P 因子의 轉移를 利用한 突然變異 誘發과 UV 感受性 遺傳子의 遺傳學的 硏究

강병학 성균관대학교 대학원 1995 국내석사

모든 생물체는 DNA 손상을 입었을 때 이를 수리하는 체계를 가지고 있다. 초파리에서 UV 손상에 대한 수리 체계와 이에 관련된 유전자를 연구하기 위해, P인자의 전이를 이용하여 돌연변이 계통을 1748 계통 작성하였다. 이 중에서 UV 감수성 계통을 선별하기 위하여 UV를 각 계통에 2분간 조사하여 비교하였다. 작성된 돌연변이 계통 1748 계통 중에서 UV 감수성 계통 PUS25, PUS92, PUS181, FUS248 네 개를 얻었다. 각각의 UV 수성은대조구인 white 0.9370±0.0042이었고, PUS25 계통은 0.6873 ± 0.0426이었고, PUS92 계통은 0.7308 ± 0.0215이었으며, PUS181 계통은 0.8060±0.0158 이었고, PUS248 계통은 0.5728±0.0057이었다. 각각의 UV 감수성 유전자는 열성 유전자임을 알 수 있었고, 발생 단계에 따라 서로 다른 양상을 나타내어 UV 감수성 유전자가 발생 단계에 따라 영향을 미치리라 생각된다. UV 감수성 계통이 어떠한 재조합율 양상을 나타내는지를 알아 보았을때, 대조구인 white와 비슷한 재조합율을 보인 PUS25 계통을 제외하고는 모두 낮아짐을 볼 수 있었다. PUS25 계통에 대하여 R25B, R25D의 revertant를 얻었고, PUS248 계통에 대하여 R248의 revertant를 얻었다. 모두 UV 감수성 계통에 비해 생존력이 떨어졌고, UV 감수성이 대조구에 비해 높아짐을 볼 수 있었다. 이로써, 각각의 돌연변이의 UV 감수성이 삽입된 P 인자에 의한 것임을 알 수 있었다. 상보성 실험을 통하여 PUS25와 PUS248, PUS92와 PUS181 계통이 상보성이 있음을 알 수 있었다. All living things have the repiar systems when their DNA are damaged. To study the uv repair systems and uv sensitive genes in Drosophila melanogaster, established the 1718 mutant strain using the P element transposition and screened and selected 4 uv sensitive strains, PUS25, PUS92, PUS181, FUS248. UV sensitivity of white, control is 0.9370±0.0042, PUS25 is 0.6873±0.0426, PUS92 is 0.7308±0.0215, PUS181 is 0.8060±0.0158, PUS248 is 0.5728±0.0057. All uv sensitive genes are recessive genes and have the different uv sensitivity as developmental time and uv sensitive genes may be thought to give different affects as developmental time. When the recombination rates of uv sensitive strains is analyzed, except PUS25. All of them are lower than white And gained revertant of PUS25 and PUS248, R25B and R25D, R248. All has the lower viability than uv sensitive strain and uv resistant. Therefore, May be thought indirectly uv sensitivity of mutant strain is caused by inserted P element. PUS25 and PUS248, PUS92 and PUS181 strain have the complem entation ability.

I-SSR 표지자에 의한 안면도 소나무 천연림의 모수 및 차대 층위별 유전변이

문희종 고려대학교 대학원 2009 국내석사

소나무 천연집단에서 층위별 유전 다양성의 차이를 분석하기 I-SSR 표지자를 이용하여 안면도 내 모수 집단인 상층임분과 천연갱신된 하층임분 및 치수층으로 (3개 층위) 구성되어 있는 3개 지역을 조사하였다. 선정된 7개의 primer를 이용하여 384개 개체를 분석한 결과, 총 66개의 I-SSR 변이체가 관찰되었다. 발견된 전체 199개 대립유전자 중에 희귀 대립유전자 비율이 최소 16.5%에서 19.0% (평균 17.8%)에 달했다. 상층임분의 대립유전자 중 하층임분에서 1~2개 대립유전자가 손실되었고 1~4개 대립유전자가 생성되었다. 대립유전자의 차대 손실은 해당 모수층에서 선택된 수목이 차대임분에서는 종자 생산을 하지 않았거나 차대임분 수목의 표본추출시 누락됨으로 인한 결과일 가능성이 높아 보인다. 이형접합율의 기대치 (h) 및 Shannon's information index (S.I.)를 이용하여 모수집단 및 차대집단간 유전 다양성의 경향을 볼 때, 기존 다른 수종에 대해 이행된 연구들과 마찬가지로 모수층과 차대임분간 뚜렷한 차이는 발견되지 않았다. 그러나 근소하게나마 상층임분에서 하층임분으로 갈수록 증가되는 경향을 보이고 있었고, 치수층에서도 하층임분보다는 낮으나 상층임분보다는 높은 값을 나타냈다. 본 연구의 이러한 결과는 실제로 치수층의 유전다양성이 낮아졌다기보다는 최소 10년 이상의 연령폭을 가진 모수층 및 하층임분과 비교하여 치수층 연령이 1~2년생에 불과한 점과 함께 편향된 공간확보로 인해 전체 모수가 아닌 일부 모수에서만 하종되었을 가능성이 있어 보인다. AMOVA를 이용하여 유전적 분화를 분석한 결과, 지역간 유전적 분화는 거의 없는 반면, 층위간 유전적 분화는 2.6%로서 상대적으로 결코 적다고 볼 수 없으므로, 본 조사결과를 근거해 볼 때 유전적 분화가 무시될 정도로 동일한 공간적인 분포를 가지더라도 층위별 유전적 분화는 상당 부분 발생된다는 점을 추정해 볼 수 있었다. 유전적 거리값을 이용한 유집분석 결과도 지역보다는 층위에 따라 묶이는 경향을 보이고 있었다. 본 조사와 같이 차대임분에서 모수층에는 없던 새로운 대립유전자가 발견된 경우는 주변 소나무 집단으로부터 화분 확산이 가장 주요한 원인으로 보이는데, 유집분석시 치수층이 유전적으로 가장 이질적이며 차대임분에서 새로운 대립유전자의 빈도가 대부분 5%이상으로 높게 나타나고 채종원과 가까운 JJ 지역의 차대집단에서 새로운 대립유전자가 상대적으로 많은 것을 고려해 볼 때, 약 30년 전에 조성된 주변 소나무 채종원을 통해 기존 유전자와 다른 변이를 가진 화분이 유입되었을 가능성도 생각해볼 만하다. 현재 안면도 소나무림은 치수층이 추후 2~3년에 걸쳐 지속적으로 하종이 일어난다 하더라도 모수층을 대표할 만한 충분한 수의 개체에서 발생되지 않을 것으로 보이는 바, 소나무의 유전다양성을 유지하기 위해서는 인위적인 천연갱신 작업이 필요할 것으로 사료된다. To analyze the temporal genetic diversity and difference in the natural populations of Pinus densiflora, three cohorts of the maternal stands (adults) and their natural progenies (juveniles and natural regenerations) were investigated in three regions of Anmyondo. The genetic diversity and difference of selected cohorts were analyzed using the inter-simple sequence repeat (I-SSR) markers. As a result, 66 I-SSR variants from selected 7 primers were observed in 384 individuals. The rare alleles of 16.5% to 19.0% (mean of 17.8%) at the total 199 alleles that were found in the investigated populations were detected. While 1~2 alleles were not transferred from maternal stands to their progenies, 1~4 alleles were created in progenies. The lost alleles of progenies might be caused by collecting different seeds or no seeds production from progenies of selected maternal trees. As the results of similar studies, the genetic variation of progeny cohorts was found in the similar level compared with the genetic variation of the observed maternal cohorts. However, the genetic variation showed an increasing tendency in juveniles and decreased in natural regenerations. Particularly, the lower gene diversity of natural regenerations was caused by relatively restricted age of 1~2 years and biased space in investigated natural regenerations. As a result of analysis of molecular variance (AMOVA) test of each cohorts, the genetic differentiation (2.6%) among temporal cohorts within investigated regions was occurred little, compared with the genetic differentiation among those regions. These results imply that the temporal genetic variation can be appeared, even if pine stands are distributed closely to each other in Anmyondo. Clustering analysis using unweighted pair-group arithmetic average (UPGMA) also combined into cohorts rather than regions. The occurrance of new alleles in the progenies may be due to the external pollen spreading from surrounding populations. It means that a pollen flow may be from the neighboring seed orchard of Japanese red pines planted before approximately 30 years, in the aspect that natural regenerations were different from the others by clustering analysis using the UPGMA methods, band frequency of new alleles was mostly higher than 5%, and new alleles occurred relatively in progeny cohorts of JJ region located closely in seed orchard of Japanese red pines. Although the seeds of Japanese red pines in Anmyondo might have been shed continuously for 2~3 years, the enough number of individuals representing maternal stands would have not be generated. Therefore, it is needed to regenerate Japanese red pines artificially for keeping up its genetic diversity.

Cloning and Expression Profile of cDNAs in adipose tissues of Korean cattle(Hanwoo) : 한우 지방조직에서 발현하는 유전자 cloning 및 발현 양상 규명

봉진종 전남대학교 대학원 2003 국내석사

The deposition of intramuscular adipose tissue (marbling) is positively related to beef flavor and palatability and it is an important factor for high quality beef, especially in Korean cattle. Efforts have been made to produce high-marble beef using by nutritional program, castration, and immunological treatment. However, the molecular mechanism that regulates intramuscular fat deposition and its release has not been well studied. To produce high marble beef, a study is required to understand the differential mechanism that regulates the deposition and release of fat between intramuscular tissues and external adipose tissues, especially subcutaneous adipose tissues. This study was performed to understand molecular events that regulate the deposition of fat and its release in adipose tissues. The primary objective was to identify genes expressed in adipose tissues by differential screening of bovine adipocyte cDNA library. The 483 clones were subjected to partial nucleotide sequencing of 5' region of cDNA clone by using T3 primer and automatic sequencing protocol. By a search for sequence similarity in NCBI nucleotide database, mitochondrial genes were most abundant (76 clones), stearoyl CoA desaturase cDNA clones were also abundant (56 clones), osteonectin cDNA (9 clones) moderately abundant, and the total 245 clones revealed unique clones. The 17% (42 clones) of the clones was identified as known genes in bovine species, the 60% (148 clones) as known genes in human, and the 10% (23 clones) of clones revealed the unknown genes. By a functional grouping of the clones, 14% (34 clones) were categorized to metabolism and enzyme-related group (stearoyl-CoA desaturase, lactate dehydyrogenase B, fatty acid synthase, ATP citrate lyase, creatine kinase, ADP/ATP translocase, lipoprotein lipase, fatty acid binding protein, NADH dehydrogenase, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, acetyl CoA synthetase, peroxisome biogenesis gene 1, lipoate-activating enzyme, low density lipoprotein-related protein 1, preproadipsin, proteolipid protein 2, adipose tissue-specific protein adipoQ mRNA, etc), 6% (17 clones) to signal transduction/cell cycle-related group (protein phosphatase I, IGFBP-3, calcium binding protein 1, CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), cAMP-regulated phosphoprotein, stress-induced phosphoprotein 1, thyroid hormone receptor interactor 6, chloride intracellular channel 4, cyclin G1, cyclin H, etc), and 4% (11 clones) to cytoskeleton and extracellular matrix components (vimentin, ankyrin 2, gelsolin, syntenin, tubulin alpha, type III pro-collagen, collagen type IV alphal chain, talin, microtubule-associated protein actin alpha2, intercellular adhesion molecule precursor(ICAM -3) mRNA, prefoldin 5, etc), and 176 clones to mitochondrial genes and others. The seven clones that showed similarity to other species were subjected to full sequencing in order to obtain nucleotide sequence information of open-reading frame; homolog of human CGI-105 mRNA, pig ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein (fau) mRNA, human cleavage stimulation factor 3' pre-RNA subunit 3, rat thymosin beta 4, pig putative preproadipsin mRNA, human proteolipid protein 2, human myotrophin. The cDNA clone of bovine homolog of human CGI-105 mRNA had a total length of 1262 nucleotides coding for 314 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine CGI-105 gene with those of human showed 89% similarity. The cDNA clone of bovine homolog of ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein (fau) mRNA had a total length of 474 nucleotides coding for 133 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine fau gene with those of human, pig, rat and mouse showed over 97% identity. The ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein has been known to be involved in the ATP-dependent proteolytic activity of ubiquitin. The cDNA clone of bovine homolog of human cleavage stimulation factor 3' pre-RNA subunit 3 mRNA had a total length of 1323 nucleotides coding for 398 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine cleavage stimulation factor 3' pre-RNA subunit 3 gene with those of human and mouse showed 99.7% similarity. The cDNA clone of bovine homolog of p ig putative preproadipsin mRNA had a partial length of 820 nucleotides coding for 250 amino acids. Comparison of the deduced partial amino acid sequences of bovine putative preproadipsin gene with those of pig showed 87.2% similarity. The cDNA clone of bovine homolog of human proteolipid protein 2 mRNA had a total length of 928 nucleotides coding for 152 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine proteolipid protein 2 gene with those of human and mouse showed 87.5% similarity. The cDNA clone of bovine homolog of rat thymosin beta 4 had a total length of 602 nucleotides coding for 44 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine thymosin beta 4 with those of human, mouse, and rat showed 93.1% similarity. The cDNA clone of bovine homolog of human myotrophin mRNA had a total length of 790 nucleotides coding for 118 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequences of bovine myotrophin gene with those of human, mouse, and rat showed 83.9% similarity. Expression patterns of selected genes were compared by northern method between subcutaneous- and intramuscular-adipose tissues of Korean cattle. The 20 □ of total RNAs obtained from subcutaneous and intramuscular adipose tissues were separated on 1.0% formaldehyde/agarose gel. The total RNA on the gel was transferred onto the membrane by capillary reaction. The blot was hybridized with the [^(32)P]-labeled cDNA clone. The five clones (CGI-105 protein, cellular repressor of ElA-stimulated genes, glutamate dehydrogenase 2, chloride intracellular channel 4, and talin) were highly expressed in intramuscular adipose tissues than in subcutaneous adipose tissues. Expression levels of nine clones (prefoldin 5 gene, ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein gene, ADP/ATP translocase T1 mRNA, prostatic binding protein, isolate D NADH dehydrogenase subunit 1, V-1 protein, retinoic acid receptor responder, hydroxyacyl glutathione hydrolase, and butyrophilin) were similar between two adipose tissues. Expression levels of seven clones (polyubiquitin, tumor protein translationally-controlled 1, proteolipid protein 2, insulin growth factor binding protein 3, transaldolase 1, gelsolin, and vimentin mRNA) were higher in subcutaneous tissues than in intramuscular tissues. Expression of twelve clones (ATP citrate lyase, selenoprotein P-like protein, cleavage stimulation factor 3' pre-RNA subunit 3, calmodulin, lae mRNA for lipoate-activating enzyme, steroid sensitive gene-1, putative preproadipsin, adipose tissue-specific protein adipoQ, fatty acid synthase, deoxyguanosine kinase, HSPC040 protein, and CGI-83 protein) were detected in subcutaneous tissues but expression was not detected in intramuscular tissues. Results demonstrate that metabolic events may be less active in intramuscular adipose tissues than in subcutaneous adipose tissues. Further studies (functional role, etc) of the five clones that showed high expression levels at intramuscular tissues are required to develop methods for increasing marbling of Hanwoo beef. The obtained 245 clones will be useful to study lipid metabolism and signal transduction pathway in adipose tissues and to study obesity in human. 근내지방 축적 (marbling)은 풍미와 맛을 향상시키는 것으로 알려져 있고 한우의 육질을 결정하는 중요한 요소이다. 지방조직대사는 부위별로 다른 것으로 알려져 있어, 근내지방 축적 증진을 통한 고급육 생산을 위해서는 근내지방과 다른 지방 조직 특히 피하 지방과 지방 대사의 차이를 이해하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 차별혼성화 방법으로 한우 지방조직 CDNA library에서 483개의 cDNA clone을 선발하였다. Clone들에 대한 5' region의 부분적인 염기서열을 T3 primer를 이용하여 자동염기서열 분석기기로 분석하였다. Clone들의 sequences를 NCBI nucleotide database와 homology search하여 이미 밝혀진 clone인지 새로운 clone인지를 분석하였다. NCBI database와 비교한 결과, 총 245개가 서로 다른 유전자였으며, 238개는 중복된 clone이였다. Mitochondrial gene이 76개 clone으로 가장 많은 중복성을 보였으며, stearoyl CoA desaturase 유전자도 56개 clone이 중복되어 높은 중복성을 보였다. NCBI database와 비교하였을 때, 사람에게서 알려진 유전자와 유사성이 높은 clone이 148개로 60%의 가장 많은 비율을 보였고, bovine에서 밝혀진 clone이 42개로 17%의 비율을 나타냈고, 기타 다른 종과 유사성이 높은 clone이 32개로 13%의 비율을 보였다. NCBI database와 유사성이 매우 낮은 unknown 유전자는 23개 clone으로 10%의 비율을 보였다. 확보한 유전자를 기능별로 분류한 결과, 지방대사와 관련한 유전자 및 효소 부류가 34개 clone으로 14%의 비율을 보였고, stearoyl-CoA desaturase, lactate dehydrogenase B, fatty acid synthase, ATP citrate lease, creatine kinase, ADP/ATP translocase, lipoprotein lipase, fatty acid binding protein, NADH dehydrogenase, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, acetyl CoA shythetase, peroxisome biogenesis gene 1, lipoate-activating enzyme, low density lipoprotein-related protein 1, preproadipsin, proteolipid protein 2, adipose tissue-specific protein adipoQ mRNA 등의 유전자가 이 부류에 속하였다. 신호전달 및 세포주기 관련 유전자가 17개 clone으로 7%의 비율이었으며, protein phosphatase 1, IGFBP-3, calcium binding protein 1, CCAAT/ enhancer binding protein (C/EBP), cAMP-regulated phosphoprotein, stress-induced phosphoprotein 1, thyroid hormone receptor interactor 6, chloride intracellular channel 4, cyclin Gl, cyclin H 등의 유전자가 이 부류에 속하였다. 세포골격과 extracellular matrix 성분 관련 유전자가 11개로 4%의 비율을 보였으며, vimentin, ankyrin 2, gelosin, syntenin, tubulin alpha, type III pro-collagen, collagen type IV alphal chain, talin, microtubule-associated protein actin alpha2, intercellular adhesion molecule precursor (ICAM-3) mRNA 등의 유전자가 이 부류에 속하였다. mitochondrial 유전자 및 그 밖의 유전자가 176개로 72%의 비율을 보였다. 다른 종에서 유사성을 보이는 유전자들의 open-reading frame을 알기 위해서 full sequencing을 수행하였다. ; Homolog of human CGI 105 mRNA, pig ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein (fau) mRNA, human cleavage stimulation factor 3'pre-RNA subunit 3, rat thymosin beta 4, pig putative preproadipsin mRNA, human proteolipid protein 2, human myotrophin. Human CGI-105의 bovine homolog cDNA clone은 314개 아미노산을 coding하며 1262 염기서열로 구성되어 있고, human의 아미노산 서열과 비교할 때 89% 유사성을 보였다. Ubquitin-like/S30 ribosomal fusion protein(fau)의 bovine homolog cDNA clone은 133 아미노산을 coding하며 474 염기서열로 구성되어 있고, human, pig, rat, mouse들의 아미노산 서열과 비교할 때 97% 유사성을 보였다. Human cleavage stimulation factor 3'pre-RNA subunit 3의 bovine homolog cDNA clone은 398개 아미노산을 coding하며 1323 염기서열로 구성되어 있고, 다른 종의 아미노산 서열과 비교할 때 99.7% 유사성을 보였다. Pig putative preproadipsin의 bovine homolog 부분적인 cDNA clone은 250개 아미노산을 coding하며 820 염기서열로 구성되어 있고, pig의 아미노산 10번째부터 255번째까지 아미노산 서열과 비교할 때 87.2% 유사성을 보였다. Human proteolipid protein 2의 bovine homolog cDNA clone은 152개 아미노산을 coding하며 928염기서열로 구성되어 있고, 다른 종의 아미노산 서열과 비교할 때 87.5% 유사성을 보였다. Rat thymosin beta 4의 bovine homolog cDNA clone은 44개 아미노산을 coding하며 602 염기서열로 구성되어 있고, 다른 종의 아미노산 서열과 비교할 때 93.1% 유사성을 보였다. Human myotrophin의 bovine homolog cDNA clone은 118개 아미노산을 coding하며 812 염기서열로 구성되어 있고, 다른 종의 아미노산 서열과 비교할 때 83.9% 유사성을 보였다. 일부 유전자들의 발현 양상을 한우 피하 및 근내지방조직에서 northern 방법으로 비교하였다. 피하 및 근내지방조직으로부터 얻은 20 □ total RNA는 1.0% formaldehyde/agarose gel에서 분리하였다. Gel 상에서 분리한 total RNA를 capillary reaction을 통해서 membrane에 전이시켰다. 전이된 membrane은 [^(32)P]-labeled cDNA clone으로 혼성화하였다. Human CGl-105 protein의 bovine homolog, cellular repressor of EIA-stimulated genes, glutamate dehydrogenase 2, chloride intracellular channel 4, talin 유전자들은 피하지방조직에서보다 근내지방조직에서 높은 수준으로 발현되었다. Prefoldin 5 gene, ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein gene, ADP/ATP translocase T1 mRNA, prostatic binding protein, isolate D NADH dehydrogenase subunit 1, V-1 protein, retinoic acid receptor responder, hydroxyacyl glutathione hydrolase 및 butyrophilin 유전자들은 두 지방조직에서 비슷한 수준으로 발현하였다. Polyubiquitin, tumor protein translationally-controlled 1, proteolipid protein 2, insulin growth factor binding protein 3, transaldolase 1, gelsolin 및 vimentin mRNA 유전자들은 근내지방조직보다 피하지방에서 높은 발현 수준을 보였다. ATP citrate lyase, selenoprotein P-like protein, cleavage stimulation factor 3' pre-RNA subunit 3, calmodulin, lae mRNA for lipoate-activating enzyme, steroid sensitive gene-1, putative preproadipsin, adipose tissue-specific protein adipoQ, fatty acid synthase, deoxyguanosine kinase, HSPC040 protein 및 human CGI-83 protein 유전자들은 피하지방조직에서만 발현되었으며, 근내지방조직에서는 발현되지 않았다. 이러한 결과는 근내지방조직은 피하지방조직에서보다 대사적 기작이 덜 활성화되어 있음을 암시한다. 확보한 245 clone들은 지방조직에서 지방대사 및 신호전달과정에 대한 연구와 인간의 비만 연구에 이용할 수 있을 것이다.

Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α (PGC-1α)에 의한 인체 인슐린 유전자의 전사활성 조절과 동맥경화증 인자들의 발현조절 패턴 분석

장원구 경북대학교 대학원 2007 국내박사

췌장 베타세포에 주로 존재하는 PDX-1 및 BETA2/NeuroD, MafA 등은 인슐린 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다 (Whelan et al., 1990; Mellou et al., 2002; Ohlsso et al., 1993; Peterse et al., 1994; Naya et al., 1995; Kataoka et al., 2002; Matsuok et al., 2003). 하지만 인슐린 유전자의 발현을 저해하는 기작에 대한 연구는 소수에 불과하다. 대표적으로는 forskolin이 cAMP를 증가시켜서 인슐린 유전자의 발현을 저해하는 것과 (Ding et al., 2003), suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3)에 의한 인슐린 유전자의 발현 감소가 보고 되었다 (Laubner et al., 2005). 한편, Glucocorticoid는 췌장 베타세포에서 인슐린의 발현 및 분비를 감소시킬 수 있다는 연구 보고가 있었다 (Olefsky et al., 1975; Pierluissi et al., 1986; Olefsky et al., 1976; Schacke et al., 2002). 본 연구에서는 glucocorticoid가 GR을 통하여 인슐린 유전자의 promoter 활성을 감소시키고 PGC-1α가 이러한 효과를 더욱 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 PGC-1α의 siRNA를 사용하여 이러한 효과가 사라짐을 확인하였다. 이 후에 수행된 EMSA 등의 실험을 통하여 GR이 인슐린 유전자의 promoter 상에 있는 palindrome sequences (Palin, TCTCCTGGAGA, -284/-274 bp)에 결합하는 것을 확인하였다. 또한 PGC-1α가 GR의 결합력을 증가시킴으로써 인체 인슐린 유전자의 promoter 활성을 더욱 감소시킴을 증명하였다. 마지막으로 Palin 부위의 point mutant를 만들어 promoter 활성을 조사한 결과, PGC-1α와 GR에 의한 억제효과가 사라짐을 확인하였다. 또한 이러한 palindrome 부위는 인체 뿐만 아니라, 설치류에서도 나타나는 부위이다. 이것은 인슐린 유전자의 전사활성 억제 기작에 palindrome 부위가 매우 중요하게 작용 하고 있음을 나타내는 것이다. 또한 본 연구에서 밝혀진 Palin 부위는 고농도의 글루코오스에 의한 조절 부위이기도 하다 (Pino et al., 2005). 지금까지 밝혀진 바에 의하면 당 독성에 의하여 인슐린의 발현 및 분비가 감소하는 것으로 알려져 있는데 그 기작은 PDX-1 혹은 MafA와 같은 전사인자들의 활성이 감소함으로써 이러한 현상이 일어난다고 설명하고 있다 (Marshak et al., 1999; Olson et al., 1993; Harmon et al., 1999; Poitout et al., 1996; Sharma et al., 1995). 본 연구에서는 췌장 베타세포의 하나인 INS-1 세포에서 고농도의 글루코오스 처리에 의하여 인슐린 및 PGC-1α, GR 유전자의 발현변화를 realtime RT-PCR로 분석하였다. 고농도의 글루코오스 처리에 의하여 인슐린은 처리시간 의존적으로 발현이 감소한 반면, PGC-1α 유전자는 발현이 증가하는 것으로 확인되었다. 하지만 GR 유전자는 발현의 차이가 없는 것으로 확인되었다. 이 결과로 유추해 보면 고농도의 글루코오스 처리에 의하여 증가된 PGC-1α가 인슐린 유전자의 promoter상에서 GR의 결합을 증가시켜 인슐린 유전자의 전사활성을 억제한다고 사료되어진다. 그래서 당 독성 상태에서의 인슐린 유전자의 발현감소에 PGC-1α가 중요하게 작용하는 것으로 생각할 수 있으며, 당뇨병 모델에서 PGC-1α가 증가해 있는 현상과도 일치한다. 결국 췌장 베타세포에서의 PGC-1α가 증가되어 있는 것은 기아 및 당뇨병 상태를 의미하는 것으로 이해 할 수 있다. 하지만 이에 대한 자세한 기작은 추후로 계속 연구가 진행 되어져야 할 사항이다. 당뇨 합병증의 하나로 야기되는 동맥경화증은 매우 중요한 대사 질환의 하나이다. 동맥경화증의 진행에 있어 혈관 평활근세포의 역할은 매우 중요하다. 초기에 면역과 염증반응에 의하여 대식세포가 거품세포로 변하게 되는 과정에서 혈관 평활근세포의 이주 및 증식이 나타나며 결국, 혈관 내경을 좁히는데 기여하게 된다. 본 연구에서는 당 대사에 있어 중요한 역할을 하고 있는 PGC-1α가 혈관 평활근세포에서 유전자들의 발현조절을 통하여 동맥경화증과 연관을 보이는지 조사하기로 하였다. PGC-1α 유전자를 혈관 평활근세포에 과발현 시키고 DNA microarray를 통하여 발현의 차이를 보이는 유전자를 선별한 결과, 염증반응에 관여하는 chemokine의 발현이 높은 수준으로 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특히, CXCL10, CXCL11 및 TNFLSF10 등의 유전자들이 뚜렷한 발현의 차이를 보였다. 이상의 결과를 가지고 실제로 염증반응을 유발하여 동맥경화증을 일으키는 TNFα를 혈관 평활근세포에 처리하여 발현의 차이를 보이는 유전자를 탐색하여 결과를 비교하였다. 그 결과 TNFα 처리에 의하여 높은 수준의 발현 차이를 보이는 유전자 역시, 예상대로 면역과 염증반응에 관계되는 유전자였다. PGC-1α 과발현 조건에서와 마찬가지로 CXCL10, CXCL11 및 TNFLSF10 유전자 등이 높은 수준으로 증가하였다. 이상의 결과는 PGC-1α가 염증반응 유전자를 조절하여 동맥경화증을 유도할 가능성이 있음을 의미한다. 이 후 실험은 CXCL10 유전자에 초점을 맞추어 DNA microarray 결과를 재검증 하였다. PGC-1α에 의한 CXCL10 유전자의 발현 수준을 realtime RT-PCR 및 Northern blot을 통하여 분석하였고, 확보된 promoter construct를 이용하여 promoter 활성도를 분석하였다. 그 결과 PGC-1α는 CXCL10 유전자의 mRNA 수준 및 promoter 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 하지만 추후로 PGC-1α에 의한 자세한 발현조절 기작에 대한 연구가 지속적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다. 본 연구의 결과는 크게 두 가지로 요약할 수 있다. 첫째는 췌장 베타세포에서 PGC-1α는 인슐린 유전자의 전사활성을 억제하는 기작을 밝힌 것이다. 인체 인슐린 유전자의 promoter 활성을 억제하는 역할을 가지는 Palin이라는 부위 (-284/-274 bp)를 탐색하였고 GR이 Palin 부위에 결합하는 것을 증명하였다. 또한 PGC-1α가 GR에 의한 Palin 부위의 결합력을 증가시킴으로써 인체 인슐린 유전자의 promoter 활성이 억제됨을 증명하였다. 둘째는 혈관 평활근세포에서 PGC-1α가 염증반응에 관계된 유전자들의 발현을 증가시키는 역할을 수행하고 있다는 것을 밝혔다. 특히, CXCL10 유전자의 경우는 PGC-1α에 의하여 promoter 활성도 증가됨을 확인하였다. 이것은 PGC-1α가 동맥경화증의 진행에 영향을 미칠 수 있음을 간접적으로 증명한 것이다. Transcriptional regulation of insulin gene plays a critical role in maintenance of pancreatic beta cell function in response to various stimuli.It has been shown that the islet-enriched transcription factors pancreatic duodenal homeobox factor 1 (PDX-1), beta-cell E-box trans-activator 2(BETA2), and v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A (MafA) act as important positive transcriptional regulators of the insulin gene.Previous reports have also shown that insulin transcription can be suppressed by a variety of different mechanisms. For example, forskolin suppresses insulin transcription by increasing intracellular cyclic adenosine mono phosphate (cAMP) and cAMP-responsive element-binding activity.Preproinsulin gene expression is inhibited by suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) that stimulates leptin. In the present study, we observed that dexamethasone (Dex)treatment of glucocorticoid receptor (GR)-overexpressing cells decreased insulin promoter activity. We also found that when these cells overexpressed PGC-1α, insulin promoter activity was suppressed further.Moreover, when we treated GR-expressing and Dex-treated INS-1 cells with PGC-1α siRNA, the depressed insulin mRNA levels in these cells were nearly restored. We speculated that the PGC-1α may enhance the negative regulatory effect of GR/Dex. Subsequent experiments strongly supported that PGC-1α is functionally involved in the negative GR-mediated transcriptional regulation of the insulin gene that is elicited by glucocorticoid treatment. An electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) reveals that GR binds to one of the palindrome region (Palin,TCTCCTGGAGA, -284 to -274 bp) in the insulin promoter, and that Dex treatment of GR-overexpressing cells enhanced this binding activity. We then showed that overexpression of PGC-1α also enhanced the binding of GR to Palin in the presence of Dex treatment. Moreover, a point mutation in the Palin element of the insulin reporter blocked not only thesuppressive effect of Dex in GR-overexpressing cells, it also blocked the suppressive effect of PGC-1α on its own. Thus, the majority of GR-mediated suppression is mediated by the Palin sequence and the PGC-1α enhances GR binding to this glucocorticoid response element (GRE). However, it remains to be determined whether the augmenting effect of PGC-1α on GR function is implemented directly or indirectly. In addition, the Palin region of insulin promoter in human is conserved in several species including mouse and rat. In order to elucidate the crucial effect of GR and PGC-1α on insulin promoter activity, it would be necessary to examine the effect of PGC-1α and GR on insulin promoter activity in another species. We found that insulin promoter of mouse and rat has the similar sequences. Its location is similar with that of human insulin promoter. The sequences are as follows: mouse, -AGAAGGTCTCACCTTCT, -293 to -277 bp; rat, -AGAGGGCCTTACCCTCT, -298 to -282 bp.Previous studies have shown that GR can act as a glucocorticoid-regulated transcription factor and that, upon binding to a GRE, it can associate with transcriptional regulators that modify or remodel chromatin or interact with the basal transcriptional machinery.Four types of GREs have been identified, namely, simple GRE, GRE half-site (GRE1/2s), composite elements composed of simple GRE and GRE1/2s and negative GREs (nGREs). The former three types are involved in gene expression activation while the nGREs represses geneexpression. With regard to its interaction with nGREs, it has been shown previously that GR interacts directly with nGRE. The nGREs have a similar recognition sequence as GREs, although the consensus sequence of nGREs tend to be more variable than the GRE consensus sequence. The Palin region has been reported previously to be responsible for the effects on INS-1 cells of chronic glucose exposure. The cardinal features of glucotoxicity, reduced insulin secretion and insulin gene expression, correlate closely with reduced expression and insulin-promoter binding of beta-cell-enriched transcription factors such as PDX-1 and MafA. However, the mechanism by which Palin regulates these responses to glucotoxicity has not defined. Our current study showed that when INS-1 cells exposed to high glucose (25 mM), the PGC-1α expression increased. In contrast, high glucose levels had no effect on GR expression. These observations suggest that high glucose levels may, like glucocorticoid treatment, suppress insulin gene transcription by elevating PGC-1α levels, which in turn enhance the Palin-binding activity of GR.Thus, PGC-1α may play a significant role in the transcriptional repression of the human insulin gene that is induced by chronic high glucose stimulation. Vascular smooth muscle cells (VSMCs) play an important role in the development and progression of atherosclerosis. Common events in vascular response to arterial injury include proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (VSMCs) within arterial intimal andneointimal formation in injured vessels. In the present study, we evaluated the expression patterns by PGC-1α overexpression in VSMCs. We found that when these cells overexpressed PGC-1α, immune or inflammatory response genes were highly expressed. Tumor necrosis factor α (TNFα), a cytokine secreted by VSMCs and macrophage in atherosclerotic lesions, regulates a variety of cellular function of VSMCs. Alpha lipoic acid (ALA), a well known antioxidant,act as a cofactor of the pyruvate dehydrogenase in the mitochondria. We examined differentially expressed genes in the VSMCs treated with TNFα in the presence or absence of ALA using DNA microarray analysis. A ligand for the CXC chemokine ligand 10 (CXCL10), CXC chemokine ligand 11 (CXCL11) and tumor necrosis factor ligand superfamily 10 (TNFLSF10) were highly expressed by TNFα treatment. Interestingly, the expression of these genes were increased by an overexpression of PGC-1α.Furthermore, we confirmed that the PGC-1α stimulates promoter activity of CXCL10 gene. These results may imply a connection between the PGC-1 α and atherogenesis through its involvement in the regulation of inflammatory response genes. In conclusion, the PGC-1α appears to suppress the transcription of insulin gene by assisting GR binding to Palin in INS-1 cells. It also helps to increase the expressions of many genes involved in the inflammatory response in VSMCs.

개별꽃과 큰개별꽃의 생식특성이 유전다양성 및 구조에 미치는 영향

김영희 高麗大學校 大學院 2012 국내석사

요약 개별꽃속의 개별꽃과 큰개별꽃은 개방화와 함께 폐쇄화를 생성하는 독특한 번식 특성을 지닌다. 두 종 모두 종자번식과 함께 영양번식이 이루어져 형태적으로 유사하고 서식 환경 또한 비슷하다. 그러나 개별꽃은 개체에 따라 1∼5개의 개방화를 피우는데 반해 큰개별꽃은 모든 성숙 개체에서 1개의 개방화를 피운다. 따라서 본 연구는 두 종간에 개방화 및 폐쇄화에 의한 생식 정도의 차이를 구명하고 이것이 유전구조에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 개체 당 개방화에서 생산되는 종자 수는 여러 개의 개방화를 피우는 개별꽃 (23.7개)이 큰개별꽃 (7.8개)보다 3배 더 많았다. 폐쇄화 역시 개별꽃 (44.1개)이 큰개별꽃 (22.5개)보다 2배 더 많았다. 따라서 전체 종자 생산에서 개방화 종자가 차지하는 비중이 개별꽃은 34.9%로 큰개별꽃의 25.7%에 비해 높았지만 그 차이가 크지는 않았다. 공간구조 분석을 위한 2×4 m 조사구내에서 개별꽃과 큰개별꽃은 각각 44개와 39개의 genet가 식별되었다. Clonal diversity를 나타내는 G/N 값은 각각 0.349와 0.222로 개별꽃에서 높은 다양성을 보였다. 따라서 전체적으로 큰개별꽃에서 개별꽃에 비해 영양번식이 더 많이 이루어지고 있는 것으로 판단되었다. 두 종 모두 공간적 거리가 증가함에 따라 개체 간 평균 kinship coefficient가 감소하여 공간적 유전구조가 형성되어 있음을 나타냈다. 그러나 그 정도는 두 종간에 차이가 있었는데 공간구조의 강도를 나타내는 Sp 값이 개별꽃 (0.095)에 비해 큰개별꽃 (0.229)이 2배 이상 컸다. Ramet level에서 추정된 Sp 값이 genet level에 비해 개별꽃, 큰개별꽃이 약 49.3%, 76.8% 더 높아서 큰개별꽃에서 영양번식의 효과가 더 크게 나타남을 알 수 있었다. Correlogram에서 추정된 유전적 patch의 크기 역시 개별꽃, 큰개별꽃에서 각각 0.9 m, 1.7 m로 큰개별꽃이 더 크게 나타났다. 전체적으로 개별꽃이 큰개별꽃에 비해 개방화에 의한 종자생산량과 비중이 커서 유전다양성 또한 더 높게 유지되고 있는 것으로 해석되었다. 또한 큰개별꽃이 개별꽃에 비해 영양번식과 폐쇄화 번식에 의한 번식 비중이 커서, 공간적으로 더 동질성이 강하고 큰 유전적 patch를 형성하고 있는 것으로 추정되었다. 영양번식의 비중이 높은 큰개별꽃에서는 더 많은 ramet를 생산하여 상대적으로 개방화의 생산량을 높임으로써 나름대로 상당한 정도의 유전다양성을 보이는 것으로 해석되었다. 그러나 이상의 결과를 보다 구체적으로 구명하기 위해서는 다양한 서식 환경을 대상으로, 더 많은 표지자 (특히 공우성 표지자)를 이용한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다. ABSTRACT Pseudostellaria heterophylla and P. palibiniana are dimorphic cleistogamous species which produces chasmogamous (CH) and cleistogamous (CL) flower within a same individual. Both species propagate by both seed reproduction and vegetative reproduction, thus being morphologically similar and inhabit in similar environment. P. heterophylla blossoms 1 to 5 CH flowers per individual whereas P. palibiniana blossoms only one CH flower. This study aimed to identify the difference in seed production by CH and CL flowers between the two species and its effect on genetic diversity and structure. The number of seed produced by CH flower for each plant was three-times higher in P. heterophylla (23.7 seeds) than in P. palibiniana (7.8 seeds). Likewise, the number of seed produced by CL flower was two-times higher in P. heterophylla (44.1 seeds) than in P. palibiniana (22.5). Thus, the proportion of CH seeds in the entire seed production was slightly higher in P. heterophylla than in P. palibiniana (34.9% vs. 25.7%, respectively). In a quadrat of 2 x 4 m for spatial genetic structure, 44 and 39 genets were identified for P. heterophylla and P. palibiniana, respectively. G/N value that reflects clonal diversity was higher in P. heterophylla (0.349) than in P. palibiniana (0.222). Thus, it was considered that vegetative reproduction was more extensive in P. palibiniana than in P. heterophylla. In both species, significant spatial genetic structure was detected. Sp value that reflects the intensity of spatial structure was two-times higher in P. palibiniana (0.229) than in P. heterophylla (0.095). Sp value estimated at ramet level was higher than that at genet level in both species. It was about 49.3%, and 76.8% for P. heterophylla and P. palibiniana, respectively, indicating stronger effects of vegetative reproduction on the spatial structure in P. palibiniana. The size of genetic patch estimated from correlogram was larger in P. palibiniana (1.7 m) than in P. heterophylla (0.9 m). Overall, it was considered that higher genetic diversity was maintained in P. heterophylla than in P. palibiniana due to higher production and proportion of seed from CH flower in P. heterophylla. In addition, it was assumed that spatially more closely related and larger genetic patch was formed for P. palibiniana than for P. heterophylla because of more extensive vegetative propagation and higher proportion of seed by CL flower in P. palibiniana. However, it was pointed out that further ecogenetic studies employing a growing number of molecular markers (particularly, codominant) are required to enhance the reliability of the outcomes from the present study.

동맥경화 진행과정의 Monocyte chemotactic protein-3 신호전달에 관한 연구

최 용진 慶北大學校 2005 국내석사

Human monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3) belongs to CC chemokines, which are cytokines involved in the cell recruitment, inflammation and carcinogenesis. Especially, the expressional level of MCP-3 gene is increased by oxidized low-density lipoproteins (oxLDL), suggesting that it might have a strong relationship with atherosclerosis. The oxLDL has been shown to induce peroxisome proliferator activated receptorγ (PPARγ), one of the nuclear receptors, which aslo shown to function as a transcriptional factor involved in the adipocyte differentiation and the entire lipid metabolism. The PPARγ regulates gene expression in response to various activator, including 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2) and thiazolidinedione (TZD) which are agonists of the PPARγ. The PPARγ binds preferentially to PPAR response element (PPRE) through cooperative interactions by forming a heterodimer with corresponding partner, retinoid X receptor (RXR), in order to regulate transcription. The RXR is a receptor for the 9-cis-retinoic acid, one of metabolites of vitamin A. It plays a central role in the regulation of intracellular receptor signalling and mediate ligand-dependent transcription. Recently, it was reported that PPARγ:RXR heterodimer can regulate the gene expression and differentiation of the monocyte and is expressed at a high level in the foam cells of atherosclerotic lesions. It has been suggested that MCP-3 gene expression has a deep connection with PPARγ:RXR heterodimer. In this study, we investigated the effects of the endogenous PPARγ ligand(15d-PGJ2) and RXR specific ligand (9-cis-retinoic acid) in human monocytic THP-1 cells using Northern blots, immunocytochemistry and microarray. The expression of PPARγ gene, induced by the addition of 15d-PGJ2 and 9-cis-retinoic acid in the culture media, also induced MCP-3 gene expression. The level of MCP-3 gene expression was shown to be especially high in a specific-concentration of the 15d-PGJ2 in combination with 9-cis-retinoic acid. In this concentration, it was found that the PEA-3 gene is expressed in the same pattern with that of MCP-3. It has previously shown that there is a PEA-3 binding element on the promotor of MCP-3 gene. The PEA-3 appears to bind with PEA-3 binding element on the MCP-3 promoter and seems to be involved in transcriptional regulation of the human MCP-3 gene. On the other hand, it was found in this study that the more MCP-3 gene expressed, the less expressed LXR gene, suggesting an opposite role between RXR and LXR in the aspect of atherogenesis. In the microarray analyses using an entire expressed genes in the THP-1 cells after addition of MCP-3 protein into the culture media, numerous genes were found to be differentially expressed, which are related to atherogenesis, differentiation, apoptosis, inflammation and others. Those genes are needed to be investigated further. In conclusion, the signal from the oxLDL seems to be transmitted to the MCP-3 via PPARγ:RXR (or LXR) heterodimer followed by the binding of PEA-3 on the promotor site of MCP-3 gene, which might be important in the entire mechanism of atherogenesis.

Rhodococcus sp. BH4 유래 α/β hydrolase type의 AHL-lactonase (JydB) 특성화 및 jydB 유전자 결손돌연변이주에 관한 연구

이상원 배재대학교 일반대학원 2020 국내석사

Quorum sensing(QS)은 세균이 특정한 화학적 언어를 이용하여 세포 간 신호를 주고받는 독특한 커뮤니케이션(cell-to-cell communication) 시스템이다. 일부 세균은 자신이 세포외로 분비하는 신호분자인 N-acyl homoserine lactones(AHLs)의 세포 외 농도를 감지하여 농도에 비례하는 주변 세포밀도를 인식한다. 특히 많은 병원성 세균에서 AHL 신호분자를 매개로 하는 QS 시스템에 의해 병독성 관련 유전자들의 발현이 조절된다. 따라서 병독성을 억제하고자QS 시스템 차단하는 전략을 quorum quenching (QQ) 이라고 한다. 본 연구에서는 충청북도 옥천 하수처리장 분리한 QQ 균주인 Rhodococcus sp. BH4의 whole genome 분석 결과를 이용하여 in silico 분석을 통해 기존에 알려진 phosphotriesterase (PTE) family type의 AHL-Lactonase인 QsdA 단백질 이외에 추가적인 QQ 효소를 암호하고 있는 유전자를 규명하여 jydB (No. 1288)로 명명하였다. jydB 유전자가 암호화 하고 있는 QQ 효소를 특성화하기 위해 대장균에서 재조합 단백질을 고발현을 하여 Ni-NTA column을 이용하여 정제하였다. 기질인 AHL에 대한 재조합 단백질 JydB의 분해 기작을 규명하기 위하여 기질과 반응 후 분해 산물에 산을 첨가하여 AHL 복구 실험 및 분해 산물의 HPLC 분석을 통해 jydB 유전자가 암호화하는 효소는 AHL-lactonase 임을 확인하였다. 재조합 AHL-lactonase JydB와 HHL, OHHL 및 OHL의 반응을 통하여 모든 기질이 분해됨을 확인하였다. 또한 재조합 단백질 JydB 효소반응 속도론 분석을 통하여 특히 BHL과 OHHL에 활성이 우수한 것을 확인하였다. 재조합 AHL-lactonase JydB의 효소적 특성분석을 통해 JydB는 40℃까지 열안정성을 가지며, Co-factor로서 Cu2+가 필요함을 확인하였고, 생물막 형성 억제능도 우수하였다. 새로 발굴한 jydB 유전자에 의한 단백질의 추정 아미노산 서열은 기존에 알려진 AidH와 46%의 상동성을 보였으며, Aii810 , AiiM , QqlB , QqlG 및 QqlM과 각각 28%, 31%, 44%, 47%, 47%의 상동성을 보였다. JydB의 아미노산 서열 및 추정 활성부위 분석 결과 α/β hydrolase superfamily의 AHL-lactonase 와 많은 특징을 공유하는 것을 확인하였다. 결과적으로 Rhodococcus sp. BH4는 서로 다른 두 가지 type의 AHL-lactonase를 동시에 가지고 있음을 확인하였으며 두 가지 AHL-lactonase 유전자들의 결손돌연변이주 구축을 통해 두 유전자에 QQ활성에 미치는 영향을 조사하였다. Quorum sensing (QS) is a cell-to-cell communication system between bacteria, which regulates gene expression using specific signaling molecules. Some bacteria detect extracellular concentrations of N-acylhomoserine lactones (AHLs) to recognize population density. In many pathogenic bacteria, genes associated with virulence are controlled by the AHL-mediated QS system. Therefore, the quorum quenching (QQ) strategy for inhibition of QS system has attracted a lot of attention. Our lab isolated Rhodococcus sp. BH4 from Okcheon Sewage Treatment Plant and it was selected as representative QQ strain. In silico analysis of BH4 genome revealed the presence of a second AHL- lactonase (named JydB), in addition to previously reported QsdA which belongs to phosphotriesterase (PTE) family. In this study, the recombinant JydB was overexpressed in E. coli and analyzed for its biochemical properties. The amino acid sequence comparison of JydB and other known AHL-lactonases showed 46% homology with AidH and varying degrees of sequence similarity with Aii810, AiiM, QqlB, QqlG and QqlM (ranging from 28 to 47%). Active site analysis of predicted amino acid sequence of JydB indicated that it shares many characteristics of AHL-lactonases belonging to α/β hydrolase superfamily. AHL restoration and HPLC analyses were carried out to confirm the degradation mechanism of JydB and prove that it is an AHL-lactonase. Purified recombinant JydB exhibited high degrading ability of AHLs of varying lengths, however a preference towards BHL and OHHL was observed during the enzyme kinetics experiments. Furthermore, recombinant JydB showed thermal stability up to 40°C, and it’s hydrolytic activity against AHLs increased in the presence of Cu2+. Inhibition of biofilm formation was also observed against Aeromonas sp. Additionally, knockout mutants of the two AHL-lactonase genes were constructed in order to characterize their properties and assess the effects of these enzymes on the overall QQ capacity of Rhodococcus sp. BH4.

벼 인산 신호 전달 유전자의 기능 분석과 유용아미노산 고함유 기능성 벼의 육종 : Molecular Characterization of Rice Phosphate Signaling Genes and Molecular Breeding of Glycine and Alanine-Rich Rices

허연재 동아대학교 대학원 2011 국내석사

벼는 동남아시아, 라틴아메리카 등지에서 주요 식량자원으로 이용되고 있으며 게놈 서열이 모두 밝혀져 있어 단자엽 식물의 연구 모델 작물로 널리 이용되고 있다. 토양 내의 인산은 식물이 이용하기 어려운 형태로 존재하고 있어 많은 양의 비료를 첨가하더라도 실제 식물이 이용할 수 있는 양은 매우 적다. 본 연구는 벼 식물체의 인산 결핍시 뿌리 특이적으로 유도되어 인산 신호전달 경로에서 하류 유전자의 발현을 조절할 것으로 예상되는 OsUPS, OsMAPK3 유전자와 산왕거미로부터 분리한 AvDrag 유전자를 벼에 형질전환하여 기능을 분석하였다. OsUPS 유전자는 다른 식물 유전자들과 52% 정도의 유사도를 보이고, U-box domain과 GKL domain을 가지고 있다. OsUPS 유전자는 인산결핍 처리 후 30분부터 강한 발현을 보이고, 철 결핍 처리 후 4시간째에 가장 강한 발현을 보였다. OsUPS 재조합 단백질을 이용하여 ubiquitination assay를 수행한 결과, E1, E2와 OsUPS 단백질이 모두 존재하는 조건에서 ubiquitination 된 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. OsUPS mutant 식물체는 유전자의 promoter 영역에 T-DNA가 삽입되어 있는 것으로 나타났다. WT, 과발현 식물체와 mutant를 인산이 충분 혹은 결핍된 영양액에서 키운 뒤 인산 함량을 측정하였다. WT 식물체에 비해 과발현 식물체는 인산 함량이 10% 정도 낮았고, mutant 식물체는 인산함량이 40% 정도 높게 나타났다. RT-PCR 수행 결과 과발현 식물체의 뿌리에서 OsSPX1, OsIPS1, OsPHO2가 발현 되는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과 OsPT1, 2, 3, 4 유전자가 mutant 식물체의 뿌리에서 과발현되는 것을 확인하였으며 이 유전자들의 발현이 mutant 식물체의 인산함량증가에 영향을 미친 것으로 예상된다. OsUPS 유전자의 promoter 부분을 분리하여 형질전환체의 GUS 발현을 확인한 결과 인산 결핍, salt 처리, 자스몬산 처리시 식물체의 측근과 뿌리털 부분으로 GUS 발현이 집중되었다. OsMAPK3 유전자는 다른 식물체의 MAP kinase 유전자와 70 % 이상의 상동성을 보였다. OsMAPK3는 인산과 철 결핍, 자스몬산 처리에서 강하게 발현하였다. OsMAPK3 단백질은 autophosphorylation하였고, substrate인 MBP를 인산화시켜 kinase activity를 가지는 것으로 나타났다. WT과 OsMAPK3 유전자 과발현 식물체를 인산 충분 혹은 결핍 조건의 영양액에서 키운 뒤 생육차이와 인산 함량을 측정하였다. 인산 함량은 WT에 비해 과발현 식물체가 30% 정도 높게 나타났다. OsMAPK3 유전자의 promoter 부위를 분리하여 형질전환체를 제작한 뒤 GUS 발현을 확인하였고 인산 결핍시 식물체의 뿌리와 뿌리털 부분에서 GUS 발현이 강하게 나타났다. Silk protein을 암호화하는 AvDrag 유전자의 C-terminal 부위를 종자 특이적으로 발현하는 prolamin promoter에 연결하여 construct를 제작한 뒤 벼에 형질전환시켰다. 얻어진 T0 식물체를 PCR, Northern, Western blot을 통해 선발하였다. 형질전환된 벼 종자를 출수 후 10일 간격으로 샘플링하여 Northern과 Western blot을 수행한 결과 종자가 성숙될수록 유전자와 단백질 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 종자의 아미노산 함량을 측정한 결과 alanine, glycine, serine, glutamic acid의 함량이 30~50% 정도 증가한 것으로 나타났다. 쥐의 성장률, 지질대사 및 간 기능 개선에 미치는 형질전환 벼의 효과를 조사한 결과, 간기능, 지질대사 및 당질대사의 개선효과가 있는 것으로 나타났다.

Aminoglycoside-(3)-N-acetyltransferase Ⅱ 유전자의 Promoter 부위에 관한 연구

신창호 한양대학교 1992 국내석사

양식장으로부터 quorum quenching 균주의 분리 및 Rhodococcus sp. BH4 유래 AHL-lactonase 유전자들에 관한 연구

유두환 배재대학교 대학원 2018 국내석사

Bacteria recognize changes in their population density by sensing the concentration of signal molecules, N-acyl-homoserine lactones (AHLs). AHL-mediated quorum sensing (QS) plays a essential role in virulence in pathogenic bacteria, so the interference of QS, called as quorum quenching (QQ), has received great attention. A QQ strategy can be applied to development of alternative anti-infective agent for preventing bacterial disease. In particular, close correlation between QS and biofilm formation related to fish pathogen has been reported. In this study, we isolated diverse AHL-degrading bacteria from fish farms that can inhibit biofilm formation. Samples were collected from the fish farm of the National Institute of Fisheries Science (NIFS) and the fish farm near Geumriver. Enrichment culture method containing AHL as the sole carbon source was used for the screening of quorum quenching bacteria. Diverse AHL-degrading strains of Enterococcus sp., Raoultella sp., Dermacoccus sp., Bacillus sp., Paenarthrobacter sp., Microbacterium sp and Rhodococcus sp. were identified by 16S rDNA sequence analysis. The isolated strains were characterized for their QQ activities and analyzed for hemolytic activity. As a result, The strain with high AHL degrading activity and non-hemolytic activity was finally selected, which is Rhodococcus sp. GLH1. Rhodococcus sp. GLH1 was genetically very similar to Rhodococcus sp. BH4. Besides a known AHL- lactonase (QsdA) of Phosphotriesterase (PTE) type, we found an additional gene for a QQ enzyme from sequenced genome of Rhodococcus sp. BH4. The putative QQ enzyme of Rhodococcus sp. BH4 showed 46% and 45% amino acid sequence identities with AHL-lactonase and AHL-acylase (AidH and AiiO) from Ochrobactrum sp. T63 and Ochrobactrum sp. A44, respectively. In this study, we revealed that the QQ enzyme gene named jydB encodes an AHL-lactonase through AHL restoration experiment and HPLC analysis using the recombinant E. coli. Several completely unrelated families of enzymes with AHL-lactonase activity, including metallo-β-lactamase, phosphotriesterase (PTE), α/β hydrolase, and GDSL-like hydrolase, have been described. The deduced amino acid sequence of the BH4 AHL-lactonase analyses revealed that it shares many of the known characteristics of α/β hydrolases fold family. The G-X-Nuc-X-G motif or the histidine residue conserved in α/β hydrolases is known as a critical point for the AHL- degradation activity. Although, many bacteria possess only a single type of quorum-quenching enzyme, Rhodococcus sp. strains have been reported to possess activities for AHL-lactonase, AHL-acylase and oxidoreductase. In this study, we have identified the presence of different type of AHL-lactonase besides QsdA in Rhodococcus sp. BH4. High AHL-degrading activity and prominent biofilm inhibition capacity of Rhodococcus sp. BH4 compared to other QQ strains may be due to the presence of multiple QQ enzymes including two types of AHL-lactonases aside from the AHL-acylase and oxidoreductase. 세균은 상호 간의 의사소통을 위한 신호 분자로서 N-acyl-homoserine lactones (AHLs)를 사용한다. 세균의 quorum sensing (QS) 시스템은 자신이 세포 외로 분비하는 AHL의 농도를 감지함으로써 동료 세균들의 밀도 변화를 인식하고, 밀도 의존적으로 다수의 유전자 발현을 조절한다. AHL을 매개로 하는 quorum sensing 시스템은 많은 병원성 세균에서 병독성 유전자 발현 유도에 핵심적인 역할을 하기 때문에, 이러한 QS 시스템을 차단하는 quorum quenching (QQ) 전략이 많은 관심을 받고 있다. 따라서 QQ 전략은 세균 감염을 억제하기 위한 대체 항감염제의 개발에 응용할 수 있는데, 특히 양식 어류의 세균병과 관련되어 QS과 대표적 병독요소인 생물막 형성 사이에는 아주 밀접한 관계가 있다고 보고되고 있다. 본 연구에서는 양식장에서 어병과 관련된 QS 차단 및 생물막 형성 억제를 위한 전략으로서 양식장 유래 QQ 균주를 탐색하였다. 국립수산과학원의 넙치 시험용 양식조와 금강 주변의 양식장에서 sample을 채취하여 AHL을 분해하는 세균들을 분리하였다. 분리된 AHL 분해 미생물들의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 국립수산과학원의 양식조로부터 Enterococcus sp., Raoultella sp., Dermacoccus sp. 및 Bacillus sp. 균주를 분리하였고, 금강 주변의 양식장에서는 Paenarthrobacter sp. Microbacterium sp. 및 Rhodococcus sp. 균주를 분리하였다. 분리된 균주 모두 높은 AHL 분해활성을 보였으며, AHL 분해활성이 가장 우수하고 용혈성을 띄지 않는 균주를 최종 선별하여 Rhodococcus sp. GLH1으로 명명하였다. Rhodococcus sp. GLH1의 16S rDNA 분석 및 특정 QQ 효소 유전자의 분석 결과 기존 실험실 분리 QQ 균주인 Rhodococcus sp. BH4와 유전적으로 매우 유사한 균주임을 확인하였다. Rhodococcus sp. BH4의 전장 유전체 분석 결과를 이용하여 in silico 분석을 통해 기존에 보고된 Phosphotriesterase (PTE) type의 AHL-lactonase 이외에 추가적인 QQ 효소의 존재를 확인하였다. 새로운 QQ 효소를 암호화하고 있는 유전자 (No. 1288)의 아미노산 서열은 AHL-lactonase(AidH) 및 AHL-acylase(AiiO)와 각각 46% 및 45%의 동일성을 보였다. 본 연구에서는 유전자 No. 1288을 jydB로 명명하고 대장균에서 발현하여 효소 반응 후 반응산물에 산을 첨가하여 AHL 복구 실험 및 HPLC 분석을 통해, 추가적 QQ 유전자가 암호화하는 효소는 최종적으로 AHL-lactonase 임을 확인하였다. 또한 JydB의 아미노산 서열 및 추정되는 활성부위 분석결과 α/β hydrolase superfamily의 AHL-lactonase 와 많은 특징을 공유하는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 Rhodococcus sp. BH4는 기존에 알려진 PTE type의 AHL-lactonase 이외에 α/β hydrolase type의 AHL-lactonase를 가지고 있음을 규명하였다. 궁극적으로, Rhodococcus sp. BH4가 가지고 있는 여러 다양한 QQ 효소 중에서 유전적으로 아직 밝혀져 있지 않은 AHL-acylase 와 oxidoreductase 이외에 서로 다른 두 가지 type의 AHL-lactonase를 동시에 가지고 있음을 규명하였다.