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- 학과정보 : 생물공학협동과정 (검색결과 410 건)
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인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)의 알콜 추출 공정 후 발생하는 인삼박으로부터 다당체와 올리고당을 분리하여 각각 복강 대식세포(peritoneal macrophage)의 면역활성 증가 효과와 장내미생물 생육 효과에 대하여 연구하였다. 인삼박에 상업용 식물세포벽 가수분해효소 처리(EP3)와 압출성형 후 열수추출법(EGP1)에 의하여 다당체를 분리한 후 Balb/c mice의 복강 대식세포의 활성을 in vitro에서 검색한 결과 EP3와 EGP1이 농도 50 ㎍/㎖에서 lysosomal phosphatase activity가 각각 174.7%와 153.1%로 유의적인 활성을 나타내었으며, NO 및 H_(2)O_(2) 생성에서도 농도 의존적인 활성을 보였다(P<0.05). 또한 in vivo에서도 이들 다당류는 자극이 없는 기저상태 뿐만 아니라, mitogen(LPS)에 의해 자극된 상태에서도 NO 생성량이 대조군에 비해 유의적으로 높은 활성을 보였다(P<0.05). EP3와 EGP1의 조성은 각각 33.9%와 32.7%의 uronic acid, 65.6%와 65.1%의 중성당(galactose, arabinose, rhamnose, glucose), 0.5%와 2.2%의 단백질로 구성되었다. 인삼박 올리고당의 최적 효소로서 cellulase와 pectinase를 복합적으로 사용였고, Recycling Preparative HPLC로 올리고당을 분리하였다. 최적 효소 조건에서의 올리고당 수율은 17.3%이었으며, 78.8%의 glucose로 구성되었다. 인삼박 올리고당의 장내미생물에 대한 효과를 in vitro로서 확인한 결과 Bifidobacterium species는 인삼박 올리고당을 선택적으로 이용하였고, Cl. perfringens는 전혀 이용하지 못하였다. 위와 같은 인삼박의 면역계 및 장내미생물에 대한 생물활성은 앞으로 의약 및 식품 등의 이용분야의 연구를 통하여 새로운 기능성 소재로서 산업적으로 활용성이 높을 것으로 기대된다. The biological activities of ginseng marc polysaccharides (GMPs) and oligosaccharides (GOs) isolated from ginseng marc were investigated in terms of macrophage-immunostimulating activities and the growth effect of intestinal microorganism, respectively. Two polysaccharides were isolated by commercial enzyme hydrolysis (EP3) and hot water extract of extruded ginseng marc (EGP1), which were used to measure macrophage activities in Balb/c mice under in vitro and in vivo conditions. EP3 and EGP1 increased lysosomal phosphatase activity, NO and H_(2)O_(2) production in a dose dependant manner in vitro (P<0.05). Under in vivo condition, EP3 and EGP1 showed 130% NO production when the macrophage was triggered with 20 ㎍/㎖lipopolysaccharide (LPS) as a mitogen. EP3 and EGP1 were composed of 33.9%, 32.7% uronic acid, 65.6%, 65.1% neutral sugar and 0.5%, 2.2% protein, respectively. Optimal enzyme for the isolation of GOs from ginsneg marc was found to be the mixture of Econase CE and Pectinex Ultra SP-L (6:4, w/w). GOs were effectively separated from enzyme hydrolysates using the recycling preparative HPLC. Under the optimal condition, the yield of GOs were 17.3% and it was composed of 78.8% glucose. GOs promoted selectively the growth of Bifidobacterium species, but not that of Cl. perfringens under in vitro conditions. The observed immune activity of GMPs and the growth effect for intestinal microorganism of GOs suggest that GMPs and GOs have high potentials as functional food ingredients or nutraceuticals.
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Kaempferia pandurata Roxb.로부터 분리된 panduratin A 유도체의 식품 유해 미생물에 대한 항균활성
본 연구에서는 식품유해 미생물에 대한 천연 항균 활성을 갖는 물질을 생강과(Zingiberaceae) 식물로부터 탐색하여 분리·정제하고 유효성분의 항균활성을 연구, 검토하였다.생강과 식물 13종의 100% ethanol 추출물로부터 식품유해 미생물인 Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes에 대하여 항균활성을 탐색하였다. 이 가운데 Kaempferia pandurata Roxb. 추출물이 B. cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes의 식품유해 미생물에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 값이 각각 16, 64, 8 ㎍/mL이였으며, 최소사멸농도(minimum bactericidal concentration, MBC) 값은 각각 32, 125, 16 ㎍/mL로서 가장 높은 항균 활성을 나타내었다.Kaempferia pandurata Roxb. ethanol 추출물을 ethyl acetate, n-butanol, water으로 분획하였으며, 이 중 ethyl acetate 분획물에서 항균활성이 있음을 확인하였다. 다음, ethyl acetate 분획물을 silica gel column chromatography, Rp-18 column chromatography, prep-HPLC를 이용하여 3종의 단일 항균 물질을 분리하였다. 3종의 단일물질에 대하여 1H-NMR, 13C-NMR, FAB-MS 등의 기기분석과 문헌의 분석 자료들을 근거로 하여 구조를 분석한 결과, 각각 panduratin A와 isopanduratin A, 4-hydroxypanduratin A 임을 확인하였다.B. cereus, C. perfringens, L. monocytogenes, S. aureus, V. parahaemolyticus에 대한 panduratin A의 MIC값은 각각 4, 32, 1, 2, 2 ㎍/mL이며, isopanduratin A는 각각 2, 32, 1, 2, 2 ㎍/mL이고, 4-hydroxypanduratin A는 각각 16, 16, 4, 16, 16 ㎍/mL로서 매우 강력한 항균활성을 나타내었다. 생균수 측정에 의한 time-kill assay를 한 결과, K. pandurata Roxb.의 ethanol 추출물, panduratin A, isopanduratin A, 4-hydroxypanduratin A를 식품유해 미생물에 대해 처리하여 4∼24 시간 배양 했을 때 완전하게 미생물 생육이 저해되는 것을 확인하였다.K. pandurata Roxb. ethanol 추출물의 식품적용 항균활성 결과, 곡류 생식에서 B. cereus에 대한 항균활성은 1 log CFU/mL 감소, 육류에서의 L. monocytogenes에 대한 항균활성은 2 log CFU/mL 감소, 당근에서의 S. aureus에 대한 항균활성은 2 log CFU/mL 감소하였다.식물이나 동물 또는 미생물의 자원에서 천연의 항균소재를 찾기 위해 많은 연구가 이루어지고 있으나, 현재까지 강한 항균활성을 지닌 항균제는 발견하지 못하였다. 그러나 지금까지의 결과들을 종합하여 보면, panduratin A, isopanduratin A, 4-hydroxypanduratin A는 식품유해 미생물에 대한 생육 저해 작용이 뛰어나고, 가공식품은 장기간 보존할 수 있어 식품산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다. Crude extracts from 13 kinds of Zingiberaceae plants were prepared using 100% ethanol and screened for the antibacterial activity toward the three pathogens Bacillus cereus, Clostridium perfringens and Listeria monocytogenes. The minimal inhibitory concentration(MIC) and the minimum bactericidal concentration(MBC) were determined as antibacterial activities. Among the extracts tested, Kaempferia pandurata Roxb. extract showed the strongest inhibitory activity against all three pathogens with MICs of 16, 64, 8 ㎍/mL for B. cereus, C. perfringens, L. monocytogenes respectively. The MBC of B. cereus, C. perfringens, L. monocytogenes were 32, 125, 16 ㎍/mL, respectively. Based on these results, Kaempferia pandurata Roxb. was chosen for further investigation.The ethanol extract was further separated into three solvent fractions using ethyl acetate, n-butanol, or water. When tested for the antibacterial activity, only the ethyl acetate fraction exhibited the antibacterial activity and thus was used for purification of the inhibitory substances using silica gel column chromatography, RP-18 column chromatography and prep-HPLC. Three antibacterial isolated from the ethyl acetate fractions were identified as panduratin A, isopanduratin A and 4-hydroxypanduratin A on the basis of instrumentation using 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC and FAB-MS.When assayed against B. cereus, C. perfringens, L. monocytogenes, S. aureus, V. parahaemolyticus, MICs of panduratin A were 4, 32, 1, 2, 2 ㎍/mL, respectively, while that of isopanduratin A showed 2, 32, 1, 2, 2 ㎍/mL, both showing strong antibacterial activity against the all 5 foodborne pathogens tested. On the other hand, MIC of 4-hydroxypanduratin A were 16, 16, 4, 16, 16 ㎍/mL, respectively, showing slightly less activity than the other two compounds. According to a time-kill assay by the viable cell count method, treatment of 5 foodborne pathogens with Kaempferia pandurata ethanol extract, panduratin A, isopanduratin A and 4-hydroxypanduratin A resulted in complete growth inhibition for 4∼24 hours incubation.When antimicrobial effect of K. pandurata Roxb. ethanol extract was applied to Saeing-Shik, pork meat and carrot, the B. cereus, L. monocytogenes and S. aureus were significantly reduced 1, 2 and 2 log CFU/mL, respectively.In spite of many researchs on searching for natural antimicrobial agents, from various plants, animals and microorganisms for food applications only a few strong natural preservatives are under review for possible application to foods. The results of this study strongly suggest that the three antibacterial compounds, namely panduratin A, isopanduratin A and 4-hydroxypanduratin A, from Kaempferia pandurata Roxb. may be used in food systems in order to prevent the growth of foodborne pathogens and extend the shelf-life of processed foods.
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Yang, Sun Mo 연세대학교 일반대학원 2016 국내석사
Gene Expression Omnibus (GEO), Array Express 등의 저장소에 등록된 DNA 마이크로어레이(microarray)와 차세대 염기 서열 분석(NGS)을 통해 얻어진 막대한 양의 유전자 발현 실험 데이터는 누구나 자유롭게 사용가능 하도록 배포되고 있다. 이러한 대량의 데이터를 분석함으로써 유전자의 기능을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 질병 연구에 새로운 힌트를 찾을 수 있다. 본 연구에서는 사람과 흰쥐에 대해 6000개가 넘는 DNA 마이크로어레이 기반의 GEO 시리즈 데이터를 가져와 유전자들의 발현되는 패턴을 계산하고, 선행지식을 바탕으로 평가하여 만들어진 네트워크를 제작하고, 사람과 흰쥐에 대해 각각 384개와 248개의 동시발현 유전자 네트워크를 이용하였다. 이들 네트워크 내의 동시발현 유전자 쌍들은 특정한 약물 혹은 질병과 유전자의 기능을 연구한 GEO 시리즈의 데이터로부터 온 것 이며 색인된 정보를 이용하면, 각 유전자 쌍에서부터 약물 및 질병 등의 생물의학 용어들을 각 유전자 쌍과 연결 지을 수 있게 된다. 본 연구에서는 GEO 시리즈의 메타 정보에서 해당 연구의 출판된 논문정보(PubMed citation)를 찾고, 생물의학분야 카탈로그인 의학주제표목(MeSH; Medical Subject Headings) 색인 정보를 찾아내어 생물의학적 맥락으로 연결되는 일련의 관계를 데이터베이스로 구축하였으며 웹 서버로 제작하여 공개하였다 (http://www.coexpedia.org). 사용자는 하나 또는 여러 개의 유전자를 웹사이트에 질의하면, 질의한 유전자를 포함하는 유전자 쌍들을 네트워크 뷰어를 통해 살펴 볼 수 있으며, 특정 생물의학적 색인으로도 확인해 볼 수 있다. 이 연구에서는 사람의 BRCA1 유전자가 심장의 기능 및 알츠하이머병과 관련되어 있음을 예측하고 검증하였다. 무료로 공개되어 서비스하고 있는 이 서비스를 이용하면 연구자들은 질병에 관련된 후보 유전자를 찾고 관련 합병증을 예측할 수 있을 것이다. Massive high-throughput gene expression profiling data from the microarray and next generation sequencing are deposited in public data repositories such as Gene Expression Omnibus (GEO), Array Express and Short Read Archive (SRA). Their data can be downloaded anyone who wants to use. Mining these large data can provide new hints for disease research. From over 6000 GEO series, expression patterns of genes were calculated to generate individual co-expression networks for each series. The quality of each co-expression networks was assessed by the training set based scoring method which resulted in 384 networks for the human and 248 networks for the mouse. The co-expressions were inferred from individual studies that investigated gene functions about particular biomedical contexts such as diseases and drugs. Gene pairs in the networks are associated with Medical Subject Headings (MESH) by PubMed information of GEO accessions. The COEXPEDIA web server (http://www.coexpedia.org) searches one or more genes, and it provides the co-expression network composed of linkages of neighbors of the query. It also provides MeSH headings related to the network allowing the users to identify biomedical contexts.
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Kim, Donghi 연세대학교 일반대학원 2016 국내석사
The aim of this study was to isolate lactic acid bacteria from traditional fermented foods which can produces functional saponins, ginsenoside Rd, Rg3, Rh2 and compound K by hydrolyzing ginsenoside Rb1 and saponins of red ginseng concentrates. Several lactic acid bacterial strains were isolated from fermented food samples. Among the total 200 isolated strains, 65 strains showed β-glucosidase activity which was examined using esculin agar plates. The β-glucosidase producing strains were further incubated with the protopanaxadiol major saponin ginsenoside Rb1. As a result, some of the strains were showed the ability to hydrolyze the β-glucosyl linkages in ginsenoside Rb1. Amongst a strain designated as WJ-7 was exhibited the most potent ability to convert ginsenoside Rb1 into pharmacologically highly efficient minor ginsenoside Rg3. Moreover, the WJ-7 along with MPFE enzyme and red ginseng extract successfully synthesized into another pharmacologically active minor ginsenoside CK which conformed by TLC and HPLC. The similarity analysis based on 16S rRNA gene sequence revealed that the WJ-7 strain phylogenetically related to the genus Lactobacillus and it is closely related to Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei. The growth characteristics of strain Lactobacillus paracasei subsp. paracasei showed that the highest growth was observed in 100% MRS medium with pH 6.5 to 7.0 for 24 hrs at 37 °C incubation temperature. In conclusion, in this study lactic acid bacteria isolated from fermented foods had ginsenoside conversion activity, and these might be utilized further to develop as functional food for betterment of healthy human kind. 본 연구에서는 전통발효식품에서 분리한 미생물, 미생물유래 효소를 이용하여 진세노사이드 Rb1 및 홍삼농축액에 포함되어있는 사포닌을 가수분해하고 기능성 사포닌 ginsenosides Rd, Rg3, Rh2 및 compound-K를 생산하고자 하였다. 20종의 전통발효식품을 수집하여 MRS media를 이용하여 약 200여종의 미생물을 분리하였다. 이중 가수분해 활성능이 있는 미생물을 구분하기 위하여 esculin agar를 이용하여 65개의 β-glucosidase활성 균주를 분리하였다. 각 분리한 균을 24~72h 액체 배양한 후 ginsenoside Rb1, 홍삼농축액과 1:1 비율로 각각 반응시켜 minor saponin, 즉 2차 대사산물로의 전환을 확인하였다. 분리된 몇몇 균주들은 Rd, Rg3, F2등의 생산이 가능한 활성을 나타내었으며, 그 효능 및 효과를 증대시키기 위하여 미생물 유래 효소인 multipact FE를 함께 처리 하였을 때, F2의 함량증가와 compound-K가 추가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. Rd, Rg3, F2등으로의 전환 활성을 나타내는 균주 중에서 활성이 우수한 strain WJ-7을 동정한 결과 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.로 확인되었다. 본 연구 결과, 발효식품으로부터 분리된 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei WJ-7은 진세노사이드 전환 활성을 가지고 있어 이를 적용한 건강기능식품으로서의 개발 가능성을 확인할 수 있었다.
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마이크로파 처리시 외압이 Saccharomyces cerevisiae와 Escherichia coli의 불활성화에 미치는 영향
When the pressure is treated during microwave irradiation, the thermal energy generated from the inside of the cell is not efficiently transferred to the outside of the cell. Then the vapor pressure brought about by the temperature rise inside the cell swells the cells, which finally results in destroying the cells due to the rupture. This study was conducted to study the effect of pressure inside the container during microwave treatment using Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli as target microorganisms.The survival rate of S. cerevisiae with 137 kPa pressure for 30 second at 60℃ and 600 W was 2 log higher than non-pressed microwave treatment. E. coli also increased 1 log survival rate with 167 kPa pressure. Shape, size, cell membrane, and cell wall affected the most significantly the survival rate depending on pressure. The outflow of UV absorption material and K+ ion from the cells was similar to the survival rate depending on pressure.The surface observation using scanning electron microscope showed the rough surface of S. cerevisiae with microwave treatment. It was also found that the cells without pressed microwave treatment showed the more swollen surface than those with pressed microwave treatment. E. coli with non-pressed microwave treatment had many holes on cell membrane and cell walls and the damage was more significant.Through transmission microscope observation, it was observed that S. cerevisiae with pressed microwave treatment was damaged inside of the cells. S. cerevisiae with non-pressed microwave treatment gave more damaged and the cells were almost destroyed. E. coli showed the same result as that of S. cerevisiae.When microwave was given, the survival rate of S. cerevisiae and E. coli was dependent on the external conditions such as a growing stage of host bacteria, cluture temperature, pH of suspension, etc.. This study also showed that pressure inside the container affected inactivation of microorganisms.The results if this study suggested that pressure with microwave makes difference on the survival rate of microorganisms. It was also found that S. cerevisiae and E. coli showed the maximum survival rates respectively at 137 kPa and 167 kPa, respectively. 미생물이 현탁된 용매에 마이크로파를 가하면 미생물은 온도 상승에 의해 사멸된다. 또한 세포는 추가적으로 마이크로파에 의하여 순간적으로 세포 내부에서 발생한 열에너지를 효과적으로 바깥으로 전달하지 못하여 급격한 온도 상승이 일어나며, 수증기압의 상승이 발생하여 세포를 팽창시키고, 결과적으로 세포가 터지는 현상으로 인하여 미생물이 사멸된다. 이때 처리 용기 내부에 압력을 가하여 처리하면 세포 내부에서 발생한 수증기압에 상응하는 외부 압력에 따라 미생물의 불활성화가 영향을 받는다.본 연구에서 진핵세포의 대표적인 Saccharomyces cerevisiae와 박테리아의 대표적인 Escherichia coli를 대상 균주로 마이크로파 처리시 처리 용기 내부에 가해지는 압력의 영향을 비교하였다.S. cerevisiae는 30초 동안 60℃에서 600 W의 에너지 강도로 처리 용기 내부의 압력을 137 kPa으로 가했을 때 가압하지 않았을 때와 비교하여 2 log의 생존율이 증가하였으며 E. coli는 167 kPa에서 처리했을 때 1 log의 생존율이 증가하였다. 세포의 자외선 흡수 물질의 유출이나 K+ 이온의 유출도 압력에 따라 생존율과 유사한 결과를 나타내었다.주사현미경을 이용한 표면관찰에서 가압하지 않고 마이크로파 처리한 S. cerevisiae의 표면이 가압 처리한 균주보다 더 거친 모양을 하고 있었으며 손상정도가 도 심하다는 것을 알 수 있었다. E. coli도 마찬가지로 가압하지 않고 처리한 세포가 가압하여 처리한 세포보다 세포벽과 세포막의 파괴에 의한 구멍이 다수 존재하며 손상 정도가 더 크다는 것을 알 수 있었다.투과 현미경 관찰 결과 처리하지 않은 S. cerevisiae의 내부는 세포의 기본 구조를 가지고 있었으며 가압하여 처리한 것은 세포의 구성 성분이 마이크로파에 의해 손상되었다는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 가압하지 않고 처리한 균주는 내부물질의 손상 정도가 가압하여 처리한 세포보다 더 크며 대부분의 구성 성분이 파괴되었다는 것을 알 수 있었다. E. coli의 투과 현미경 관찰에서도 가압하여 처리했을 때보다 가압하지 않고 처리한 것이 손상정도가 컸다는 것을 알 수 있었다.마이크로파 처리시 외부 조건, 즉 균주의 생육단계, 배양시 온도, 처리현탁액의 pH 등에도 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.위의 실험 결과로부터 마이크로파 처리시 가압하여 처리하면 미생물의 생존율이 달라지며 S. cerevisiae는 137 kPa에서, E. coli는 167 kPa에서 최대 생존율을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 두 균체의 외압에 의한 최대 생존율의 차이는 미생물의 형태 및 특성에 의한 것으로 생각된다.
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Myristica fragrans에서 분리한 macelignan의 Propionibacterium acnes에 대한 항균 및 항염증 활성
In this study, a single compound showing excellent antibacterial activity against Propionibacterium acnes, an acne causing bacterium, has been isolated from medicinal plants and its antibacterial and anti-inflammatory activities have been identified.By the antibacterial activity screening against P. acnes of methanol extracts of 200 domestic and foreign medicinal plants, Caesalpinia sappan, Curcuma aromatia, Curcuma longa, Curcuma zedoaria, Myristica fragrans, and Sophora flavescens were primarily selected for their high antibacterial activity. Among six medicinal plants, methanol extract of Myristica fragrans showed the lowest MIC value of 62.5 ㎍㎖. Further antibacterial activity studies for individual solvent fractions of methanol extract of Myristica fragrans showed that MIC of ethyl acetate fraction was 31.3 ㎍㎖ while other fractions didn''t show any activity. The single compounds have been isolated from the ethyl acetate fraction, and they have been identified as macelignan (C20H24O4), machilin A (C20H22O4), myristicin (C11H12O3), nectandrin B (C20H24O5), and oleic acid (C18H34O2).Macelignan exhibited 2 ㎍㎖ of minimum inhibitory concentration (MIC). Macelignan showed higher antibacterial activity then those of compounds currently used for acne treatment: such as retinoic acid (31.3 ㎍㎖) and azelaic acid (1,000 ㎍㎖). Moreover MIC of macelignan activity was comparable to that of antibiotics such as erythromycin (1 ㎍㎖), tetracycline (1 ㎍㎖) and clindamycin (2 ㎍㎖). Especially, macelignan showed the bactericidal activity of killing almost all P. acnes in 2 hours at 5 ㎍㎖. Macelignan showed high antibacterial activities not only against P. acnes but also against other skin disease causing bacteria: Micrococcus luteus (MIC 2 ㎍㎖), Staphylococcus aureus (MIC 250 ㎍㎖) and Staphylococcus epidermidis (MIC 500 ㎍㎖).When P. acnes was treated with macelignan at 10 ㎍㎖, efflux of intracellular materials and damage of cell walls was observed. Thus it was concluded that macelignan kills cells by damaging cell walls. Besides its antibacterial activity, macelignan showed inhibitory activity against inflammation mediating agents and related enzymes in a concentration dependant manner, and also showed high inhibitory activity against acne inflammation inducing cytokines. 본 연구에서는 여드름 유발 원인균인 Propionibacterium acnes에 대한 항균 활성을 갖는 물질을 약용식물로부터 탐색하여 분리·정제하고 유효성분의 항균활성과 항염증활성을 연구, 검토하였다.국내외 약용식물 200종의 methanol 추출물의 P. acnes에 대한 항균활성을 well diffusion assay법에 의해 스크리닝한 결과, 항균활성이 높은 Caesalpinia sappan(소목), Curcuma aromatia(강황), Curcuma longa(울금), Curcuma zedoaria(봉출), Myristica fragrans(육두구), Sophora flavescens(고삼)을 후보 시료로 선발하였다. 1차 선발한 시료의 P. acnes에 대한 minimum inhibitory concentration (MIC)를 측정한 결과, Myristica fragrans의 methanol 추출물의 MIC 값이 62.5 ㎍㎖로 가장 높은 항균 활성을 나타내어 최종 항균물질로 선정하였다. Myristica fragrans의 methanol 추출물을 용매 분획하고 각분획의 항균 활성을 검토한 결과, ethyl acetate 분획물의 MIC가 31.3 ㎍㎖으로 항균활성이 약 2배 증가하였고, 다른 분획물에서는 활성이 나타나지 않았다. Ethyl acetate 분획물에 함유된 항균물질을 silica gel column chromatography법과 Rp-18 column chromatography법을 이용하여 최종적으로 단일 분리하였으며, 분리된 각 물질을 1D-NMR, 2D-NMR, EI-MS 등의 기기분석을 통하여 동정한 결과 macelignan(C20H24O4), machilin A(C20H22O4), myristicin(C11H12O3), nectandrin B(C20H24O5), oleic acid(C18H34O2)이였다. 이들 성분의 P. acnes에 대한 MIC 값은 macelignan 2 ㎍㎖, nectandrin B 62.5 ㎍㎖, oleic acid 125 ㎍㎖, machilin A 500 ㎍㎖, myristicin 1,000 ㎍㎖으로 macelignan이 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 현재 여드름 치료제로 사용되고 있는 물질들의 P. acnes에 대한 MIC값이 31.3 ㎍㎖ (retinoic acid)내지 1,000 ㎍㎖ (azelaic acid)인 것과 비교해볼 때 macelignan이 항균력이 매우 우수한 것을 알 수 있으며, 항생물질인 erythromycin (1 ㎍㎖), tetracycline (1 ㎍㎖), clindamycin (2 ㎍㎖)과 비슷한 항균력을 나타내었다. 특히, macelignan은 5 ㎍㎖의 농도에서 2시간 안에 P. acnes를 거의 사멸시키는 bactericidal 효과를 나타내었다.Macelignan은 P. acnes 이외에도 다른 피부 유해미생물인, Micrococcus luteus(MIC 2 ㎍㎖), Staphylococcus aureus(MIC 250 ㎍㎖) 및 Staphylococcus epidermidis(MIC 500 ㎍㎖)에 대해 높은 항균활성을 나타내었다.Macelignan을 10 ㎍㎖의 농도로 P. acnes에 처리하였을 때 많은 양의 세포내 물질이 유출되고 세포벽이 파괴되는 것이 관찰되어, macelignan은 세포벽에 손상을 주어 세포를 사멸시키는 것으로 판단된다. 또한, Myristica fragrans에서 분리한 macelignan은 여드름 유발 미생물에 대한 억제 효과뿐만 아니라 염증매개물질 및 염증생성 관련효소에 대해서 농도 의존적으로 억제활성을 나타내었으며, 여드름 염증을 유도하는 cytokine에 대해서도 높은 억제효과를 나타내었다.
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호열성 Fervidobacterium islandicum AW-1이 생산하는 keratinolytic protease에 관한 연구
A native feather degrading thermophilic anaerobe was newly isolated from a geothermal hot stream in Indonesia. F. islandicum AW-1 could degrade a native feather (0.8%, w/v) completely at 70℃ and pH 7 with a maximum specific growth in Thermotoga-Fervidobacterium (TF) medium. After 60 h culture, not only free amino acids such as histidine, cysteine, lysine were increased due to feather degradation but also nutritionally essential ones such as tryptophan and methionine which are rare in feather keratin were produced as a microbial metabolite. From a cell extract of F. islandicum AW-1, a thermostable membrane-bound keratinolytic protease was purified using detergent treatment with n-octyl-β-D-glucopyranoside, DEAE CL-6B ion-exchange, ultrafiltration (>50 kDa), and sephacryl S200 gel chromatography. From SDS-PAGE, and zymography, this keratinolytic protease might be a homomultimeric enzyme (>200 kDa) based on 90 kDa subunits. This enzyme exhibited activity toward casein and soluble keratin optimally at 100 C and pH 9, and had a half-life of 90 min at 100C. We investigated the mode of action of this enzyme on the native feather degradation. This study revealed that the enzyme catalyzes the cleavage of peptide bonds more rapidly following the reduction of disulfide bridges in feather keratin. The enzyme activity was strongly inhibited by 10 mM of phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Therefore, this enzyme from F. islandicum AW-1 is a novel thermostable keratinolytic serine protease. inhibited the keratinolytic protease. 환경 오염원인 가금류 폐깃털을 환경친화적인 미생물처리를 통해 유용한 물질로 전환하는 기술을 개발하기 위하여 keratinolytic protease를 생산하는 Fervidobacterium islandicum AW-1의 기본적인 특성 및 분해기작을 연구하였다. F. islandicum AW-1는 Thermotoga 속의 전형적인 세포구조인 토가(toga)를 지닌 균주로써 최적 생육온도 및 효소 생산 온도는 70℃였으며, pH는 7.0이였다. 닭털(0.8%, w/v)을 첨가한 TF 배지에서 배양한 결과 배양 6시간 후부터 닭털의 표면구조가 영향을 받기 시작하여, 48시간 후에는 90% 이상의 분해되었으며, 발효중의 닭털 유래의 유리아미노산 함량이 약 15배 정도 증가되었다. 또한 균체의 대사 산물인 tryptophan, methionine, threonine과 같은 필수아미노산 함량도 급격히 증가함으로써 가축의 단백질 보충 사료로서 산업적인 이용이 가능함을 확인하였다. 본 균주가 생산하는 keratinolytic protease는 균체의 초음파처리, 초원심 분리, DEAE ion-exchange chromatography, ultrafiltration, Sephacryl S200 gel chromatography를 통하여 정제하였다. 정제된 keratinolytic protease의 분자량은 약 90 kDa의 단일 단위구조로 이루어진 200 kDa의 거대분자로 확인되었다. / 정제된 keratinolytic protease의 최적 활성온도는 100℃였으며, 100℃에서 2시간 동안방치한 후에도 50% 이상의 잔존 활성을 지녀 열 안정성이 매우 높았다. 또한 SDS를 제외한 대부분의 계면활성제나 여러 유기 용매에 대한 저항성도 우수하였다. 단백질 저해제의 첨가에 의해 효소 활성은 크게 영향을 받지 않았으나, PMSF에 의해 활성이 크게 저해됨으로써 본 균주가 생산하는 효소는 serine protease임을 확인하였다. 효소에 의한 닭털 분해기작을 연구하고자, 환원제인 DTT와 β-mercaptoethanol을 효소와
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Seokjae Lee 연세대학교 일반대학원 2020 국내석사
Hyaluronic acid, also known as hyaluronan or hyaluronate, is a linear glycosaminoglycan composed of disaccharide repeating units, namely, [→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→]. Hyaluronic acid is a biosynthetic natural substance that is present in many skins such as animals. It is a hydroscopic substance due to many hydroxyl groups, and plays a role of moisturizing action in the skin. For the reason of moisturizing functionality, HA is applied to a lot of cosmetic fields. Cosmetic industries proceed to high molecular weight hyaluronic acid (HMWHA) hydrolyzed to low molecular weight hyaluronic acid (LMWHA) because of strong penetrability. However, (LMWHA) penetrates stratum corneum, and reaches the dermis, hyaluronic acid may have adverse effect to be absorbed directly into the blood vessels. Therefore, it is safe and desirable to improve the skin through the inner beauty that is absorbed by food intake. However, to facilitate storage when intake over a long period of time, it is necessary to reduction of microbial and endotoxin concentration. The objective of this study was to hydrolysis of hyaluronic acid and to increase endotoxin safety by UVTP circulatory system combined bubbling process. Each UV lamps proceeded to UVC (254nm) and VUV (185nm) representatively and each bubble source proceeded to microbubble (MB) and nanobubble (NB). As result, the hydrolysis efficiency, which followed the order VUVTP+NB > VUVTP +MB > VUVTP > VUV > UVCTP > UVC at various condition. VUVTP+NB-treated LMWHA had the lowest pH and endotoxin concentration and highest DPPH radical scavenging activity. The total aerobes in HA solution were 3.259 log CFU/mL and showed the totally decreased values after 1 h. The result of FT-IR, 1H NMR and Hunter color values analysis suggested that there was no obvious modification of chemical structure and color in degraded hyaluronic acid. Endotoxin concentration of VUVTP+NB-treated LMWHA was decreased in 0.33 EU/ml and this process promisingly applied long-term food intake, further cosmetic and medical device field. 히알루론산은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 수산화기가 많기 때문에 친수성 물질이며, 동물 등의 피부에서 보습 작용의 역할을 한다. 그러한 역할 때문에, 화장품에 많이 적용이 되고 있고, 고분자 히알루론산을 저분자화 시켜 흡수가 잘되는 점을 이용하고 있지만, 히알루론산이 진피층까지 흡수가 되면, 진피 속에 있는 혈관에 직접적으로 흡수가 될 우려가 있기 때문에, 히알루론산을 섭취해서 보습효과를 보는 것이 바람직하다. 하지만, 장기간 섭취 시에 보관을 용이하게 하기 위하여 미생물 총균수를 줄여야 하고, 엔도톡신 농도를 저감화 시켜야 될 필요가 있다. 그러기 위하여 우리는 Advaced oxidation process (AOP)를 고분자 히알루론산에 적용시켜, 저분자화 시키는 방법을 모색했다. AOP 시스템에서 발생하는 ·OH은 히알루론산의 β1-4 glycosidic bond 부분을 공격하여, 히알루론산의 분자구조가 깨지지않고, 기능성을 유지한 채, 저분자화 될 수 있는 장점이 있다. 여러가지 AOP 시스템중에서, 자외선 두 종류 UVC (254nm)와 VUV (185nm)를 이용하였고, 광촉매 TiO2를 접목시켰다. 더 나아가서 산화적 프로세스를 극대화시키기 위해 마이크로 버블과 나노버블을 접목시키고 연구를 진행하였다. 결과적으로, 가수분해 효율은 VUVTP+NB>VUVTP+MB>VUVTP>VUV>UVTP>UVC 순서로 효율이 좋았다. 또한, VUVTP+NB 처리한 저분자 히알루론산에서 pH와 엔도톡신 농도가 가장 낮게 나왔고, 엔도톡신은 특히 0.33EU/mL로, 미국 FDA에서 혈관에 직접 주입하는 의료 용품에 적용시킬 때 한계선으로 둔 0.5 EU/mL보다도 낮았다. 더 나아가서, DPPH 라디칼 소거능이 가장 높게 나왔고, 모든 미생물은 60분 모든 자외선 조건 처리시, 완전히 사멸하였으며, FTIR과 1H NMR Spectrometer로 분석한 결과, 광촉매와 나노버블을 병합한 시스템으로 가수분해시, 구조변화는 일어나지 않은 것을 확인하였다. 따라서, VUVTP+NB 공정시스템은 섭취하는 저분자 히알루론산을 생산할 때 유용한 공정이 될 수 있으며, 향후 화장품과 의료기기산업에도 적용이 될 수 있다.
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