국내 습지에 분포하는 모기유충의 서식처 특성 및 생물학적 방제기법 연구

한중수 상지대학교 2019 국내석사

This study was conducted to investigate the habitat characteristics and biological control of mosquito larvae inhabiting domestic wetlands in korea. A field survey on habitat characteristics of mosquito larvae was conducted 1-3 times from December 2016 to October 2017. Using the wetland monitoring data from the National Wetland Center, we performed a literature survey on mosquito larvae. As a result of analysis on habitat type of habitat characteristics 6 wetland types and total of 93 wetlands were identified. The average number of mosquito larvae by wetland type was 39.57(±95.58) in artificial lake wetland, and the lowest at an average of 9.34(±47.47) in river wetland. Regression analysis of mosquito larvae and OHC-group by wetland types showed a positive trend of artificial wetland and negative tendency of natural wetland. In the SOM (Self organizing map) analysis, the trends of mosquito larvae and OHC-group were found to be contrary, and mosquito larvae were analyzed to be higher in Group-Ⅰ and OHC-group in Group-Ⅴ. As a result of regression analysis of dominance index and diversity index of mosquito larvae and community index, dominance index showed a positive tendency and diversity index showed negative tendency by wetland type. In the SOM analysis, the dominance index was high in Group-Ⅰ with high mosquito larvae, and diversity index was high in Group-Ⅳ with appearance of OHC-group. Regression analysis of the ratio of mosquito larvae to aquatic plants revealed that the free-floating plants and in floating-leaved plants showed positive trends and negative trends with submerged plants and emergent plants. As a result of SOM analysis, the appearance of mosquito larvae was high in Group-Ⅰ and Group-Ⅱ, and the tendency was high with free-floating plants and floating-leaved plants. Overall, mosquito larvae prefer habitat features with a low ratio of predators such as OHC-group, unstable community, and having high percentage of free-floating plants and floating-leaved plants. A study on the biological mosquito larvae control technique was conducted 4 times at the interval of one week from July, 2018 at the auto camping site of Hwarang Amusement Park in Danwon-gu, Ansan city. The biological mosquito larvae control technique was applied to the natural enemy using the Hydrochara affinis and BTI method using Bacillus thuringiensis israelensis. Result of field investigation, a total of 8,268 individuals, 39 species, 22 families, 11 orders of benthic macroinvertebrates appeared during this study time. The total number of benthic macroinvertebrate species was the highest with 12 species (30.77%) of non-insects, and the overall average individuals appearance rate was of highest 3,061.2 (58.64%)non-insect. As a result of analysis of species and number of varieties according to the time of survey, the variation of species and individuals was the largest at the second survey time affected by BTI. As a result of analysis of average mosquito larvae and OHC-group individuals by technique, appearance of mosquito larvae and OHC-group was lowest at BTI site, and OHC-group appeared highest at natural enemy sites. As a result of functional group analysis, Gathering-collectors showed the highest rate of 50.53% in total feeding functional groups and Swimmers showed the highest rate of 75.56% in total habitat oriented groups. For the water quality analysis, there was no significant difference between the site of water quality according to the study time(p>0.05). The dominant species and subdominant species were Austropeplea ollula, Physa acuta and Cloeon dipterum in most of the sites. As a result of analyzing the community index by technique according to the study time, it were analyzed that it appearance most unstable community in secondary time, and in fourth time, similar patterns were observed each sites. As a result of the som analysis using of community index and individuals of the appeared benthic macroinvertebrates, it analyzed total 3 group. In the Group-Ⅰ, the period affected by BTI, the number of species and individuals were the lowest, indicating that the community was unstable and the natural enemy site was similar to the control site. Therefore, BTI is considered to be a suitable technique for urban areas with low biodiversity, and it considered the natural enemy is a technique that can be applied to relatively stable community environment. Overall, mosquito larvae have shown a high density of individuals in wetlands with low ratio of predators such as OHC-group and unstable community structural. It is estimated that the habitat density of mosquito larvae will increase in artificial wetland environment in urban areas. So, BTI and natural enemy techniques were applied to the study of individuals control of mosquito larvae. The BTI technique has been analyzed to very effective in control the individuals of mosquito larvae in short period of time. The natural enemy technique using Hydrochara affinis does not have a numerical efficiency, but it is consider to potential for mosquito larvae control. However, it has been analyzed that differences in the effects of biological mosquito larvae control methods on the species composition and community structural, so it is necessary to consider when applying to wetlands. It is thought that further research will be needed on the differences in habitat characteristics due to external environmental factors, and the recovery patterns for community structural in the application of biological control. 본 연구는 국내 습지에 분포하는 모기유충의 서식처 특성과 생물학적 모기유충 방제기법에 대한 연구를 수행하였다. 모기유충의 서식처 특성 연구에 대한 현지조사는 2016년 12월부터 2017년 10월 까지 습지별로 총 1~3회 조사를 실시하였고 국립습지센터의 전국내륙습지 모니터링의 자료를 이용하여 모기유충이 서식하는 습지에 대한 문헌조사를 실시하였다. 서식처 특성 연구의 습지유형 분석결과, 총 6개의 습지유형으로 분석되어 총 93개의 습지가 확인되었다. 습지유형별 평균 모기유충 개체수는 인공호습지에서 평균 39.57(±95.58)로 가장 높은 것으로 분석되었으며 하도습지에서 평균 9.34(±47.47)로 가장 낮은 것으로 나타났다. 습지유형에 따른 모기유충과 OHC-group을 대상으로 회귀분석을 실시한 결과, 인공형 습지는 양의 경향성, 자연형 습지는 음의 경향성을 나타내는 것으로 분석되었다. SOM (Self organizing map) 분석 결과에서 모기유충과 OHC-group의 경향성은 상반되는 것으로 분석되었으며, 모기유충은 Group-Ⅰ, OHC-group은 Group-Ⅴ에서 높은 것으로 분석되었다. 모기유충과 군집지수의 우점도지수, 다양도지수를 대상으로 회귀분석을 실시한 결과, 습지유형별로 우점도지수는 양의 경향성, 다양도지수는 음의 경향성을 나타내는 것으로 분석되었다. SOM 분석 결과, 모기유충의 출현이 높은 Group-Ⅰ에서 우점도지수가 높게 나타났으며, OHC-group의 출현이 높은 Group-Ⅳ에서 다양도지수가 높게 나타난 것으로 분석되었다. 모기유충과 수생식물의 비율을 대상으로 회귀분석을 실시한 결과, 부유성 식물과 부엽성 식물은 양의 경향성을 나타내었으며 정수성 식물, 침수성 식물과는 음의 경향성을 나타내는 것으로 분석되었다. SOM 분석 결과, Group-Ⅰ과 Group-Ⅱ에서 모기유충의 출현이 높았으며, 부유성 식물, 부엽성 식물과 경향성이 높은 것으로 분석되었다. 따라서 모기유충이 선호하는 서식처 특성은 OHC-group과 같은 포식자의 비율이 적으며, 군집이 불안정한 습지를 선호하는 것으로 판단되며 부유성, 부엽성 식물의 비율이 높은 서식처에서 높은 출현을 나타내는 것으로 분석되었다. 생물학적 모기유충 방제기법에 대한 연구는 안산시 단원구 화랑유원지 오토캠핑장의 집수정에서 2018년 7월부터 1주일 간격으로 총 4회 조사를 실시하였다. 생물학적 모기유충 방제기법은 잔물땡땡이 (Hydrochara affinis) 를 이용한 천적기법과 BTI (Bacillus thuringiensis israelensis) 를 이용한 BTI 기법을 적용하였다. 본 연구기간 동안 출현한 저서성 대형무척추동물은 총 11목 22과 39종 8,268개체가 출현하였다. 저서성 대형무척추동물의 전체 출현종은 비곤충류가 12종(30.77%)로 가장 다양하였고 전체 평균 개체수 출현비율은 비곤충류가 3,061.2개체(58.64%)로 가장 높은 출현비율을 나타내었다. 조사시기에 따른 기법별 종수 및 개체수 변동 분석 결과, BTI의 1차 투여시기인 2차 조사시기에 종수 및 개체수 변동이 가장 큰 것으로 분석되었다. 기법별 평균 모기유충 및 OHC-group의 개체수를 분석한 결과, BTI 지점에서 모기유충 및 OHC-group의 출현이 가장 낮은 것으로 나타났으며, 천적지점에서 OHC-group의 출현이 가장 높게 나타났다. 기능군 분석 결과, 전체 섭식기능군은 Gathering-collectors가 50.53%로 가장 높은 비율을 나타내었으며, 전체 서식기능군은 Swimmers가 75.56%로 가장 높은 것으로 분석되었다. 수질분석 결과, 조사시기에 따른 수질항목에 변동은 있었으나 지점간 유의한 차이는 없는 것으로 분석되었다(p>0.05). 조사기간 동안 출현한 저서성 대형무척추동물을 대상으로 우점종 및 아우점종을 분석한 결과, 대부분의 지점에서 애기물달팽이(Austropeplea ollula), 왼돌이물달팽이(Physa acuta), 연못하루살이가(Cloeon dipterum) 우점종 및 아우점종으로 나타났다. 조사시기에 따른 기법별 군집지수의 변동을 분석한 결과, BTI 1차 투여시기인 2차 조사기에 가장 불안정한 군집을 나타내는 것으로 분석되었으며, 4차 시기에는 다른 기법과 유사한 양상을 나타내었다. 조사기간 동안 출현한 저서성 대형무척추동물의 분류군별 개체수와 군집지수를 대상으로 SOM 분석을 실시한 결과, 총 3개의 Group으로 분석되었다. BTI의 영향을 받은 시기인 Group-Ⅰ에서 종수 및 개체수가 가장 낮은 것으로 분석되었으며, 군집은 가장 불안정한 것으로 분석되었다. 반면 천적지점은 대조지점과 조사시기별 비교적 유사한 양상을 나타내는 것으로 분석되어 비교적 안정적인 군집을 나타내는 것으로 분석되었다. 종합적으로 모기유충은 OHC-group과 같은 포식자의 비율이 낮고, 비교적 군집이 불안정한 습지에서 높은 출현을 나타내는 것으로 분석되어 도심지의 인공적인 습지 환경에서 모기유충의 서식밀도가 증가할 것으로 판단된다. 이러한 모기유충의 개체수 조절에 대한 연구로 BTI 기법과 천적기법을 적용하였다. BTI 기법은 단기간에 모기유충의 개체수 조절에 매우 효과적인 것으로 분석되었으며, 잔물땡땡이를 이용한 천적기법은 수치적인 효율성은 파악하지 못하였으나 모기유충 방제에 있어 가능성을 나타내는 것으로 판단된다. 하지만 생물학적 방제기법에 따른 종조성 및 군집에 미치는 영향에 대한 차이가 있는 것으로 나타나 습지에 적용하는 경우 고려해야할 필요가 있는 것으로 판단되며, 장기적인 연구를 통해 서식처 특성에 대한 차이 및 군집의 회복양상에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.

오이 형질전환체 제작 및 생물/비생물학적 조건에서 CsLOX 유전자 발현 분석

장현아 忠南大學校 大學院 2014 국내석사

국내 임상 환자로부터 분리한 Chlamydia pneumoniae의 분자생물학적 특성

권수진 가톨릭대학교 대학원 2004 국내석사

Chlamydia pneumoniae는 1986년 처음 동정된 균종으로 절대 세포내 기생성세균으로 사람에게 폐렴, 기관지염, 인후염, 부비동염 등을 흔히 일으키는 호흡기계질환 병원체이다. 특히 지역사회획득 폐렴(community acquired pneumoniae)의 주요한 원인균 중 약 6~25% 정도를 차지하고 있다. C. pneumoniae에 대한 혈청학적 조사결과 성인집단에서 높은 항체가 보유가 확인되어 일생동안 재감염이 흔하게 발생하는 것으로 추정하였다. 한편, 1990년 초반부터 C. pneumoniae 감염과 동맥경화증과의 관련성에 관한 논란이 끊임없이 이어지고 있으며 관련 연구가 활발하게 진행되고 있다. C. pneumoniae의 감염 진단에 있어 일반적으로 수행되고 있는 혈청학적 방법은 결과판독이 주관적이고 감염 후 항체가 형성되기까지 몇 주가 소요된다는 점과 항체가 만으로는 현증과 과거력을 구별하기가 어렵다. 환자 가검물로부터 세포배양을 통한 C. pneumoniae 분리 및 증식은 많은 노력과 장시간이 요구될 뿐 아니라 민감도가 낮다는 단점이 있다. 이런 이유로 오늘날까지도 C. pneumoniae의 분리는 외국에서도 소수의 센터에서만 성공하였으며 국내에서는 환자로부터 순수 분리 배양된 보고가 없다. 따라서 본 연구에서는 국내 환자 검체로부터 C. pneumoniae를 순수분리하고 외국 분리균주와의 비교를 통하여 국내 임상 분리균주의 특징을 밝히고자 하였다. 먼저, 외국 분리균주인 C. pneumoniae TW-183과 C. pneumoniae KKpn-1을 표준균주로 사용하여 C. pneumoniae의 확인 동정법 및 배양법을 표준화하였다. 한편, C. pneumoniae 검출 및 확인동정에는 미세면역형광법(micro-IF)과 PCR법을 사용하였다. 실험실 조건에 맞춰 확립한 진단법에 따라 직접 임상검체로부터 C. pneumoniae 분리를 시도하여 급성 인두염을 앓고 있는 22세 여자 환자의 비인두 도찰물로부터 micro-IF 결과 양성, PCR 결과 양성을 확인하였고, 배양을 통해 C. pneumoniae를 최종적으로 분리하였다. 분리한 C. pneumoniae 균주를 전자현미경으로 관찰한 결과 elementary bodies(EBs)가 좁은 세포질 공간을 가지는 원형을 띠며 KKpn-1 균주와는 같지만 배 모양(pear-shape)을 띠고 있는 TW-183 균주와는 형태적인 차이가 있음이 확인되었다. 이상의 결과로부터 국내 최초로 C. pneumoniae 분리에 성공하였음을 최종 확인하여 이를 C. pneumoniae LKK-1으로 명명하였다. C. pneumoniae LKK-1의 생물학적, 유전학적 특성을 분석하고 TW-183 및 KKpn-1 균주와의 차이점을 확인하였다. 증식양상은 세 균주가 거의 같은 양상을 보여서 36시간부터 감염율이 증가하기 시작하여 대략 60시간에 정점에 이르렀다. EBs의 총 단백질 양상을 SDS-PAGE를 수행하여 확인한 결과 양의 차이는 있었지만 거의 비슷하였다. 주 단백은 98, 60 39.5 kDa이었고 39.5 kDa의 위치에서 C. pneumoniae major outer membrane protein(MOMP)으로 확인되었고 몇몇 부분에서 KKpn-1과는 거의 유사하였지만 TW-183과는 차이를 나타내는 부분이 있었다. 한편, pmp2 와 pmp6 유전자에 대한 PCR-RFLP를 수행하여 균주 간 유전자상의 차이를 확인하였다. 또한, 16s rRNA와 ompA, omcB, ompB, G1 유전자의 DNA 염기서열 분석을 실시한 결과 LKK-1 균주는 16s rRNA와 ompA, omcB, groESL 유전자에 있어서 다른 두 균주와 상동성이 100% 였지만 ompB 유전자 염기서열 분석에서는 다른 두 균주와 상동성이 77.5%로 확인되었다. 앞으로 C. pneumoniae의 병원성과 관련된 유전자들의 분자생물학적 특성을 좀더 파악하여 국내 분리 균주의 특성 및 병원성과의 연관성 그리고 새로운 분자생물학적 진단법 개발 연구가 진행되어야 할 것이다. Chlamydia pneumoniae, firstly discovered in 1986, is an obligate intracellular pathogen that causes respiratory tract infection such as pneumonia, bronchitis, pharyngitis and sinusitis in human. It has been reported to be responsible for 6~25% of case of Community-acquired pneumonia. Serological studies have reported the prevalence of C. pneumoniae specific antibodies is high in the adult population and have suggested the reinfection of C. pneumoniae is common event. Since early 1990's, the possible involvement of C. pneumoniae in the pathogenesis of atherosclerosis has been intensely continued to debate and serologic analysis, at present the test most often used for routine diagnosis, is often subjective, because it take perhaps weeks to detect a significant increase in antibody titers and it is impossible to determine if a patient's antibody titer is due to acute, previous or chronic C. pneumoniae infection. The isolation and propagation of C. pneumoniae from clinical specimens by using cell cultures is relatively labor-intensive and insensitive. Till now isolation of C. pneumoniae from specimens has been successful at few laboratories, but there is no report of isolation of C. pneumoniae from the patient in Korea. Therefore, in this study, C. pneumoniae was isolated from the patient in Korea and characterized through comparing with other countries' strains. In an attempt to standardize the identification and culture method of C. pneumoniae, C. pneumoniae TW-183 and KKpn-1, reported in other countries, were used as the control strain. In addition, microimmunofluorescence(micro-IF) assay and PCR method were used for the detection of C. pneumoniae. The isolation of C. pneumoniae was attempted directly from clinical specimens by using the standard diagnostic methods, and finally, C. pneumoniae was isolated from throat swab specimen of the 22-year female with pharyngitidis under standardized culture conditions and confirmed the positive result by micro-IF assay and PCR method, respectively. Observation with electron microscope demonstrated that C. pneumoniae in this study is a round-shape with cytoplasmic space and its shape was morphologically similar with C. pneumoniae KKpn-1 strain, but was different to pear-shape of C. pneumoniae TW-183. Finally, it was confirmed that the isolation of C. pneumoniae from clinical specimen was successful based on these result and C. pneumoniae in this study was named as LKK-1. To identify the biological and genetic characteristic of C. pneumoniae LKK-1 and compare it with other strain, TW-183 and KKpn-1, the protein profiles of EBs of C. pneumoniae LKK-1 was analyzed using Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE). In addition, pmp6-based PCR-RFLP produced the different DNA restriction fragment patterns among three strains(LKK-1, TW-183 and KKpn-1). Compared to the degrees of conservation of the 16s rRNA and several MOMp gene, there was a few differences of ompB gene sequence within the three strains. In future study, further extensive investigation of molecular genetic analysis of the virulent genes in C. pneumoniae are required in order to characterize the C. pneumoniae clinical isolate in Korea and identify the association with pathogenesis of C. pneumoniae infection.

대장암 세포주에서 UCP 유전자 발현과 종양표지 인자로서의 기능 연구

최도숙 건국대학교 대학원 2008 국내박사

Transcriptome and functional analyses of phenotypic plasticity in sea grape Caulerpa okamurae

강지원 중앙대학교 대학원 2024 국내석사

녹색 해조류 중 하나인 옥덩굴속은 동종 내에서도 현저한 형태 변이를 보이며, 이로써 다양한 환경 조건에 적응할 수 있는 능력을 가진다. 그러나 이러한 표현형 가소성과 관련된 분자 생물학적 기전은 아직까지 불분명하다. 본 연구에서는 Caulerpa okamurae Weber Bosse, 1897의 자연 환경에서의 표현형과 배양 환경에서 변화된 표현형을 비교하여, 유전자 발현의 차이를 조사하고 그들의 생물학적 기능을 파악했다. 변형된 표현형에서는 자연 표현형과 비교했을 때 광 수집 복합체의 발현이 증가하고 세포 구조 안정성은 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 microRNAs와 transposable elements를 식별하였다. 특히, 일부 microRNAs는 세포골격 및 세포질 유동과 관련된 유전자를 억제하는 역할을 할 것으로 예측되었다. 추가적으로 우리는 C. okamurae의 계통학적 위치를 설명하였다. 조간대 해조류들은 광손상을 피하기 위해 빛 흡수를 줄이고, 파도로 인한 물리적 압력에 적응한 형태 구조를 취한다. 반면, 배양 환경에서는 낮은 빛 조건에서 효율적으로 많은 빛을 흡수하기 위한 표현형으로 발현한 것으로 추측되었다. 최종적으로, 인공 수류를 처리한 배양실험을 통해서 C. okamurae가 원래의 자연 표현형을 나타낸 것을 확인했다. 우리 연구는 환경조건에 따른 옥덩굴속의 표현형 가소성과 관련된 분자 생물학적 기전을 최초로 생물정보학적 기법을 통해 보고한다. Caulerpa, a coenocytic green macroalga, can adapt to a wide range of environmental types due to its remarkable morphological intraspecies variations. However, the molecular mechanisms underlying this phenotypic plasticity remain poorly understood. The transcriptomes of Caulerpa okamurae Weber Bosse, 1897 displaying altered phenotypes of cultivation and natural phenotypes were compared and significantly regulated genes and their biological functions were investigated using differential expression analyses. We observed light-harvesting complex upregulation and cellular framework stability downregulation in altered phenotypes compared to the natural phenotypes. Additionally, we identified microRNAs and transposable elements that can regulate gene expression. Notably, certain putative miRNAs were predicted to suppress genes related to cytoskeletal organization and cytoplasmic streaming. Furthermore, we provided insights into C. okamurae’s phylogenetic position. Intertidal macrophytes reduce light capture to avoid photodamage and regulate their morphology to protect against wave damage. In contrast, the lower light conditions and the cultivation environment augmented light capture and increased a morphology prioritizing light trapping. Moreover, the addition of simulated wave-sweeping pressure induced a return to the natural morphology under high-light conditions, showing how mechanical stress affects morphological organization in C. okamurae.

유아 분변에서 분리한 Lactobacillus acidophilus의 특성 및 표면 단백질 유전자 slp 크로닝과 대장균내에서의 발현

김진형 建國大學校 2003 국내석사

본 연구는 Lactobacillus acidophilus를 유아의 분변에서 동정하고, L. acidophilus의 SLP-A을 이용한 표면발현시스템의 개발을 위해, E. coli 내에서 slpA 유전자(surface-layer protein A gene)를 클로닝하여 발현시키고 slpA 유전자 염기서열 조사 및 발현 단백질 SLP-A를 분석하였다. 1. 유아의 분변에서 L. acidophilus로 분리하고, 분리된 균주를 L. acidophilus KLA 1012로 명명하였다. 2. slpA 유전자를 포함한 pTSLP-A와 slpA 유전자의 일부를 포함한 pTSLP-AI, pTSLP-AII, pTSLP-AIII를 얻고, 확인하기 위해 slpA 유전자의 1.4 kb PCR 산물을 probe로 사용하여 Southern blotting을 시행하여 확인하였다. 3. L. acidophilus KLA 1012의 slpA 유전자 1,338 bp를 염기서열 분석 결과 L. acidophilus ATCC 4356의 slpA 유전자와 일치하는 것으로 확인되었다. 4. L. acidophilus KLA 1012의 SLP-A를 이용한 Western blotting 결과 pQESLP-A를 포함하는 E. coli M15 내에서 45.2 kDa SLP-A가 발현되었다. 5. SLP-A의 아미노산 서열은 N-말단 부분에 signal sequence가 확인되었고, 대분분 소수성 아미노산과 양전하 아미노산으로 구성되는 양전하 단백질로 확인되었다. L. acidophilus KLA 1012 was isolated from infant's feces. For the construction of surface expression host-vector system, cloning of slpA gene of SLP-A(Surface-layer protein A) was performed and the nucleotide sequences were analyzed . The 1.4 kb PCR product of slpA gene was cloned and confirmed in pTSLP-A by Southern blotting. The nucleotide sequence of slpA gene DNA were identical with those of L. acidophilus ATCC 4356. The 45.2 kDa surface-layer protein band were examined by SDS-PAGE using E. coli M15 transformant containing recombinant plasmid pQESLP-A. Western blotting was performed by using multiclonal antibody produced by L. acidophilus KLA 1012 SLP-A protein. And subclones of slpA gene, which were deleted in part, were constructed. Amino acid sequences of SLP-A converted from nucleotide sequences information had signal sequence at N-terminal portion, and it was consisted of positive charged amino acid mainly of Lysine. To construct Lactobacillus delivery system to suface display of heterologous protein by using SLP-A on the Lactobacillus cell surface, more studies on the detailed structure of surface-layer protein is needed.

재조합 소 성장 호르몬의 생화학적 특성 연구

이홍균 서강대학교 대학원 2001 국내박사

재 조합 소 성장 호르몬을 대장균에서 발현시키기 위하여 합성 유전자를 제조하여 대장균 발현 벡터 ptrp3H에 클로닝 하였다. 소 성장 호르몬 말단 부위의 2차 구조 형성을 막고, 발현률을 향상 시키기 위하여 연어 성장 호르몬의 일부서열을 소 성장 호르몬 유전자의 5’-말단에 접합시킨 2개의 cistron을 이용하는 시스템으로 완성하였다. 숙주로 가장 높은 발현률은 나타낸 것은 w3110이었다. 제조된 균체는 유가식 발효법을 이용하여 발현시켰다. 회수된 재조합 소 성장 호르몬 단백질 봉입체를 고 수률로 원상화 시키기 위하여 이소 프로필 알코올을 이용한 원상화 방법을 고안하였다. 소 성장 호르몬의 원상화를 위한 과정이 세단계로 나누어 연구되었다. 가용화 단계에서의 최적 조건은 이소 프로필 알코올 농도 35%, 온도 37℃, pH 12.4였다. 산화 단계의 최적 조건은 15% 이소 프로필 알코올, 2-머캅토 에탄올 0.01%, pH 11.7, 단백질 농도 2.5g/L, 온도 16℃였다. 이러한 조건에서 산화는 4시간이내에 완성되었다. 본 연구에서 산화제는 용존 산소였으며, 원상화 과정에서 수율에 영향을 미치는 가장 중요한 요소는 단백질 농도였다. 중첩은 이소 프로필 알코올이 투석이나 한외여과를 이용한 diafiltration 시 서서히 일어났다. 이소 프로필 알코올의 극성이 단백질 중첩의 속도에 영향을 미치는 것으로 보여지며 최적의 조건은 2~4%의 이소 프로필 알코올 농도였다. 중첩 시 고농도의 이소 프로필 알코올은 소수성 아미노산의 행동에 영향을 주어 2차 구조와 3차 구조 형성을 억제시켰다. 중첩의 전이 상태는 이소 프로필 알코올의 농도와 pH에 의하여 유도되었다. pH가 낮을수록 중첩의 속도가 증가하는 반면 이중체의 형성이 증가되었으며, 이소 프로필 알코올의 농도가 낮을수록 중첩의 속도가 증가하였다. 본 연구에서 확립된 이소 프로필 알코올 사용 방법을 사용하는 경우 소 성장 호르몬 봉입체의 원상화 수율은 거의 100%에 이르렇다. Synthetic bovine growth hormone (bGH) gene was cloned into E. coli expression vector system (ptrp3H). Bi-cistron system was introduced to the 5’-terminal region of the bGH gene to alter the secondary structure and to improve expression of the gene. Truncated salmon growth hormone gene was attached to 5’-terminal region of bGH gene. E. coli w3110 was selected as an efficient host strain. Transformed E. coli was cultured to produce r-bGH by fed-batch fermentation. Renaturation method of r-bGH inclusion body with iso-propyl alcohol was studied to set up the high yield generation method. Study of r-bGH renaturation method was performed as 3 steps. Optimal condition for inclusion body solubilization was obtained in 35 % iso-propyl alcohol, 37℃, and pH 12.4. Optimal condition of oxidation step was 15 % iso-propyl alcohol, 0.01 % 2-mercaptoethanol, 2.5 g/L of protein concentration, 16℃, and pH 11.7. Oxidation was completed within 4 hours in this condition. In this method, oxidizing agent was dissolved oxygen and most important factor, have an influence on yield, was protein concentration. Folding was slowly proceeded during dialysis or diafiltration by ultrafiltration. Speed of protein folding was affected by polarity of iso-propyl alcohol, and optimal concentration of iso-propyl alcohol was 2~4 %. It appeared that formation of secondary and tertiary structure was inhibited by high concentration of iso-propyl alcohol by the way of disturbing the behavior of hydrophobic amino acids. Transition state of folding intermediates was induced by concentration of iso-propyl alcohol and pH. Folding speed and dimer formation were increased by low pH. Folding speed was also increased by low concentration of iso-propyl alcohol concentration. It was confirmed that the renaturation yield could be reached to nearly 100% by this method.

김치에서 분리한 Lactobacillus curvatus KLC140 분리균주의 특성 및 플라스미드 pKLCA와 pKLCB의 클로닝과 유전적 분석

김성훈 建國大學校 2003 국내석사

숙성된 김치로부터 Lactobacillus curvatus KLC140균주를 분리하고, Plasmid DNA 두 종류를 분리하고 이들의 염기서열 분석하였다. 이를 바탕으로 shuttle 벡터를 개발하고, 유용 유전자의 발현과 식품 수준의 클로닝 벡터의 개발을 목적으로 실험을 수행하였다. 1. 분리된 균주는 Lactobacillus curvatus KLC140로 명명 하였고, 3종류의 plasmid DNA를 확인하였다. 이 중에서 1.490bp pKLCA와 3.353bp pKLCB를 클로닝 했다. 2. Plasmid DNA pKLCA와 pKLCB를 제한효소를 처리를 통하여 E. coli 벡터 pUC19과 pGEM-T-easy 벡터에 ligation하여 재조합 plasmid DNA를 구성하였다. 재조합 plasmid는 E. coli 안에서 안정성을 유지했고, Southern blotting에 의하여 확인 하였다. 3. Nucleotide sequence를 결정하고 NCBI를 통해 분석한 결과 pKLCA와 일치하는 염기서열이 없었고, pKLCB의 경우 일부분이 일치하는 염기서열이 있었다. 염기서열을 분석한 결과 pKLCA는 하나의 ORF(774bp, 257aa)를 가지고 있으며, pKLCB는 두개의 ORF(ORF1 : 618bp, 205aa; ORF2 : 458bp, 152aa)와 ori gene이라 생각되는 부위를 가지고 있었다. In order to develop a food-grade cloning vector system which can be used in Lactobacillus sp., Lactobacillus strains were isolated from the Kimchi of Korea. Among 200 isolated Lactobacillus strains, Lactobacillus curvatus KLC140 which contained three kinds of plasmid DNA were identified through biochemical, morphological, cultural and carbohydrate fermantation test. The size of plasmid DNA were 1.49kb, 3.35kb and 10kb, and were designated as pKLCA, pKLCB and pKLCC respectively. The plasmid pKLCA was cloned in to the BamH I site of pUC19 and was cloned again to the pGEM-T-easy vector by PCR. The pKLCA had two EcoR I recognition sites and designated as pTKLCA. The plasmid pKLCB had single Xba I and two Sph I recognition sites. It was cloned into the Xba I site of pUC19 and was designated as pUKLCB. The plasmid pKLCA and pKLCB was successfully transformed and stably replicated in E. coli DH5α. The pKLCA had one potential ORF(open reading frame) and it's nucleotide size was 774bp(258 amino acids). The pKLCB had two ORFs. The size of ORF1 was 618bp(205 amino acids). And the size of ORF2 was 458bp(205 amino acids). Potential origin of replication of pKLCB had a stem-loof structure. For the construction of host-vector system, it will be needed to use food-grade selection marker such as genes that are related to carbohydrate metabolism and/or bacteriocin resistance.

大腸菌에서 Propioante 代謝의 遺傳學的 및 分子生物學的 特性硏究

김보민 成均館大學校 大學院 2002 국내석사

[ABSTRACT] Genetic and Molecular Characterization of Propionate Metabolism in Escherichia coli Bo Min Kim Department of biology Graduate School of Sung Kuyn Kwan University Polyhydroxyalkanoates (PHAs) is a class of biopolymers naturally produced by microbes as storage materials for carbon and reducing equivalents. These natural polyesters have received a considerable interest because of its potential to be developed as biodegradable plastics substituting petrochemical-based plastics. Biopol [poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV)] is a biodegradable PHA plastics of promising physical properties for general usage. For the production of PHBV, glucose and propionate are supplied to fermentation of a Ralstonia eutropha or other metabolically engineered microorganisms. Therefore, understanding catabolism of propionate in the cell is important for its application to the PHBV production using microbial fermentation. Understanding of propionate catabolism has only emerged in the recent past and is still under active investigation. As an effort to understand propionate catabolism of Escherichia coli, in this study, we have performed experiments basically three different directions: 1) Isolation and characterization of mutants defective propionate catablism, 2) Isolation and characterization of mutants resistant to high concentration of propionate in the medium, and 3) Regulation of propionate catabolism. 1) Isolation of characterization of mutants defective propionate catabolism Wild type E. coli strain MG1655 was mutagenized by Tn10 and total of 3 independent mutants defective in propionate utilization (Prp- ) as a sole carbon source. The Prp- phenotype was 100% linked with the Tcr phenotype in the mutants. Physical mapping of the Tn10s using inverse PCR technique positively identified two loci out of the threes: rpoS (encoding stationary phase sigma factor, RpoS) and accA (encoding acetyl-CoA carboxylase). These results suggest that both rpoS and accA are required for utilization of propionate as a sole carbon source in E. coli. 2) Isolation and characterization of mutants resistant to high concentration of propionate Among the transposone Tn10 mutants of MG1655 were screened and total of 15 independent mutants (propionate-resistant, Prpr) able to grow high concentration (80mM) of propionate in the minimal medium were isolated. Five different alleles were positively identified by inverse PCR technique. These include yedJ of unknown function, gatA encoding galatitol-specific enzyme IIA of phosphoenolpyruavte trasnferase system (gatA), cspD encoding an DNA replication inhibitor, nad encoding a protein involved in biosynthesis of nicotineamide dinucleotide (NAD), and b2380 of unknow function. Though further detailed studies needs to be conducted, but these results suggest that multiple factors in various cellular physiology are involved in the resistance to the high concentration of propionate in the medium. 3) Regulation of propionate catabolism Genetic factors influencing propionate catabolism in E. coli were identified by both lacZ operon fusion and mobility shift assay. A lacZ fusion was constructed in the putative E. coli prpBCDE operon homologous to prpBCDE previously identified to encode enzymes involved in propionate catabolism in Salmonella typhimurium. Mobility shift assay was conducted using a probe containing a putative promoter region of the E. coli prpBCDE. From these experiments, multiple transcriptional factors were found to alter the expression of the E. coli prpBCDE operon. These includes crp encoding catabolite repressor protein, arcA encoding the regulator of aerobic respiratory control (Arc) two component system, ompR encoding the regulator of the two component system of osmoregulation. These results suggest catabolism of propionate in E. coli is regulated by multiple global regulators.

알레르기 질환을 유발하는 주요 원인 알레르겐의 유전자 클로닝, 발현 및 면역학적 특성 연구

이수연 建國大學校 2003 국내석사

알레르기 질환을 유발시키는 가장 중요한 실내 항원으로 집먼지 진드기를, 그리고 중요 실외 항원으로 점박이 응애를 선택하여 그들의 주요 알레르겐의 유전자를 클로닝하고 그들을 대량 발현시켜 순수 분리하여 얻고자 하였다. 먼저 실내 주요 알레르겐인 집먼지 진드기로부터 총 RNA를 분리하여 RT-PCR로 Der-f-2 유전자에 대한 cDNA를 만들었고, pET-15b 벡터에 클로닝 한 후 대장균에서 발현을 시켜 Der-f-2 단백을 순수하게 분리 정제하였다. 그리고 실외 주요 알레르겐인 점박이 응애로부터 mRNA를 분리하여 expression cDNA Library를 만들고 점박이 응애에 강한 양성 반응을 보이는 환자의 혈청을 이용하여 면역학적 탐색을 수행, 양성 반응을 보이는 클론을 찾아내었다. 이 클론을 TSM-nc2라 명하여 염기 서열을 분석하고 아미노산을 지정하는 부분만 PCR 방법을 통해 증폭한 다음, 발현벡터에 클로닝하여 대장균에서 TSM-nc2 유전자 재조합 단백질을 생산하였다. 이렇게 발현된 집먼지 진드기의 Der-f-2와 점박이 응애의 TSM-nc2 유전자 재조합 단백질을 가지고 면역학적 특성을 확인한 결과, 각각의 항원에 감작된 환자의 혈청에 강한 양성 반응을 보이는 항원 단백질임을 확인하였다. 본 연구를 통하여 순수 정제한 집먼지 진드기의 Der-f-2 유전자 재조합 단백질과 최초로 클로닝한 점박이 응애 TSM-nc2 알레르겐의 서열 및 특성에 대한 정보는 다른 알레르겐을 클로닝하고 발현, 정제하는 연구에 큰 도움이 될 수 있으며, 나아가 알레르기 질환의 진단과 백신 및 면역 치료 방법 개발에도 도움을 줄 것으로 생각된다. The purpose of this study is to clone and express genes of Dermatophagoids farinae in indoor allergen and Tetranychus urticae in outdoor allergen causing allergic disease. For D. farinae in indoor, the total RNA was isolated from D. farinae and converted to cDNA for Der-f-2 gene by RT-PCR, and then pET-15b vector had been constructed and transformed into E. coli for the expression of recombinant Der-f-2 protein. Fusion protein was purified by Ni colume. For T. urticae in outdoor allergen, mRNA was isolated from T. urticae, expression cDNA library was constructed. Immunoscreening was performed for finding positive clone against T. urticae, using the patients' serum who were strongly positive against T. urticae allergen. The clone found by immunoscreening was called TSM-nc2. TSM-nc2 was amplified by PCR, cloned into expression vector and transformed in E. coli for the expression of recombinant TSM-nc2 protein. It was convinced that these recombinant proteins of Der-f-2 and TSM-nc2 were positive antigen protein against the patients' serum which was sensitized with each antigen. Based on the results, the information of sequence and characteristics about purified Der-f-2 recombinant protein of the D. farinae and the first cloned recombinant TSM-nc2 allergen of T. urticae can be useful to be cloning, expressing and purifying the other allergens. Further more, it would be helpful to diagnosis of allergic disease, vaccine development and methode development for immunotheraphy.