실험 군에서 10ng/mL에서 유의적으로 낮은 ROS의 농도를 보였고 GSH의 농도는 유의적 차이가 없었다. 단위발생을 통한 성숙난자의 발달능력을 평가한 결과 작은 난포유래 난자에서는 100ng/mL G-CSF처리군에서 (63.3%, 31.2%), 중간 난포유래 난자에서는 10ng/mL G-CSF처리군에서 (76.3%, 45.6%) 배아 분할율과 배반포 형성율이 대조군(38.6%, 49.0%, 52.1%, 61.3% 그리고 10.4%, 15.6%, 32.8%, 33.9%)에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였고 배반포 세포수를 평가한 결과 작은 난포에서나 중간 난포에서나 모두 10ng/mL 처리군(73.7, 106.5)에서 유의 적으로 높은 결과를 보였다. 체외수정을 통한 성숙난자의 발달능력을 평가한 결과 다른 실험 군보다 중간난포 유래인 10ng/mL 처리군 (36.4%) 에서 유의적으로 높은 배반포 형성효율을 보였다. 또한 체외수정 후 수정률 평가에서 수정효율이 모두 G-CSF 처리군 (29.1%, 44.0%)에서 대조군(20.5%, 34.5%)에 비해 유의적으로 증가되었다. 성숙 후 난구세포에서 mRNA 발현을 분석한 결과 작은 난포유래와 중간 난포유래는 모두 G-CSF 처리군에서 Bcl2와 ERK2가 유의적으로 높게 발현되었다. 결론적으로 이 결과는 hrG-CSF는 세포질 내 ROS를 감소시킴으로써 체외수정 및 단위발생 배아의 발달능력을 향상시킴을 보여준다 Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is required for the proliferation, differentiation and survival of cells. It is also a biomarker of human oocyte developmental competence for embryo implantation. In humans, the G-CSF concentration peaks during the ovulatory phase of the ovarian cycle. In this study, the expression of G-CSF and its receptor was analyzed by PCR in granulosa cells (GCs), corpus luteum (CL), cumulus cells (CCs), and oocytes. Cumulus oocyte complexes (COCs) were aspirated from antral follicles 1–3 mm (small follicles) and 4–6 mm (medium follicles). COCs from two kinds of follicles were matured in protein-free maturation medium supplemented with various concentrations of G-CSF (0, 10 and 100 ng/mL). By real-time PCR, the expression of G-CSF and its receptor were detected in GCs, CL, CCs, and oocytes. Interestingly, the G-CSF transcript levels were significantly lower in oocytes than in the other cell types, whereas the G-CSF receptor transcript levels in oocytes were similar to those in GCs. After 44 h of in vitro maturation, no differences in the rate of nuclear maturation were detected; however, the intracellular ROS levels in oocytes from both groups of follicles matured with 10 ng/mL hrG-CSF groups were significantly lower (p < 0.05). After parthenogenetic activation (PA), the cleavage and blastocyst formation rates were significantly (p < 0.05) higher in 100 ng/mL hrG-CSF-treated small (63.3 and 31.2%) and 10 ng/mL hrG-CSF-treated medium (76.3 and 45.6%) follicles compared to the other groups (38.6, 49.0, 52.1 and 61.3%, and 10.4, 15.6, 32.8 and 33.9%). The total cell number in blastocysts from the small and medium follicle groups was significantly higher in the 10 ng/mL hrG-CSF-treated group (73.7 and 106.5) than in the other groups. After in vitro fertilization (IVF), the blastocysts stage was significantly (p < 0.05) increased in 10 ng/mL hrG-CSF-treated medium (36.4%) follicle. Fertilization efficiency was significantly high in the 100 ng/mL of small (29.1%) and 10 ng/mL of medium (44.0%) follicle. I also examined the Bcl2 and ERK2 transcript levels and found that they were significantly higher in the small and medium follicle treatment groups. In conclusion, these results indicate that hrG-CSF improve the viability of porcine embryos.

돼지 난자의 체외성숙에서 Bisphenol A에 의해 유도된 미토콘드리아 유래 활성산소 조절에 관한 연구

박수용 대구대학교 2016 국내석사

Bisphenol A (BPA)는 대표적인 환경호르몬으로써 플라스틱 제조 시 사용되는 물질이다. 이러한 BPA는 세포내에서 산화적 스트레스, 세포사멸, 세포기능이상 및 성호르몬인 에스트로겐의 교란물질로 생식기관의 장애를 유발 시키는 것으로 알려져 있다.최근 연구에서, BPA는 중요 세포소기관인 미토콘드리아의 기능 이상과 미토콘드리아 유래 활성산소 및 세포사멸과 관련 있는 것으로 보고되었다. 특히, 미토콘드리아는 난자의 체외성숙과정동안 난자의 성숙에 필요한 에너지원을 공급하고, 다양한 물질대사에 관여하는 활성산소가 생성되기 때문에 미토콘드리아의 기능이 매우 중요하다. 그러나 BPA가 돼지 난자의 체외 성숙 과정에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 돼지 난자의 체외 성숙 과정 동안 BPA 처리에 따른 미토콘드리아의 기능 및 활성산소의 조절을 통한 핵 성숙과 난구세포의 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저, 돼지 난자의 체외성숙 배양액인 NCSU-23에 BPA를 44시간 동안 농도(50, 75, 100 µM)별로 처리하여 돼지의 핵 성숙 및 난구세포의 확장을 조사하였다. 예상대로, BPA의 처리농도에 의존적으로 핵 성숙과 난구세포의 확장 비율이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 난자의 성숙과정동안 난자와 난구세포의 상호작용 및 물질수송에 관련된 간극연접에 필수적인 분비관련 유전자들(bmp15, kit, has2, tnfaip6)을 통해 난구세포-난자-복합체(COCs)의 분비 기능을 조사하였다. BPA를 처리한 COCs에서는 난구세포에서 분비되는 has2, tnfaip6와 간극연접 유전자 cx37의 mRNA 발현 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, BPA 처리에 따른 미토콘드리아 기능 이상 및 미토콘드리아 유래 활성산소와 세포사멸을 확인하기 위하여 미토콘드리아 기능 및 유래 활성산소를 측정하고, 미토콘드리아 관련 세포사멸 인자 및 항산화 효소들의 발현패턴을 조사하였다. 예상대로, BPA 처리에 의해 성숙된 COCs에서 항산화효소 유전자 중 sod2, prdx3, prdx5의 mRNA 발현 수준이 증가하며, 미토콘드리아 막 전위차가 감소하고 미토콘드리아 유래 활성산소가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 미토콘드리아 관련 세포사멸 인자인 Cleaved PARP-1, AIF, Cleaved caspase 3의 단백질 수준에서의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 미토콘드리아 매개성 세포사멸과 관련된 미토콘드리아 다이나믹스 인자인 미토콘드리아 분열 단백질 Drp1의 발현이 BPA를 처리한 COCs에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, BPA에 의해 유도된 미토콘드리아 유래 활성산소의 증가가 미토콘드리아 유래 활성산소를 특이적으로 감소시켜주는 mito-TEMPO 처리에 의해 감소됨으로써 돼지 난자의 핵 성숙이 증가하는 것을 확인하였다. 위 결과를 종합하자면, 돼지 난자의 체외성숙 배양과정동안 BPA의 처리에 의해 유도된 미토콘드리아 유래 활성산소종의 증가와 미토콘드리아의 기능저하를 통하여 핵 성숙, 난구세포의 확장 및 분비기능이 저하됨을 확인하였다. 더욱이, 돼지 난자의 체외 성숙과정에서 미토콘드리아 유래 활성산소종은 미토콘드리아 다이나믹스 반응 및 미토콘드리아 매개성 세포사멸에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이번 연구를 통해서 미토콘드리아 유래 활성산소의 조절 및 관련 메커니즘이 돼지난자의 체외 성숙과정에서 핵 성숙 및 난구세포의 기능에 있어서 중요한 역할로 작용됨을 처음으로 확인하였다. 그러므로, 미토콘드리아 유래 활성산소의 조절을 통한 체외성숙 난자에 대한 연구는 미토콘드리아 관련 불임의 원인 규명에 대한 기본적인 연구로써 의미가 있으며, 이를 통한 새로운 조절 메커니즘을 제시하여 난자의 체외성숙 향상에 도움이 될 것으로 생각된다. Bisphenol A (BPA) is the substance used in the manufacture of plastic as a representative environmental hormone. Above all, BPA is well known as xenobiotics of estrogen and to be an increasing of oxidative stress, apoptosis and cell dysfunction. In a recent study, BPA treatment induce mitochondrial dysfunction and mitochondrial derived reactive oxygen species (mitochondrial ROS). Especially, mitochondria play an important role during oocyte maturation by suppling energy source. However, effect of BPA treatment was not well known to porcine oocyte during in vitro maturation. Therefore, regulation of ROS production from mitochondria by BPA may play a critical role in meiotic maturation and expansion of cumulus cells in porcine oocytes. To investigate the effects of BPA on porcine oocyte maturation progression, I observed that porcine oocytes were matured in NCSU-23 medium supplemented with BPA (50, 75, 100 µM) for 44 h. My results showed that the rates of meiotic maturation and cumulus cell expansion at the BPA (75 µM) treated group was significantly lower than those of control group (p < 0.01). Next, to investigate the secretion function of cumulus-oocyte complexes (COCs), I confirmed the mRNA level of COCs secretion factors (has2, tnfaip6, ptx3, bmp15, kit, cx43, cx37). As a result, mRNA expression level of has2, tnfaip6 and cx37 significantly decreased in the BPA treated COCs. Moreover, to investigate mitochondrial dysfunction, mitochondrial ROS and apoptosis by BPA treatment, I confirmed the JC-1, mito-SOX staining, mRNA level of antioxidant enzymes (gpx1, catalase, sod1, sod2, peroxiredoxin family) and protein level of cellular apoptosis factors (Cleaved PARP-1, AIF, Cleaved caspase 3). As expected, BPA treated COCs increased mitochondrial dysfunction, mitochondrial ROS, mRNA level of mitochondrial specific antioxidant enzymes (sod2, prdx3 and prdx5) and protein level of mitochondrial mediated apoptosis factors (Cleaved PARP-1, AIF, Cleaved caspase 3). As well as, I examined reduction of BPA-induced mitochondrial ROS by using the mitochondrial-targeted antioxidant enzyme, such as mito-TEMPO. Interestingly, addition of mito-TEMPO (0.1 µM) to the BPA pre-treated COCs recovered in porcine oocyte meiotic maturation. Based on these results, BPA hinder meiotic maturation and cumulus cell expansion by increasing mitochondrial dysfunction, mitochondrial ROS and mitochondrial-mediated apoptosis. Therefore, I suggest that controlling of mitochondrial ROS and apoptosis plays a critical role in meiotic maturation and cumulus cells expansion of porcine oocytes in vitro. So, I conjecture that mitochondrial ROS production mechanism research improving maturation process of porcine oocytes. Furthermore, these finding will be helpful for causes of mitochondrial-related infertility.

복수액이 미성숙난자와 정자의 체외배양에 미치는 영향에 관한 연구

김은경 建國大學校 大學院 1992 국내석사

본 연구는 포유동물의 미성숙난자를 성공적으로 체외 배양시킬 수 있는 최적의 배양의 조건을 개발하고자 실시 하였다. 초기배 배양시 사용되는 배양액으로는 미성숙난자의 발달율이 저조함에 첨가물질을 달리 비교하여보았다. 첫번째 실험에서는 복강액이 첨가된 배양액을 미성숙 난자를 배양함에 배양액 종류를 달리하여 성숙율 및 수정을, 발달율을 조사하였으며, 두번째 실험에서는 각 미성숙 난자를 배란주기와 비배란주기로 비교하여 정상적으로 배란이되는 상태의 난소로부터 회수된 난자와 배란이 정지된 상태의 난소에 있어서 성숙을, 수정을, 발달율을 비교해 보았다. 배란주기의 난소로부터 회수된 미성숙난자를 중식기와 황체기로 구분, 이 미성숙난자를 TCM 199배양액과 Ham's F-10배양액에서 배양하여 성숙을, 수정을, 발달율을 비교하여 중식기와 황체기의 미성숙난자가 체외배양시 똑같은 조건하에서 차이가 있는지 없는지의 유무를 알아 보았다. 마지막 실험에서는 신선 정액을 처리하여 회수된 부유정액을 TCM 199 배양액에 복강액 농도를 5%, 10%, 50%, 100%로 각각 나누어 넣어 시간별로 활동성을 비교하여 보았다. 따라서 본 연구는 포유동물 미성숙 난자의 채외 배양의 호율을 증가시키고자 이상과 같은 배양 방법을 활용하는 연구를 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Ham's F-10과 TCM199이 미성숙 난자에 미치는 영향 난소로부터 회수된 미성숙 난자를 50%의 peritoneal fluid 가 첨가된 Ham's F-10배양액에서 배양하여 보았다. 대조군으로 20% fetal cord serum이 첨가된 배양액에서 배양된 난자와 비교시 Ham's F-10에 50% peritoneal fluid가 첨가된군이 first polar body돌출율이 71.2%로 가장 좋은 결과를 보였다. 한편 수정율에 있어서는 Ham's F-10 과 TCM 199에 50% peritoneal fluid를 첨가한 군이 20% fetal cord serum이 첨가된 Ham's F-10배양액 보다 종은 결과를 나타내었다. 2. 배란주기와 비배란주기에 따른 미성숙난자의 성숙을, 수정율, 발달율 비교. 정상적인 menstrual cycle에 있는 난소로부터 회수된 비배란주기의 미성숙 난자와 배란주기의 난소로부터 회수된 미성숙 난자를 배양해 봄으로 정상적으로 호르몬이 작용하는 미성숙난자와 작용치않고 정지된 난자를 배양시 성숙율, 수정율, 발달율의 차이를 알아보는 실험이다. 여기서는 성숙율, 수정율, 발달율에 있어서 유의성이 보이지 않은것으로 보아 정상적으로 배란이 되는 난소의 미성숙 난자나 배란이 없는 난소의 미성숙 난자사이에는 체외성숙시 차이가 없는것을 알 수 있다. 3. 배란기와 황체기 난소로 부터 회수된 미성숙난자의 비교. 각 배양액 즉 TCM 199과 Ham's F-10배양액에 배양된 미성숙 난자를 증식기와 황체기로 분류하여 그 성숙율과, 수정율, 발달율을 비교하여 보았을 때 성숙율, 수정율, 발달율에 있어 유의성이 없는것으로 나타났다. 4. 정자를 복강액의 농도를 달리하여 배양시 활동성의 비교. 부유된 정액을 대조군으로 하여 TCM 199 배양액에 Peritoneal fluid 의 농도를 5%, 10%, 50%, 100%로 하여 시간별로 비교하여 본 결과 농도에 관계없이 30분이 지난 시간부터 급격히 활동성이 떨어져 24시간 추에는 활동성이 20%이하로 떨어짐을 볼 수 있었다. These experiments were carried out to investigate the optimum culture conditions for in vitro maturation and fertilization of human immature follicular oocytes. Immature follicular oocytes recovered from cyclic or non-cyclic ovaries were cultured in Ham's F-10 and TCM 199 media supplemented with 50% peritoneal fluid for 24 to 48 hrs. Then, matured oocytes were inseminated with swim up sperm in the medium supplemented with 10% fetal cord serum. Fertilization and cleavage were examined 12-48 hrs. after insemination. Sperm motility was examined after incubating in different peritoneal fluid concentrations for 0.5 - 24 hrs. The results obtained in these experiments were summarized as follows: 1. Immature follicular oocytes collected from cyclic or non-cyclic ovaries had no statistical difference in the rates of maturation and fertilization. 2. Rates of maturation and cleavage of immature follicular oocytes were not significant difference between follicular phase and luteal phase. 3. Human peritoneal fluid had a significant effect on the in vitro maturation and fertilization of immature oocytes compared to human fetal cord serum. 4. The maturation rate of immature oocytes was significantly higher in Ham's F-10 medium compared to TCM 199. 5. Sperm motility was significantly decreased by incubation in peritoneal fluids.

생쥐에서 정자-난자 결합에 미치는 정자추출물의 영향

계명찬 한양대학교 1990 국내석사

Role of spermatozoa during in vitro meiosis progression in porcine germinal vesicle oocytes : 돼지미성숙난자의 체외성숙 동안 정자의 역할

강성룡 동의대학교 대학원 2003 국내박사

본 연구는 미성숙 돼지의 난자의 체외 성숙 시 호르몬이 첨가되지 않은 화학적으로 명확히 규명된 배양액 내에 정자 첨가시 정자가 난 성숙에 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다. 돼지의 발정주기에 상관없이 도축된 돼지로 부터 난소를 채취하여 실험실로 이동시킨 후 난자-난구세포 복합체를 직경 3-5mm의 난포에서 회수하였다. 채취된 난자-난구세포 복합체를 정자가 포함된 TCM199 조직배양액에서 배양하였다. 48시간 배양 후 핵 성숙 판정은 핵막 붕괴, 제일차 감수분열 중기, 제일차 감수분열 후-말기, 그리고 제이차 감수분열 중기로 구분하였다. 성숙한 돼지의 정소, 부정소 두부, 체부 및 미부에서 채취한 정자와 돼지의 미성숙난자와 공 배양하였을 때 정자무첨가구에 비하여 제2차감수분열 중기에 도달한 난자가 유의적으로 증가하였으나, 채취한 부위에 따른 난자의 핵 성숙에는 차이가 없었다. 정자를 두부와 미부로 분리하여 각각 공 배양한 결과 첨가하지 않은 구에 비하여 난자의 핵성숙률을 높게 났으며, 두부와 미부 사이에는 차이가 없었다. 생후 7일된 정소에서 채취한 원시성세포와 Triton X-100을 처리한 정자와 공 배양하였을 때에는 난자의 핵성숙을 촉진하지 못하였다. 100℃로 가열한 정자와 공 배양에서도 난자의 핵성숙률이 무첨가구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다. 또한 dbcAMP와 forskolin을 성숙배양액에 첨가하여 대부분의 난자들이 제일차감수분열 전기에 억제되었으며, dbcAMP와 forskolin이 포함된 성숙배양액에 정자첨가로 50.6%이상의 난자에서 핵막붕괴가 일어났다. 본 실험은 수정전이라도 성숙한 돼지의 정자와 미성숙난자와 공배양은 난자의 체외 핵성숙을 촉진하며, 촉진물질은 정자의 세포막에 존재하는 것으로 사료되며, 정자의 촉진물질은 성숙된 돼지의 정소에서 생성되며 생물학적 작용은 열에 안정하여 부정소를 지나는 동안 사라지거나 변형되지 않는다. 또한 dbcAMP와 forskolin의 감수분열억제효과를 압도하는 것 등을 강력히 시사하고 있다. The aim of this study was to examine whether in vitro nuclear maturation of porcine germinal vesicle oocytes can be enhanced by co-culture with spermatozoa in a hormone-free, chemically defined medium. Porcine ovaries from a local slaugterhouse were pooled together regardless of the stage of the donors cycle. Cumulus-oocyte complexes(COCs) were aspirated from 3-5mm follicles in diameter. Porcine COCs were cultured in tissue culture medium (TCM) containing mammalian spermatozoa. After 48h culture, oocytes were examined for evidence of GV breakdown (GVBD), metaphase I, anaphase-telophase I, and metatphase II. The rate of metaphase II was significantly (P<0.01) increased in the oocytes cultured in media containing spermatozoa from various region of genital tract and spermatozoa head, tail compared to those in media without spermatozoa. However, porcine gonocyte from newborn testis or spermatozoa treated with Triton-X was not able to enhance the nuclear maturation in vitro of porcine GV oocytes. Oocytes cultured in TCM with spermatozoa heated at 100℃, increased the rate of M-II stage. When spermatozoa were added into porcine COCs cultured in the presence of cAMP or forskolin, more than 50.6% of COCs was able to resume meiosis. The present study gives the evidences that membrane of porcine spermatozoa contain a heat stable substance(s) that improves the rate of nuclear maturation even before fertilization, that meiosis-activating substance(s) in spermatozoa is acquired in testes and its biological effect is not lost from spermatozoa membrane during transportation of spermatozoa through epididymis, and that spermatozoa are able to induce GVBD of porcine COCs maintained in meiotic arrest with dbcAMP or forskolin.

개 난자의 체외성숙에서 성선자극호르몬의 효과와 전기 자극을 이용한 단위생식

김봉수 경북대학교 대학원 2007 국내석사

개 난자의 체외성숙과 배아 발달에 관한 연구는 포유류의 발생학에서 중요한 역할을 한다. 개의 배아 발생은 다른 포유류와는 많은 차이가 있다. 개에 있어서는 미성숙난자가 배란되고 난관에서 성숙되나 아직까지 개의 배아 발달에 관한 연구가 다른 포유류에 비해 크게 미약한 실정이다. 본 연구에서는 성선자극호르몬에 따른 체외성숙율과 성숙된 난자를 전기 자극을 통해 단위생식을 유도하여 전핵 형성에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과 개 난자의 체외성숙에서 10 IU/ml의 hCG와 eCG를 병행하여 각각 처리한 후 48시간 동안 배양하였을 때 MII 단계의 난자로 발달하는 경우가 15.5%(28/181)로 가장 높았다. 그리고 hCG와 eCG를 병행 처리하여 체외성숙시킨 난자를 다양한 조건의 전기 자극을 통해 단위생식을 유도하였다. 그 결과 단위생식 유도에서는 1.5kV에서 60㎲동안 전기 자극을 처리한 난자가 전핵 형성율이 37.1%(39/105)로 가장 좋았다. 본 연구에서는 비록 전핵 형성 이후의 배아를 얻지 못하였지만 개에서는 처음으로 전기 자극을 통하여 단위생식을 유도하였으며 전핵단계의 난자를 얻을 수 있었다. 이는 개 배아 발생연구에 아주 중요한 기초자료가 될 것이다.