생화학적 기법을 이용한 해양 환경모니터링 기법의 개발

오선미 漢陽大學校 大學院 2001 국내석사

생화학과 분자생물학은 20세기에 접어들면서 새로운 실험 기기등의 개발이 뒷받침되어 급속히 발전하였고 의료, 제약 개발등 분자 단계에서의 원인 분석과 치료제 개발에 사용되는 등 임상 및 진단에 그 적용분야를 넓혀가고 있다. 그러나 이러한 혁신적인 기술의 환경에로의 적용은 미비한 형편이다. 본 연구에서는 생화학 및 분자생물학적 기법을 환경 모니터링에 적용시켜 새로운 방법을 개발하고 구축하는 것을 목적으로 하여 수행되었다. 본 연구에서 새로이 구축한 기법을 적용하여 중점적으로 조사한 황해는 수심이 얕고 한반도의 동고서저형의 지형적 특성과 중국과 인접한 지리적 특성으로 인하여 지속적인 지표수의 유입이 이루어 지고 있으며 또한 투기장이 존재하여 해양 투기로 인한 육상 유래 오염물질에 의한 오염이 지속적으로 이루어지고 있는 실정이다. 황해로의 육상유래 물질 유입 및 투기장의 폐기물 투기는 화학적, 생물학적 환경 변화를 초래하여 해양 생태계와 인간에게 직접적인 영향을 끼칠 수 있으므로 지속적인 모니터링이 필요하다. 기존의 모니터링 기법들은 분석 시까지 오랜 시간과 노동이 필요하여 즉각적인 경보기능을 수행하기 어렵다는 단점이 있다. 생화학적 방법을 적용한 기법 개발과 구축을 위한 연구과정으로써 황해 정점의 해수 각각 1 L씩을 2000년 4월과 9월, 2001년 2월에 채취하여 전처리 과정을 거쳐 TLC-FID로 용존성 및 부유성 전체 지방의 조성을 분석하고 GC analysis를 통해 hydrocarbon과 fatty acid methyl ester를 정성 및 정량하였다. 해양 투기장의 해수 중에 포함된 유기물들이 해양생태계와 인간에게 미치는 영향을 알아보기 위하여 marine luminescence bacteria Vibrio harveyi mutant M17과 human leukemia cancer cell line K-562를 이용하여 독성검사를 수행하였다. 이와 함께 분자생물학적 기법을 이용한 모니터링기술로써 16s rDNA의 variable domain을 중심으로 t-RFLP analysis를 통해 미생물 군집의 변화도를 조사하였다. Recently, many ground wastes such as manure, industrial wastes have been dumped into the ocean around Korean Peninsula. Together with the shallow depth and the effect of many big rivers in Korea and China into the Yellow sea, the ocean dumping into the Yellow sea can cause severe environmental change in chemical and biological aspects. For this reason, an efficient method for the environmental pollution monitoring around the ocean dumping site in the Yellow sea is badly necessary. Biochemical analyses methods, such as the Thin Layer Chromatography (TLC) and Gas Chromatography (GC) determination of particulated and dissolved hydrocarbons and fatty acid, the microbial toxicity determination using marine luminescence bacteria Vibrio harveyi mutant M17, the mammal toxicity using human leukemia cancer cell line K-562 as well as the monitoring of microbial community change using terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (t-RFLP) analyses were employed to analyze samples collected from water column at sites in Yellow sea during the expedition of April, September 2000 and February, April 2001.

Phage display를 이용한 단일 클론 항체의 분리

장명희 忠南大學校 大學院 2002 국내석사

Monoclonal antibodies (MAbs) are useful in the therapy and diagnosis of a range of diseases and this they are finding industrial application. MAbs are generated by hybridoma technology. However, there are a number of limitations, the current hybridoma-based approach in phage display has become an important approach for the preparation of monoclonal antibodies. This approach allows for the rapid selection of monoclonal antibodies without the restraints of the conventional hybridoma technology. The phage display system may yield a new generation of monoclonal antibodies with improved specificities and properties. In this study to generate monoclonal antibodies to human thrombopoietin(hTPO)-S1 tag, the total RNA of the B cells of the BALB/c mice immunized with hTPO-Sl tag was isolated and used as templates to synthesize the cDNAs encoding the heavy and light chain variable domains using the variable regions-specific 5'-primers and the constant region-specific 3'-primers. The resulting cDNAs were cloned into a phagemid vector and a phage Fab library of 1×10^(9) was constructed, which was then panned against purified hTPO-S1 tag. After the fourth round of panning, 40 positive clones were selected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and characterized for their antigen-binding affinities and sequence identities. The phage display technology provides a powerful tool for isolating a variety of MAbs.

대식세포 분화과정에서 Survivin의 발현과 그 기능에 대한 연구

김미선 忠南大學校 大學院 2002 국내석사

Survivin is a member of inhibitor of apoptosis protein (IAP) family, which is also essential for mitosis and cell cycle progression. Cellular differentiation is a complicated process and the fight regulation of cell cycle and death must be accompanied with the cellular differentiation. Since survivin is known to be the dual regulator for cell cycle and death, in this study, we investigate a possible role of survivin for macrophage differentiation in monocyte U937 cells. Macrophage differentiation of monocyte U937 cells could be induced with PMA treatment and monitored using macrophage marker CD11b and CD11c. Following PMA treatment, the expression of survivin increased in the early stage of differentiation and then gradually decreased. The survivin promoter was down-regulated with PMA treatment suggesting that the decrease of survivin was regulated in a transcriptional level. For further analysis of survivin function on the differentiation, we prepared the stable cell lines transfected with GFP-fusioned constructs of survivin. In these cell lines, we observed that macrophage differentiation was delayed by the ectopic expression of survivin.

Aspergillus nidulans의 ergosterol 합성과정에서 2개의 lanosterol 14-alpha-demethylase isozyme 유전자들의 산소 농도에 따른 발현조절 분석

고선기 배재대학교 대학원 2009 국내석사

산소는 모든 호기성 유기체의 생존과 생물학적 기능들에 있어서 없어서는 안 된다. 산소는 sterol, heme 그리고 fatty acids의 생합성에 필요하다. 저산소 조건에서, 세포는 낮은 산소 농도를 인식하고, 결과적으로 저산소 ㅘㄴ겨에 적응하기 위해 저산소 유전자들을 발현시키는 전사인자를 활성화시킨다. S. cerevisiae에서는, Hap1과 Mga2는 저산소 유전자들을 발현하기위한 확실한 전사 요소이다. 포유류 SREBP의 homolog인 막결합 전사인자 sre1은 S. pombe의 저산소 유전자들의 활성을 유도한다. 사상성진균인 Aspergillus nidulans의 HitA는 SREBP homolog로 저산소에 유도되는 유전자의 발현에 관여하는 것을 보인다. 균에서 세포막의 중요한 구성요소중 하나인 ergosterol은 한개의 분자를 합성하는데 12개의 산소 분자가 사용되고 20개 이상의 효소가 연루된 복잡한 경로이다. 많은 항진균제는 ergosterol 생합성 경로의 효소들을 저해하고 itraconazole과 fluconazole은 lanosterol 14-alpha-demethylase (Erg11)를 선택적으로 저해한다. Aspergillus nidulans는 lanosterol 14-alpha methylase의 isotype인 erg11A(AN1091) 그리고 erg11B(AN8283) 두 개를 가지고 있다. Erg11A와 Erg11B의 아미노산 서열 유사도는 60%를 보인다. Erg11A와 Erg11B는 heme에 관련된 cysteine 잔기 주위에 FXXGX(H/R)XCXG의 특정염기서열 산소 활성화 과정에 관여하는 serine잔기가 I-helix내의 존재하며 K-helix내의 EXXR의 보존된 염기서열을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 우리는 erg11A와 erg11B의 발현이 HitA에 의존된 것인지를 실험하였다. 더불어 Erg11A와 Erg11B isotypes의 차이를 erg11A와 erg11B의 결여 돌연변이체를 사용하여 조사하였다. erg11A와 erg11B의 결여 돌연변이를 만들고자 하였고, erg11A와 erg11B의 결여 돌연변이체는 northern 그리고 southern 분석으로 선정되고 확인되었다. Itraconazole에서 Δerg11B는 민감하지 않았으나 Δerg11A와 ΔhitA는 매우 민감한 표현형을 보여주었다. 흥미롭게도 Δerg11B는 Erg1을 저해하는 항진균제로 알려진 terbinafine에 민감성을 보여주었다. Δerg11A와 Δerg11B의 double mutant는 lethal하였다. ΔhitA에서 Erg11A의 과대발현은 ΔhitA의 itraconazole 민감성을 회복하였으며 이는 ΔhitA에서 erg11A 발현 또는 Erg11A의 양이 감소하는 것을 암시한다. 저산소 상태에서 Δerg11A와 ΔhitA는 생장을 할 수 없고, Δerg11B는 야생주와 동일한 생장을 하였다. 저산소 상태에서 ergosterol을 배지에 추가하면 Δerg11A는 야생주처럼 생장이 회복이 되지만 ΔhitA는 생장할 수 없었다. ΔhitA에서 Erg11A의 과대발현은 저산소에서 생장할 수 없는 ΔhitA의 표현형을 회복할 수 없었고 반면에 ΔhitA에 hitA의 N-term을 과대발현하면 회복이 되었다. 저산소 조건에서 northern 분석을 통하여 erg11A의 발현 증가를 확인하였다. ΔhitA에서 erg11A의 발현의 감소하는데 이는 저산소에서 erg11A가 HitA에 의존되어 발현되는 것을 암시한다. 반면에 ΔhitA를 최소영양요구 배지에서 성장하였을 경우 erg11B의 발현은 변하지 않는다. 면역침강(ChIP) 분석을 통하여 HitA의 N-term은 erg11A의 promoter에 결합하는 것을 확인하였다. Ergosterol 생합성에 과정의 관여하는 효소들 erg1, erg3A, erg3B, erg25A 그리고 erg25B의 HitA에 의존된 전사를 ΔhitA 그리고 ΔhitA에서 hitA N-term의 과대발현 균주에서 확인하였다. erg1은 ΔhitA에서 감소를 하였고, hitA N-term 과대발현에서 증가를 한다. ΔhitA에서 erg25A와 erg25B의 전사는 야생주의 90%, 60%이상 감소되었다. erg25A의 발현은 Δerg11A 와 Δerg11B에서 발현이 증가된다. 게다가 이러한 유전자들의 전사는 HitA가 과대발현 되었을 때 유도된다. ΔhitA에서 erg3A의 발현은 야생형의 10%만 발현이 되고, Δerg11A에서는 약 45%만 발현이 되었다. ΔhitA에서 erg3B는 또한 야생주보다 발현이 감소하고, hitA가 과대발현 되었을시엔 회복되었다. 이를 요약하면, erg11A의 발현은 HitA에 의존적이다. 다른 erg유전자들 확인결과 HitA로부터 조절된다. 흥미롭게도 Erg11A의 isoenzyme인 erg11B는 HitA에 의해 조절되지 않는다. Oxygen is necessary in life and biological functions of all aerobic organisms. Oxygen is also required in the biosynthesis of sterol, heme, and fatty acids. In hypoxic condition, cells have to sense the low oxygen concentration and in consequence activate transcription factors to express hypoxic genes to adapt on the low oxygen environment. In S. cerevisiae, Hap1 and Mga2 are the transcription factors responsible to express hypoxic genes. On the contrary, a membrane tethered transcription factor Sre1, a mammalian SREBP homolog, should be activated to express hypoxic genes of fission yeast, S. pombe. In a filamentous fungus, Aspergillus nidulans, HitA, a SREBP homolog was shown to be responsible for the hypoxia-inducible gene expressions. Ergosterol is one of the important components of cell membrane in fungi. Twelve molecules of oxygen are used in one molecule of ergosterol biosynthesis pathway, which involves about 20 enzymes. Many antifungal agents inhibit enzymes in the ergosterol biosynthesis pathway. Itraconazol and fluconazol inhibits lanosterol 14-alpha-demethylase (Erg11) selectively. A. nidulans has two genes of erg11A (AN1901) and erg11B (AN8283) encoding isotypes of lanosterol 14-alpha-demethylase. Erg11A and Erg11B shares 60% of amino acid sequence homology. Erg11A and Erg11B have a conserved heme binding sequence FXXGX(H/R)XCXG, a serine residue in I-helix which participates in oxygen activation process, and a conserved EXXR sequence in K-helix. In this study, we examined whether expressions of erg11A and erg11B were dependent of HitA. In addition, the difference of Erg11A and Erg11B isotypes was investigated using erg11A and erg11B null mutants. Targeted gene disruptions of erg11A and erg11B were carried out and null mutants of erg11A and erg11B were selected and confirmed by northern and southern analysis. Δerg11A and ΔhitA showed high itraconazol-sensitive phenotype while Δerg11B was not sensitive to itraconazol. Interestingly, Δerg11B showed sensitivity to terbinafine known as an Erg1 inhibiting antifungal agent. Double mutants of Δerg11A with Δerg11B were lethal. Over-expression of Erg11A in ΔhitA rescued the itraconazol-sensitive phenotype of ΔhitA, suggesting that erg11A expression or amount of Erg11A might be low in ΔhitA. In hypoxic condition, no growth was seen in Δerg11A and ΔhitA while Δerg11B exhibited wild type growth. Adding ergosterol in the medium caused cell growth as a wild type in Δerg11A but not in ΔhitA. However, over-expression of Erg11A in ΔhitA failed to rescue the non-growth phenotype of ΔhitA in hypoxia while over-expression of the N-terminus of HitA complemented to ΔhitA. Level of erg11A transcript was increased in hypoxic condition in northern analysis. In ΔhitA, erg11A expression was highly decreased, suggesting HitA-dependent expression of erg11A in hypoxia, while erg11B expression was not changed in MM cultured ΔhitA. The N-terminus of HitA was able to bind to the erg11A promoter confirmed by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay. HitA-dependent transcriptions of the genes involved in ergosterol biosynthesis, erg1, erg3A, erg3B, erg25A, and erg25B were also evaluated in ΔhitA and strains over-expressing the N-terminus of HitA. Transcription of erg1A was decreased in ΔhitA while increased when the N-terminus of HitA was over-expressed. Expressions of erg25A and erg25B were decreased by 90% and 60% in ΔhitA respectively, compared to wild-type. Transcription of erg25A was increased in Δerg11A and Δerg11B strains. Moreover, the transcriptions of these genes were induced when HitA were over-expressed. Transcription of erg3A is decreased to 10% in ΔhitA and 45% in Δerg11A compared with its transcription in wild-type. Similarly, erg3B expression was also decreased in ΔhitA and recovered when hitA was over-expressed. In summary, the expression of erg11A was dependent of HitA. Other erg genes tested were also regulated by HitA. Interestingly, erg11B encoding the Erg11A isoenzyme was not regulated by HitA.

cDNA microarray을 이용한 인간 말초 혈액 림프구에서의 방사선 유도 유전자 동정

성명희 漢陽大學校 大學院 2001 국내석사

이온화 방사선(ionizing radiation, IR)은 생물학적 염증 발생, 조직 상해, 암 유발, 죽음에 이르는 등 생체현상에 많은 영향을 미친다. radiotherapy의 잇점, 핵 사고로 인한 피폭 즉, 핵 폐기물(원전사고)에 따른 사람들의 대 이변, 방사선에 노출되어 간접적으로 영향을 받는 작업 종사자들은 보통 그들의 생화학적 사고에 기초한다. 방사선 피폭의 피해는 local, 생체 systemic level에 변화를 일으킨다. 이들 피해는 생화학적 활성을 일으켜 세포 개체(population)의 변화(돌연변이)를 일으킨다. 이들 변화의 monitoring은 방사선의 노출 정도를 진단 할 수 있다. 현재, 생화학적인 많은 실험들이 dose를 진단 할 수 있을 정도이다. 그러나 원전사고나 의학적 사고 발생 시에 방사선 장해를 신속히 예측하여 사후 지침 마련에 활용 될 수 있는 기술이 거의 전무한 사정이다. 게다가, 이들 대부분의 기술들, high-throughput(1,2,3), large-scale(4)은 유전자 발현을 monitering 할 수 있는 방법이 없다. 최근에 high-throughput을 통한 유전자 발현(gene expression) screening은 방사선에 피폭되었을 때, 인간 말초 혈액 임파구(PBL)의 유전자 발현을 시간(2 hr, 4 hr, 24 hr)과 dose(2 Gy)의 상호 연관성(correlation)을 알아보는 것도 가능하게 되었다. 유전자 set을 동정하는 것, 방사선에 피폭에 반응하는 유전자, 방사선 피폭에 유도되지 않은 유전자 group의 동정이 점점 빨라지고 있다. 본 연구는 인간 PBL의 방사선 피폭 진단의 잠재적 mRNA biomarkers를 찾고자 했다. 첫 단계로 1,222 cDNA microarray을 이용해 gene set 간의 동정을 통해서 인간 PBL에서 방사선 유도 유전자 동정을 시도했다. 동정한 결과 1,222 cDNA 유전자 사이에서 방사선에 피폭되고 난 후 2시간 정도에 나타나는 early gene는 68개 유전자가 나타났고, 방사선 피폭 후 4시간, 24시간에는 126개의 유전자가 나타났다. P1-cdc46 같은 유전자 같은 특별히 변화가 없는 유전자(house keeping)도 109개가 나타났다. 그리고 1,222유전자 중 872개 유전자(50 %)는 어떤 categorize를 지을 수 없었다. 이런 유전자들은 여러 정상적인 사람들에게서 비슷한 결과를 보였다. 이런 marker들의 기능들은 carcinogenesis, radio-biology, 그리고 cancer 치료에 중요하게 작용 할 것이다. 본 연구 결과 방사선 피폭 시 반응하는 유전자라고 생각되는 유전자들은 heat shock protein90(hsp90), hsp27, hsp60, hsf1, HO1, Grp78과 같은 hsp조절 유전자, MnSOD, catalase, GPX1, GST-π, GSTπ와 같은 redox 조절 유전자, fos, Erk1, Erk2 유전자, IFN-γ, IL-2, IL-6, TNF-α등 cytokine 조절 유전자들의 발현이 보였다. 이는 기존의 방사선에 response한 유전자라고 알려져 있는 유전자 database와 비교해 봤을 때 어느 정도 일치했다. 이렇게 동정된 유전자들은 RT-PCR로 다시 한 번 확인을 했다. Ionizing radiation imparted to living systems can result in an array of biological endpoints, including inflammation, tissue injury, carcinogenesis, and death. Theses effects reflect biochemical alterations and changes at a cellular level. Careful monitoring of these changes can provide a reliable indication of exposure. There currently exist a number of biochemical and physiological assays that estimate reasonable dose. Nonetheless, there is no single reliable biochemical change which is unique to ionizing radiation or which is accepted by the civil defense and medical community. Moreover, almost all of the techniques do not have the potential for high-throughput assay development for large-scale population monitoring that gene expression assays have. With recent developments in high-throughput gene expression screening, it may be possible to develop gene expression profiles in human peripheral blood lymphocytes(PBL) that correlate with duration and dose of radiation exposures. The identification of such a gene set would leads to more rapid and non-invasive testing of potentially exposed populations. This study was undertaken to discover new potential mRNA biomarkers(37,43) in human PBL after ex vivo 2 hr, 4 hr and 24 hr irradiation by using 1,222 cDNA microarray hybridization. we have identified genes expressed at increased levels in human PBL. The induced gene expressions are found in heat shock protein, cytokine and redox related genes and the expression patterns are commonly found in PBL from eight independent donors. These results suggest that relative levels of gene expression in peripheral blood cells may provide estimates of environmental radiation exposures.

Alcohol을 장기간 投與한 Rat에 있어서 脂質過酸化 作用에 대한 Antioxidant의 효과

정영진 建國大學校 大學院 1992 국내석사

These studies were carried out to investigate the effects of antioxidants on the blood biochemical parameters including hydroperoxide level by CL-HPLC(Chemiluminescence - high performance liquid chromatography) in chronically ethanol-treated rats. Experimental animals were used Sprague-Dawley male rats, weighing about 120g(for 8 weeks). Rats were divided into 5 groups(Con, ECon, ASC, TOC, ASC & TOC), administered(P.O.) ethanol(5ml/kg, B.W., rat/day) to 4 groups for 8 weeks. Each group was administered the antioxidants excluding Con and ECon group. Ethanol treatment resulted in an increase in liver weight, GPT value, triacylglycerol and lipid peroxide value, comparing with the control. But antioxidants treatment resulted in an decrease GPT value, triacylglycerol and lipid peroxide value. Especially, TOC and ASC & TOC administration inhibited the generation of lipid hydroperoxides comparing with the ECon group in the liver and brain. On the other hand, ASC and ASC & TOC inhibited production of lipid hydroperoxides compared with the ECon group in the testis and spleen. These results indicate that dietary α-tocopherol combined with ascobate treatment were most effective to inhibit the formation of lipid hydroperoxidation in chronically ethanol-treated rats.

인간 유방암 세포에서 청국장 유래 펩타이드 성분에 의한 IL-6 감소효과

성대일 호서대학교 2015 국내석사

유방암 세포주에서 cremastranone 유도체에 의한 MAP Kinase 활성화 및 c-MYC과 Cyclin D1의 발현 유도

이명헌 충북대학교 2024 국내석사

유방암 세포주에서 cremastranone 유도체에 의한 MAP Kinase 활성화 및 c-MYC과 Cyclin D1의 발현 유도 이 명 헌 충북대학교 대학원 생화학과 지도교수: 이 영 희 유방암은 전 세계 여성에게서 발생률과 사망률이 가장 높게 나타나는 암으로 여러 항암치료제가 사용되고 있다. 그러나 약물의 부작용과 약물에 대한 내성과 같은 한계가 존재하여 이를 해결하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 이전 연구에서 homoisoflavanone 계열 화합물인 cremastranone 유도체 SH-19021과 SHA-035가 유방암과 대장암 세포주에서 세포 증식 억제 및 세포사멸을 유도하였으나, 세포 증식 표지자로 알려진 c-MYC 또는 Cyclin D1의 발현이 오히려 증가하는 경향이 확인되었다. 보고된 결과에 따르면, c-MYC과 Cyclin D1이 세포 성장에만 관여하는 것이 아니라, 세포사멸에 기여하는 경우도 존재한다. 따라서, 본 연구에서는 유방암 세포에서 c-MYC과 Cyclin D1의 발현을 중심으로 세포의 반응을 시간별로 자세히 살펴보고, 이와 관련된 조절 기전을 연구하고자 하였다. 유방암 세포주 T47D에서 SH-19021 또는 SHA-035에 의해 세포 주기 정지가 발생하였고, c-MYC의 발현이 1시간부터 증가하고 6시간 후에는 감소하였으며, Cyclin D1의 발현은 6시간 후부터 증가하였다. 이들 단백질의 발현 기전을 이해하기 위해, PI3K/AKT 및 MAP Kinase 신호전달 기전을 살펴보았다. SH-19021과 SHA-035는 c-MYC과 Cyclin D1의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있는 JNK와 p38의 활성화를 유도하였으며, JNK와 p38 활성화 억제 시 c-MYC과 Cyclin D1의 발현이 억제되었다. 또한, JNK와 p38에 의한 c-MYC과 Cyclin D1의 발현 증가는 AP-1의 발현 증가 및 핵 전위를 통해 발생하였다. 본 연구결과는 cremastranone의 유도체인 SH-19021과 SHA-035의 항암 효과에 대한 이해를 높이고, 나아가 새로운 유방암 치료제 개발 및 치료전략 설계에 기여할 수 있을 것으로 기대된다. MAP Kinase Activation and Expression of c-MYC and Cyclin D1 Induced by Cremastranone Drivatives in Breast Cancer Cells Myeong-Heon Lee Department of Biochemistry, Graduate School, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk, Republic of Korea Supervised by Professor Younghee Lee Breast cancer has the highest incidence and mortality rate among women worldwide. Various anti-cancer drugs are being used for breast cancer treatment. Nevertheless, due to limitations such as side effects and drug resistance, extensive research is underway to address these issues. In previous studies, the homoisoflavanone compounds SH-19021 or SHA-035, both derived from cremastranone, suppressed cell proliferation and induced cell death in breast and colon cancer cell lines. However, the SH-19021 and SHA-035 increased expression of cell proliferation markers, c-MYC and Cyclin D1. According to previous reports, c-MYC and Cyclin D1 are involved not only in proliferation but also in cell death. Therefore, this study aimed to investigate cellular responses of breast cancer cell in detail focusing on c-MYC and Cyclin D1 and to study the regulatory mechanisms involved. In the breast cancer cell line T47D, cell cycle arrest was induced by SH-19021 or SHA-035 treatment. The expression of c-MYC increased from 1 hour and decreased after 6hours, while expression of Cyclin D1 increased after 6 hours. To understand the mechanisms involved in the protein expression, signaling pathways such as PI3K/AKT and MAP Kinase pathways were investigated. SH-19021 and SHA-035 induced activation of JNK and p38, known to increase the expression of c-MYC and Cyclin D1. Inhibition of JNK and p38 activation suppressed the expression of c-MYC and Cyclin D1. Furthermore, the increased expression of c-MYC and Cyclin D1 by JNK and p38 activation occurred via increased expression and nuclear translocation of AP-1. These results can provide better understanding of the cremastranone derivatives-induced anti-cancer effects and may contribute to the development of novel breast cancer therapies and the design of therapeutic strategies.

신경전달물질 GABA에 의한 Rat 시상하부 시교차상핵의 흥분성 반응 기작에 관한 연구

김윤식 建國大學校 2003 국내석사

포유류에서 관찰되는 다양한 일주기성 생체리듬은 시교차상핵에 존재하는 생체시계에 의해 주관된다. Circadian rhythm은 신체의 Sleep-wake 주기, 호르몬의 분비주기 등을 조절을 통해 생물체의 생존에 있어 중요한 역할을 하고 있다. 시교차상핵에 존재하는 대부분의 세포는 GABAnergic 세포들로 세포간의 정보전달에 GABA를 사용하는 것으로 알려져 있다 GABA는 포유류의 중추신경계에서 대표적인 억제성 신경전달물질이다. 또한 최근의 연구에서는 하루 중 특정시간동안 시교차상핵의 세포에서 GABA가 흥분성 효과로 작용한다는 증거가 보고되고 있다. 이러한 GABA의 흥분성 작용은 GABA_A 수용체와 연결된 Cl^-채널을 통한 Cl^-의 방출이 요인이라고 제안되었으나, 여전히 Cl^-의 방출을 위한 필요조건인 Cl^-의 세포 내 축적에 대한 작용기전은 여전히 미지의 상태로 남아있다. 우리는 먼저 SCN neuron에서 GABA의 효과를 측정하였다. 그 결과 억제성 반응 67.0%, 흥분성 반응 16.7%, 또한 biphasic한 반응 16.3%를 유도하였다. 그리고 흥분성 반응과 Biphasic한 흥분성요소가 GABA_A 수용체에 의해 매개되는 것인지 확인하기 위해, GABA_A 수용체 차단제인 30μM Bicuculline의 효과를 실험하였다. Bicuculline은 5번의 실험에서 흥분성 반응 모두를 차단하였다. 또, Biphasic한 반응에서 흥분성요소를 완벽히 차단하였다. 일부 세포에서 Biphasic 반응에서의 억제성 요소도 완벽히 차단하였다 이 결과는 GABA_A 수용체가 GABA의 흥분성 작용을 매개한다는 것을 시사한다. GABA의 흥분성 작용이 흥분성 시냅스전 신경 터미널들의 활성에 의한 것인지 확인을 위해 50μM AP5와 10μM DNQX의 혼합약물 처리 실험하였다. 그리고, synaptic transmission을 차단할 정도의 낮은 CA^2+ medium(2.4-0.5mM)으로 관류되고 있는 뇌절편에서 GABA가 여전히 흥분성 작용을 하는지 조사하였다. 혼합약물 처리는 GABA에 대한 흥분성 자극 반응에 대해 별 영향을 미치지 않았고, 낮은 농도의 CA^2+ medium에서의 실험은 오히려 흥분성이 강화되었다. 실험 결과 GABA에 대한 흥분성 요소와 Biphasic에 의한 흥분성 요소는 GABA_A 수용체를 통해 직접적으로 매개되었다는 것을 시사한다. 내향적인 Cl^- 수용기전인 NKCC가 SCN neuron에서 Cl^-의 세포내 축적이 GABA의 흥분성 효과의 원인인지를 확인하기 위해 NKCC blocker인 Bumetanide의 효과를 확인하였다. Bumetanide는 GABA에 의해 유도된 흥분성 반응을 차단하였다. Bumetanide의 효과는 점진적으로 일어났으며, 5-15분 동안 약물을 투여한 후 최대효과가 관찰되었다. Bumetanide 효과로부터의 회복은 더 서서히 일어났다. 10μM Bumetanide는 14개의 Neuron중 7개에서 GABA에 의해 유도된 흥분성반응을 완전히 차단하였고, 그 외 7개의 Neuron에서는 부분적으로 차단하여(46-94%) GABA에 의해 유도된 흥분성반응을 86.2±5.3%(mean±SEM, n=14)으로 감소시켰다. 50μM bumetanide는 하나의 neuron을 제외한 모든 neuron에서 GABA에 의한 흥분성 반응을 완벽히 차단하였다(99.3±0.7%, n=12). 10μM bumetanide로 처리된 세포에서 Bumetanide를 제거한 후 GABA에 의해 유도된 흥분성 반응은 대조군의 12.3±10.3% (mean±SEM, n=14)이고, 50μM bumetanide로 처리한 세포에서는 12.3±9.4% (mean±SEM; n=12)였다. Bicuculline(30μM)은 3번의 실험에서 모두 억제성 반응을 완벽히 차단하였다 실험 결과 GABA의 흥분성 효과는 시냅스후 GABA_A receptors에 의해 직접 매개되며, NKCC를 통한 세포 내 Cl^-의 축적으로 인하여 GABA의 흥분작용이 발생하는 것을 확인하였다. The circadian rhythm orchestrating various physiological and behavioral process in the mammal resides in the Suprachiasmatic nucleus(SCN). Circadian Rhythm regulates sleep-wake cycle, endogenous and forth. SCN contains GABAnergic cells as the primary neuronal population, and it utilizes GABA as a major mean of intacellular communication. GABA is the major inhibitory neurotransmitter in the mature mammalian CNS. But, recent studies presented evidence that GABA exerts an excitatory effect in a subset of SCN neurons during certain time of the day. As an explanation for the excitatory GABA effect, the efflux chloride ions through GABA_A receptor linked Cl^- channel has been suggested. However, the mechanism underlying the intacellular accumulation of Cl^- , the prerequisite for the Cl^- efflux, has been identified. The effect of GABA was examined in 308 SCN neurons recorded during the subjective night. In 32 of these, GABA was without effect. In the remaining cell, however, it elicited in a reproducible manner an inhibitory response 60.0%, excitatory response 16.7%, biphasic response 16.3%. To see if the excitatory response and the excitatory component of the biphasic repose were mediated by GABA_A receptors, we examined the effect of 30μM bicuculline. Bicucullin blocked completely the excitatory response in all if the 5 cases examined. Also, it blocked completely the excitatory component of the biphasic response in all case. In some cases bicuculline blocked the inhibitory component of the biphasic response as well. The result obtained with the use of bicuculline indicates the GABA_A receptors mediate the GABA induced excitation of SCN neurons. We examined the effect of excitatory amino acid receptor blockers(50μM AP-5 & 10μM DNQX) on the GABA induced excitation. Thus, we examined wether or not lowering Ca^2+ concentration(2.4-0.5mM) in the tissue-bathing medium to an extent to block synaptic transmission affected the excitation produced by erogenous application of GABA. The cocktail drug had no effect on the excitatory response to GABA and lowering Ca^2+ concentration test enhanced the excitation. This test indicates that the excitatory response and the excitatory component of the biphasic response to GABA are mediated directly by GABA_A receptor located on the membrane of the recorded neurons. We evaluated the possible of NKCC by examining the effect of the NKCC blocker bumetanide on the excitation produced by GABA. Bumetanide blocked the GABA elicited excitation. Usually the bumetanide effect grew gradually over-time in such way that full-blown effect as detected only after its application for 5-15 minutes. The recovery from the bumetanide effect was even a slower process. At 10μM, bumetanide attenuated the GABA-elicited excitation by 86.2±5.3%; in 7 of 14 neurons tested it blocked the excitation completely and in the remaining 7 it produced a partial blockade(46-94%). At 50μM, bumetanide blocked completely the GABA elicited excitation in all but one neuron tested(99.3±0.7%, n=12). The GABA elicited excitation after wash-out bumetanide was 32.3±10.3% of the control(mean±SEM, n=14) in cell previously challenged with 10μM bumetanide, and 12.3±9.4% of the control(mean±SEM, n=12) in cells challenged with 50μM bumetanide. Bicuculline(30μM) completely blocked the inhibitory response in all of the 3 case examined. We present result indicating that the excitatory effect of GABA is mediated directly by GABA_A receptors and that NKCC arose Intracelluar accumulation of Cl^- that allow GABA excitation.

바실러스 섭틸러스 티올 퍼옥시다제의 생화학적 특성 연구

김규정 배재대학교 대학원 2009 국내석사

산소는 지구상에서 가장 많은 원소로서 대기 중에 21%응 차지하면, 호기성생물은 이 산소를 전자 수용체로 하는 호흡을 통해 에너지를 생성한다. 이렇듯 산소는 생명유지에 절대적으로 필요한 존재지만 안정한 분자상태에서 체내외의 여러 가지 요인으로 인해 활성 산소로 전환되어 생체에 치명적인 산소 독성을 일으킨다는 양면성을 가진다. 이러한 활성산소에 대한 방어 작용으로 생체 내에는 여러 가지 항산화 효소와 물질들이 존재하고 있어 그 피해를 최소화하려는 일련의 생화학반응들이 수행되고 있다. 포유동물에서, fatty acid hydroperoxide를 포함하는 H2O2와 alkyl hydroperoxide들의 감소되는 것은 일반적인 hydroperoxide에 대한 glutatjione peroxidse의 활성으로 이루어진다. alkyl hydroperoxide reductase (AhpC) / TSA family는 glutathione peroxidase의 selenocysteine을 대신해 촉매 작용되는 주된 부분에 따라 보존되어지는 cysteine를 갖는 새로운 타입의 peroxidase이다. 새로운 타입의 peroxidase는 prokaryote에서 eukaryote까지 발견되어지며, thioredoxin과 다른 thiol-contaning reducing agents와 함께 사용되어 hydroperoxides를 감소시킨다. 대장균에서, AhpC는 AhpF52를 거치는 NADH나 NADPH에 의해 공격되어지는 전자를 이용하여 alkyl hydroperoxide를 감소시킨다고 이전에 보고되었다. p20은 대장균의 periplasmic space에서 H2O2와 alkyl hydroperoxide 즉, 이동하는 peroxide에 대한 항산화제로 활성화 된다고 보고되었다. BCP는 cystein sulfenic acid (Cys-SOH)를 거쳐 peroxides의 감소를 촉매한다. Cysteinyl sylfenic acid는 Trx의 촉매 활성에 의해 Cys-SH에서 감소되어 진다. BCP의 기능적 Cys-45는 sulfenic acid (Cys-SOH)의 형태로 존재할 때, 그것의 인접한 공여체과 같이 Trx에 사용되어지는 근본적인 촉매작용에 따라 감소 반응에 관련되어진다. Bacillus subtilis에는 4가지 타입의 thiol peroxidase 활성이 있음이 밝혀졌다. 3개의 새로운 형태의 thiol peroxidase 활성을 보이고, AhpCI, AhpCII, BCP, p20으로 구분되고 있다. genomic DNA는 NCBI 데이터 베이스로부터 확인하였다. 이 연구는 단백질 분석으로 Bacillus subtilis에서 thiol peroxidase의 생화학적 특성을 확인하였다. Reactive oxygen species (ROS) are potent oxidant capable of damaging all cellular constituents. To protect against the toxicity of ROS, aerobic organism are equipped with an array of defense mechanism. In mammals, glutathione peroxidase acts general hydroperoxide to reduce H2O2 and alkyl hydroperoxides including fatty acid hydroperoxide. The alkyl hydroperoxide reductase (AhpC) / TSA family is a new type of peroxidase that has a conserved cysteine as the primary site of catalysis instead of selenocysteine of glutathione peroxidase. The new type of peroxidase that has been discoveres from prokaryotes to eukaryotes reduces hydroperoxides with the use of thioredoxin and other thiol-containing reducing agents. In Escherichia coli, AhpC was reported to preferentially reduce alkyl hydroperoxide with electrons provided by either NADH or NADPH via the AhpF52. p20 was reported acts as an antioxidant to remove peroxides such as H2O2 and alkyl hydroperoxide in the periplasmic space of E. coli. BCP was catalyzes the reduction of peroxides via cysteine sulfenic acid (Cys-SOH). The cysteinyl sulfenic acid was reduced to Cys-SH by catalyzing action of Trx. functional Cys-45 of BCP, which is involved in the reduction reaction as a primary catalysis with the use of Trx as its immediate electron donor, could exist in the form of sulfenic acid (Cys-SOH). The thiol peroxidase has Bacillus subtilis exists four type of the thiol peroxidase activity. Three novel isoforms showed a distinct thiol peroxidase activity and appeared to be distinctively in AhpCI, AhpCII, BCP, p20. Using those sequnces, the corresponding genomic DNA has been identified from the NCBI database. This study has biochemical characterigation of thiol peroxidase from Bacillus subtilis. This study was confirmed biochemical characterigation of thiol peroxidase from Bacillus subtilis by protein assay.