Molecular function of LAMMER kinase in Aspergillus nidulans development

강은혜 忠南大學校 大學院 2013 국내박사

진핵 세포 생물의 LAMMER kinase는 다양한 세포 생리적 과정에서 중요한 역할을 한다. 하지만, 사상성 진균에서 그 기능이 아직 밝혀지지 않았기 때문에, 대표적인 사상성 진균인 Aspergillus nidulans를 이용하여 LAMMER kinase의 역할을 규명하고자 하였다. A. nidulans LAMMER kinase를 암호화한 유전자인 lkhA ORF는 2,253bp로, 6개의 exon과 5개의 intron으로 구성되어 있었다. LkhA은 667개의 아미노산으로 이루어진 분자량이 약 74.8 kDa 의 단백질이다. 아미노산 서열 분석과 계통분석을 통하여 LkhA가 LAMMER kinase 그룹에 속함을 확인하였다. lkhA 전사체 분석 결과A. nidulans의 생활사 동안 지속적으로 발현되었는데, 특히 무성 및 유성분화 시기의 특정 시간에서 발현이 증가하였다. 또한, 적어도 2개 이상의 isoform이 영양생장 시기에 발현되었다. lkhA 결손 돌연변이는 생존에 필수적이지는 않으나, 생장의 감소, 배지의 색소 침착등의 비정상적인 표현형을 보였디. 이 돌연변이주는 germination동안 bipolar 및 multipolar germling들이 증가하는 것으로 보아 LkhA는 polarity의 유지 및 germ tube emergency의 양상에 영향을 미친다. 고체 배지에서 결손 돌연변이주의 균사체 생장이 감소하는데 반해, 액체 배지에서는 지속적인 배양시 자가분해 현상이 지연되었다. 또한 균사의 분지는 증가하고, 격벽의 간격이 일정치 않거나 짧아지고, 두꺼워졌으며, 핵의 분포와 수가 비정상적이었다. 이러한 결과들은 lkhA가 세포 주기에 따른 핵의 분포와 격벽 형성 및 격벽 간격 조정에 관여하는 조절 기작에 영향을 줌을 나타낸다. 무성분화 동안 형성되는 생식기관인 conidiophore는 lkhA 결손시 primary sterigmata의 수가 감소하고, vesicle로부터 secondary conidiophore의 형성, sterigmata의 길이 변화 및 stalk 내의 septa가 형성되었다. 또한, sterigmata의 대칭성 결손으로 인해 conidia의 생성율도 감소하였다. Northern blotting을 통해 asexual development의 시작에 관여하는 upstream developmental regulator들의 전사체량을 분석한 결과 변화를 보이지는 않았다. 하지만, brlAβ 와 brlAα 및 abaA의 전사체량은 매우 감소하였다. 이러한 결과들은 lkhA가 brlA 의 전사 조절과정을 통해 conidiophore development에 관여함을 시사한다. lkhA 결손 돌연변이주는 nimXcdc2AF돌연변이주와 유사한 conidiophore형태 결함을 보이기 때문에 lkhA 와 nimX 유전자를 이용하여 nimXcdc2AF돌연변이주와 lkhA 결손돌연변이를 대상으로 suppression test를 하였고, NimX의 Northern과 Western 분석을 하였다. 이 결과, lkhA는 세포 주기 조절자인 NimX 조절을 통해 영양생장 및 conidiophore 형태에 영향을 주는 것으로 결론지었다. lkhA결손 돌연변이주의 cleistothecia는 야생형에 비해 크기가 작고, 아주 적은 수의 ascospore를 가지고 있었다. Transmission electron microscopy (TEM) 관찰 결과에 의하면 lkhA 결손돌연변이주의 cleistothecia는 ascogenous cell들로 보이는 비정형화된 세포들과 적은 수의 asci로 채워져 있었다. Electron-dense한 물질인 cleistin은 야생형에서는 가장 바깥 쪽의 peridial-layer들에 축적되어있는 반면, 돌연변이주에는 cleistothecia의 안쪽 부분으로 퍼져있음을 확인하였다. 이 결과는 lkhA는 peridial layer 및 ascogenous cell들의 구성을 포함한 cleistothecia의 성숙과정에 필요함을 나타내었다. Cleistothecia의 성숙에 관여하는csnD의 전사체량은 매우 낮았고, 이 유전자의 과발현은 cleistothecial outer later의 분화 및 성숙은 회복시켰으나, 크기 및 ascospore의 생성에는 영향이 나타나지 않았다. 이 결과는 LkhA가 csnD 전사조절뿐만 아니라 다른 유성분화 관련 유전자들의 조절을 통해 cleistothecia의 성숙과정에 관여함을 시사한다. 또 다른 분화 관련 유전자 중 ppoA의 발현에도 관여함으로써 ascosporogenesis에도 영향을 주는 것으로 확인하였다. lkhA 결손 돌연변이주는 야생형에 비해 H?lle cell이 이른 시기에 나타났다. H?lle cell에 특이적인 α-1,3-glucanase를 암호화한 mutA유전자의 발현을 무성분화 후기 시기에 확인한 결과, lkhA 결손 돌연변이주에서만 발현되었다. 이러한 결과는 LkhA가 A. nidulans에서 분화 관련 유전자 발현의 시간적 조절 기작에 영향을 줌을 확인할 수 있었다. 더욱이 stuA transcript의 profile이 변한 것으로 보아 LkhA는 stuA 발현을 통해 생식기관의 분화 동안 시간 조절 기작을 조정하는 것으로 추정된다. 본 연구를 통해 LkhA가 생존에 필수적이지는 않으나, germ tube 발생, germling의 방향성 축의 형성, 세포 주기와 관련된 격벽 형성 및 생식 기관의 형성에 관여함을 밝혔다. LkhA는 무성 분화 동안의 BrlA, StuA, NimX와 유성분화 동안의 CsnD 및 PpoA의 공조적인 효과를 통해 A. nidulans 분화 과정에 관여하는 것으로 보인다. 이 결과들은 A. nidulans의 분화과정에 대한 분자적 기작에 새로운 시각을 제공할 것이다. LAMMER kinase plays pivotal roles in various physiological processes in eukaryotes; however, its function in filamentous fungi is not known. To understand function of the Aspergillus nidulans LAMMER kinase, LkhA, molecular studies were performed. The ORF of A. nidulans LAMMER kinase gene, lkhA, which was 2,253bp in length, was divided into six exons and 5 introns. The predicted LkhA protein had 667 amino acids and an estimated mass of 74.8 kDa. Amino acid sequence and phylogenetic analysis indicated that LkhA belongs to the family of LAMMER kinases. Northern blot analysis showed continuous lkhA expression throughout the A. nidulans life cycle, but the level of expression was relatively high at certain time points during asexual and sexual development. At least two isoforms of the lkhA transcript were detected during vegetative growth, The lkhAΔ strain was viable, but showed abnormalities in growth such as reduced radial growth and deposition of reddish-yellow pigments in the agar culture medium. The proportion of bipolar or multipolar germlings was increased in the lkhA deletion mutants, suggesting that the pattern of germ tube emergence and the maintenance of polarity axis were affected by LkhA. The lkhAΔ strain showed significant reduction of mycelia production on complete agar medium, but delay of disintegration (autolysis) of the mycelia by the lkhA deletion was suggested in liquid culture. The lkhAΔ strain showed hyper-branching of the hyphae, uneven and shorter septum interval than that in the wild type, and thickening of the hyphae with frequent septation. Most interestingly, the lkhAΔ strain revealed numerical and morphological abnormalities in its nuclei. These results indicate that lkhA affects regulatory mechanisms that are associated with the formation of the septum and its intervals and to the distribution of nuclei in accordance with the cell cycle. The lkhAΔ strain displayed a reduced number of primary sterigmatae, the emergency of secondary conidiophores from its vesicle, irregularity in the length of sterigmata (non-separated), and multiple septa in its stalk. The lkhAΔ strain also showed a lack of symmetry in sterigmata attributable to the absence of or just one phialide budding from a metula, resulting in decrease of conidia production. In Northern blot analysis, the expression of upstream developmental activators, flbB, flbC, and flbD, showed no dramatic changes during the vegetative stage following by lkhA deletion. After the initiation of asexual development, however, the level of brlAβ and brlAα expression was dramatically decreased in the lkhA deletion mutants. The level of abaA expression was also reduced significantly in the lkhA deletion mutants after asexual development. These results suggest that the lkhA may play a role in conidiophore development through transcriptional modulation of brlA expression. Since morphogenetic defects in conidiophores caused by lkhA deletion were similar to those of nimXcdc2AF mutants, suppression test of the nimXcdc2AF mutant and the lkhA-deletion strain with lkhA and nimX alleles, and Northern and Western analysis of NimX was performed. The results show that the lkhA deletion may have deleterious effects on vegetative growth and conidiophore morphogenesis based on changes in the cell division regulator NimX. The cleistothecia from the lkhAΔ strain were smaller than the wild type and immature. It showed more fragile shells filled with very few ascospores. Results from transmission electron microscopy (TEM) revealed that the lkhAΔ strains were mostly filled with amorphous aggregates that resembled ascogenous cells and contained very few asci. The electron-dense cleistins were not restricted to the outer-most peridial layers, but infiltrated into the inner parts of the cleistothecia of the lkhAΔ strain. These results indicate that lkhA is required for the completion of cleistothecial development, including organization of the peridial layers and the ascogenous cells, which collectively comprise the process of ascosporogenesis. On the basis of the immaturity of cleistothcia, the level of csnD transcription was lower, particularly during the early sexual stage (S24) of the lkhAΔ strain. Failures in development and maturation of the cleistothecial outer layers, such as toughness and pigmentation, were reversed by the over-expression of the csnD; however, no reversals were observed in terms of size of cleistothecia and the production of ascospores. These results indicate that LkhA affects the maturation of cleistothecia from primordia not only by modulating csnD transcription but also by modulating other sexual gene(s). A decrease in ppoA transcription was observed at the vegetative stage (V12), whereas an upregulation of transcription was observed during sexual development in the wild type, suggesting that lkhA influences ascosporogenesis through the transcriptional regulation of ppoA. The lkhAΔ strain cultured under normoxia showed an earlier appearance of H?lle cells. In the lkhAΔ strain, expression of mutA, encoding H?lle cell-specific α-1,3-glucanase, was detected 48 h after asexual induction, whereas this was not observed in the wild type. The early appearance of sexual organs even under optimal conditions for asexual development in the lkhAΔ strain indicates that LkhA affects the temporal regulatory mechanism through the expression of development-specific genes in A. nidulans. In the lkhA deletion mutants, the expression levels of both stuAα and stuAβ were significantly decreased at 48 h during late asexual development, as well as at 48 h during sexual development compared to that in the wild type. These data suggest that LkhA modulates the temporal regulatory circuit for the differentiation of reproductive organs through stuA expression. In summary, this study presents several pieces of evidence, supporting the connection that LkhA is not essential for viability, but is involved in germ-tube development, maintenance of axis polarity in germlings, septation in conjunction with cell division cycle, and development of reproductive organs, such as conidiophores and cleistothecia, during the life cycle of the filamentous fungus, A. nidulans. These pleiotropic effects of LkhA in A. nidulans differentiation are mainly attributed to the sequential and concerted actions of BrlA, StuA, and NimX during asexual development and of CsnD and PpoA during sexual development. The results presented here will provide new insights into the molecular mechanisms underlying development in A. nidulans.

The molecular function of Negr1 in neuronal atrophy

김혜진 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

Major depressive disorder (MDD), known as depression, is the most common psychiatric disorder. Stress, a robust risk factor for MDD, causes neuronal atrophy that reduces dendrite arborization and spine density in mature neurons of the hippocampus and the prefrontal cortex. The Neuronal growth regulator 1 (Negr1) gene, which is identified as a depression-associated gene by genome-wide association study (GWAS), encodes a cell adhesion molecule belonging to the IgLON subfamily of the immunoglobulin superfamily (IgSF). It has also been reported that anxiety and depression-like behaviors are increased in Negr1-deficient mice and that antidepressants affect Negr1 expression, suggesting that Negr1 is associated with MDD. However, little is known about the detailed molecular mechanism for the Negr1’s role in MDD. In this study, I investigated the molecular function of Negr1 in neuronal atrophy associated with MDD. I uncovered that loss of Negr1 causes atrophy of mature neurons in cultured hippocampal neurons. In addition, I demonstrated that Negr1 is involved in negative regulation of the RhoA expression in the mouse hippocampus and cortex. Taken together, these results suggest that low level expression of Negr1 increases RhoA expression and thus induces neuronal atrophy, which may lead to depression. 우울증이라고 불리는 주요 우울 장애 (Major depressive disorder, MDD)는 가장 흔한 정신 장애이다. 우울증의 강한 위험 요소인 스트레스는 해마 (hippocampus), 전전두엽 피질 (prefrontal cortex)의 성숙한 신경세포의 수상돌기분지 (dendrite arborization)와 가지돌기가시 밀도 (spine density)가 감소하는 신경세포 위축을 유발한다. 전장유전체 연관성 분석 (Genome-wide association study, GWAS)를 통해 우울증 관련 유전자로 확인된 Neuronal growth regulator1 (Negr1) 유전자는 면역글로불린 슈퍼 패밀리 (immunoglobulin superfamily, IgSF)의 IgLON 하위 집단에 속하는 세포 부착 분자 (cell adhesion molecule)를 암호화한다. Negr1 결핍 마우스에서 불안 및 우울 유사 행동이 증가하고 항우울제가 Negr1 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되었으며, 이는 Negr1이 우울증과 연관되어 있음을 시사한다. 그러나, 우울증에서 Negr1의 역할에 대한 자세한 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 이번 연구에서 우울증과 관련된 신경세포 위축에서 Negr1의 분자 기능을 조사하였다. 먼저, Negr1의 손실이 배양된 해마 신경세포에서 성숙한 신경세포의 위축을 유발한다는 것을 발견하였다. 또한, Negr1이 쥐의 해마와 피질에서 RhoA 발현의 음성 조절에 관여한다는 것을 밝혔다. 종합해보면, 본 연구는 Negr1의 낮은 발현 수준이 RhoA의 발현을 증가시켜 우울증으로 이어질 수 있는 신경세포 위축을 유도함을 시사한다.

유방암 분자표지자 ECRG4가 세포생장에 미치는 영향

가현정 忠南大學校 大學院 2011 국내석사

Breast cancer is the second most common type of cancer after lung cancer, and the fifth most common cause of cancer death. The expression of multiple genes in a cancer sample may provide useful information about cancer or normal tissue. These genes are called biomarkers. In our previous study, we searched biomarkers that increased or decreased in breast cancer from the currently available gene-expression data sets. And these biomarkers were verified by relative quantitative realtime PCR. ECRG4 is one of the biomarkers and may work as a tumor suppressor gene and affect on nuclear factor κB (NF-κB) pathway. The aim of this study was to investigate whether a breast cancer biomarker influences on cell proliferation. In this study, effects of ECRG4 on cell growth is evaluated by indirectly detecting and directly counting cell numbers in cancer cell lines transiently expressing ECRG4. Before investigating function of ECRG4 in cell, we needed to select cell lines to maximize effect of ECRG4. MIApaca2, Hs578T, and MDA-MB-231 cell lines were selected by relative quantitative real time PCR and cell line screening. According to expectation, transiently transfected MIApaca2 and Hs578T cell lines with ECRG4 grow more slowly than transiently transfected cell lines with empty vectors, but MDA-MB-231 cell line expressing ECRG4 showed faster growth. Therefore, ECRG4 has opposite effect in MDA-MB-231 cell line. This phenomenon is able to be explained by different effect of Akt pathway in MDA-MB-231. In MDA-MB-231 cell, introduced Akt, a well-known oncogene, inhibits cell proliferation and plays an opposite role. Therefore, we suggest that ECRG4 protein is involved in Akt signal transduction network.

Decapping activators Edc3 and Scd6 play an overlapping role in Ste12 expression and P-body formation

이수용 忠南大學校 大學院 2019 국내석사

Decapping 활성화 단백질인 Edc3와 Scd6의 Ste12발현과 P-body형성에 있어서 협동적인 조절 기능 연구 이 수 용 충남대학교 대학원 생명과학과 분자미생물 및 생명공학 전공 (지도교수 김 진 미) 다양한 세포 상태나 환경 스트레스에 의하여 mRNA의 효율적인 번역 또는 분해가 조절 될 수 있다. 특히 이러한 번역과 분해는 서로 경쟁적으로 작용한다. 일반적으로 스트레스 조건하에서는 P-body를 형성하여 mRNA decay complex가 형성이 되어 mRNA 분해가 일어난다. 하지만 환경조건이 바뀌면 mRNA decay complex가 형성이 되더라도 필수적으로 mRNA 분해과정을 거치지 않는다. 이렇게 mRNA decay complex가 번역 조절 기작을 확인하는데 중요하다. mRNA decay complex의 구성요소들은 decapping enzyme인 Dcp1/Dcp2, exonuclease인 Xrn1, decapping activator인 Dhh1, Pat1, Lsm1-7복합체 Edc3, Scd6가 존재한다. 이중 나는 Edc3와 Scd6에 초점을 맞추어서 연구를 진행하였다. Edc3와 Scd6는 공통 domain인 FDF과 Lsm domain을 공유하고 있다. FDF과 Lsm domain은 각각의 기능을 가지고 있다. 하지만 Edc3와 Scd6 중 한 개만 결손된 균주에서는 기능의 결함이 없지만 두개의 유전자가 같이 결손된 균주에서는 기능의 결함이 생길 수 있다. 대표적으로는 두개의 유전자가 같이 결손된 균주에서 mRNA 의 안정성이 확연하게 증가하는 선행연구 결과가 있다. 나는 이것에 착안하여 두개의 유전자가 같이 작용하여 번역 조절 기작에 어떻게 영향을 미치는지 Ste12발현량과 P-body형성을 통해 확인하였다. 먼저 edc3, scd6 결손 균주와 edc3scd6 가 같이 결손된 균주를 바탕으로 실험을 진행하였다. Phenotype으로 대표적으로 볼 수 있는 cell growth와 cell morphology를 확인하였다. 야생형균주와 비교했을 때 edc3, scd6가 단일로 결손된 균주에서는 cell growth와 cell morphology의 차이가 나타나지 않았다. 하지만 edc3scd6 같이 결손된 균주에서는 cell growth에 느려지는 결함이 발생하였고 cell morphology도 야생형균주와 다르게 부풀어서 커지는 것을 관찰할 수 있었다. 이것으로 보아 Edc3와 Scd6 각각의 단백질은 Phenotypes에 영향을 미치지 않는 것처럼 보이지만 두개의 단백질이 같이 작용하면 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 한편 Edc3와 Scd6의 번역조절기작을 관찰하기 위해 Ste12발현과 P-body형성을 확인하였다. Ste12발현에 있어서 각각의 유전자가 Ste12에 발현량에 영향이 없는 것으로 확인하였다. 하지만 이중 결손 균주에서는 Ste12의 발현량이 눈에띄게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 P-body형성에 있어서는 Edc3와 Scd6는 P-body의 구성요소 이기 때문에 단일 결손 균주에서는 P-body의 형성이 감소하였다. 하지만 이중 결손 균주에서는 P-body의 형성이 감소하는 것을 넘어서 거의 찾아볼 수 없었다. 결과적으로 Edc3와 Scd6는 협동적으로 여러 기능에 영향을 미치는데 Ste12발현 조절에 있어서 positive하게 작용을 하고 P-body형성에 중요한 영향을 미친다고 결론을 내릴 수 있다. 한편 Scd6의 domain들 중 RGG domain이 있는데 이domain의 메틸레이션이 핵심 기능인 eIF4G에 결합하는데 영향을 미친다고 알려져 있다. 나는 RGG domain이 Ste12의 발현과 P-body형성에 어떤 영향을 미치는지 연구를 하였다. 결과적으로 RGG domain의 메틸레이션이 Ste12의 발현에 있어서 positive한 조절을 하고 P-body형성에 영향을 미친다고 결론을 내릴 수 있었다. 더 나아가서 다른 decapping activator인 Dhh1과 Scd6의 기능적 상호작용에 대해서 연구하였다. dhh1이 결손된 균주에서는 Ste12의 발현량이 크게 감소하였고 scd6가 결손된 균주에서는 Ste12 발현량에 크게 영향이 없었다. dhh1scd6가 같이 결손된 균주에서는 dhh1 단일 결손 균주에서처럼 Ste12이 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 보아 두개의 단백질의 상호작용에 있어서 Scd6가 Dhh1보다 상위 단계에서 작용한다고 볼 수 있다.

미생물연료전지에서 Geobacter sulfurreducens를 이용한 전기생산과 수소생산효소를 이용한 전기 촉매적 수소생산

이유진 忠南大學校 大學院 2009 국내석사

The promise of generating electricity from the oxidation of organic substances using metal-reducing bacteria is drawing attention as an alternate form of bio-technology with positive environmental implications. Metal-reducing bacterium, Geobacter sulfurreducens is available for mediator-less microbial fuel cell (MFC) because it has biological nanowires(pili) which transfer electrons to outside the cell. In this study, in the anode chamber of the MFC system using G. sulfurreducens, the concentrations of NaCl, sodium phosphate and sodium bicarbonate as electrolytes were mainly optimized for the generation of electricity from acetate. 0.4%(w/v) NaClO and 0.5 M H2SO4 could be utilized for the sterilization of acrylic plates and proton exchange membrane (major construction materials of the MFC reactor), respectively. When NaCl concentration in anode phosphate buffer increased from 5 to 50 mM, power density increased from 6 to 20 mW/m2. However, with increasing sodium phosphate buffer concentration from 5 to 50 mM, power density significantly decreased from 18 to 1 mW/m2. Twenty-four mM sodium bicarbonate did not affect electricity generation as well as pH under 50 mM phosphate buffer condition. Optimized anode chamber of MFC using G. sulfurreducens generated relatively high power density (20 mW/m2) with the maximum coulombic efficiency (41.3%). And we examined various experimental factors to obtain the maximum power output. sparged to the cathode chamber, the cells produced electricity stably over 60 days with the regular addition of 20 mM acetate, generating the maximum power density of 7 mW/m2 with a 5,000 Ω load. Bioelectrocatalytic hydrogen (H2) production was studied using Thiocapsa roseopersicina hydrogenase in microbial fuel cell system equipped with carbon-paper electrodes. Sodium dithionite (SD), as an electron donor, and hydrogenase, as a catalyst, were used in the anodic oxidation reaction and in the cathodic reduction reaction, respectively. Methyl viologen (MV) was added for the electron relays in both reactions. The concentrations of phosphate buffer, MV and hydrogenase in the reaction chambers were optimized, in which the concentration of SD was fixed at 20 mM. Parameters including the cathode surface area, the distance between electrodes, and the external load were optimized to complete the system. Catalytic current generation in the cathode was increased from 0.12 to 0.19 mA and from 0.07 to 0.12 mA, in proportion to the hydrogenase concentration (34.8 – 347.5 µg/mL) and the cathode surface area (2.0 – 11.5 cm2), respectively however, it decreased from 0.37 to 0.08 mA and from 0.12 to 0.09 mA with the increase of the electrical load (5 – 1000 Ω and the distance between electrodes (1.5 – 3.5 cm), respectively. The optimal MV concentrations were 2.5 – 5 mM in the cathode chamber. The bioelectrocatalytic H2 production rate was calculated from the cathodic current in argon atmosphere, and the maximal value under the partially optimized conditions was estimated to be 0.16 μmol H2/min/mg-protein, which was less than 8% of the actual specific H2 production activity of the hydrogenase enzyme. This study indicates that T. roseopersicina hydrogenase has a high potential for bioelectrocatalytic H2 production still, much effort could be required to develop a proper biofuel-cell system that provides for efficient transfer of electrons and protons.

Functional characterization of pro-apoptotic and anti-apoptotic factors in Candida albicans

김세현 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

Apoptosis 란 programmed cell death(세포예정사)의 한 종류로 동물, 식물뿐만 아니라 곰팡이에서도 나타난다고 알려졌다. 세포의 유지, 개발에 중요한 요소이며 다양한 신호에 의해 발생한다. Candida albicans 는 사람에 공생하지만 캔디다증을 일으키는 기회감염성 균주이다. Yeast 형태에서 hyphae 형태로의 형태학적 전이가 가능하며 hyphae 형태는 침습적이고 조직에 침투하기 용이해 yeast 형태보다 치명적이다. 이에 더해 C. albicans 의 병원성은 hyphae 형태로의 형태학적 전이와 연관되어 있다고 알려져 왔다. 또한 quorum-sensing molecule 인 farnesol과 항진균제는 C. albicans 의 filamentation을 억제함과 동시에 apoptosis를 유발시켜 병원성과 apoptosis와의 관계가 밝혀지고 있다. 따라서 본 연구에서는 C. albicans 의 apoptosis 조절 인자들에 대한 기능적 분석과 쥐를 이용한 병원성 실험을 진행하였다. 제작된 주요 인자들의 결손 돌연변이 균주에서 ROS accumulation, caspase-like activity, TUNEL assay 그리고 viability를 통해 apoptosis phenotype을 관찰하였다. 산화적 스트레스와 farnesol 처리에 따른 apoptosis 표현형 실험 결과 CaYbh3와 CaNma111이 결손 되었을 때 apoptosis 표현형이 증가, CaBir1이 결손 되었을 때는 감소하였다. 이를 통해 CaYbh3와 CaNma111은 pro-apoptotic 조절 인자, CaBir1은 anti-apoptotic 조절 인자임을 확인하였고 CaBir1에 영향을 받은 caspase-like activity는 CaMca1 metacaspase에 의존적인 것으로 나타났다. 이에 더하여 CaNma111은 CaBir1을 하향 조절함으로써 pro-apoptotic 조절 인자로써 기능을 한다고 알 수 있었다. 다음으로 pro-apoptotic 조절 인자인 CaYbh3와 CaNma111이 C.albicans의 병원성에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 결손 돌연변이 균주를 쥐에 감염시켜 치사율을 관찰하였다. 그 결과, 결손 돌연변이 균주의 병원성이 야생형 균주에 비해 높게 나타났고 이를 통해 pro-apoptotic 조절 인자인 CaYbh3와 CaNma111은 C.albicans 의 병원성과 연관이 있는 것으로 나타났다.

Degradation of Aromatic Compounds by a Novel Strain of Paenarthrobacter

정지원 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

과학이 발전함에 따라 많은 화합물이 만들어졌다. 이러한 화합물은 xenobiotics라 불리우며 인류 사회에 많은 이점을 가져왔다. xenobiotics의 종류에는 항생제, 농약, 석유 등이 있다. 이러한 이점 때문이었을까, 많은 xenobiotics가 합성, 생산되었고 그로인해 생태계는 많은 xenobiotic에 노출되었다. xenobiotics는 자연적으로는 존재하지 않는 물질이기에 자연환경의 군집을 변이시키고, 특유의 독성으로 여러 생물에게 피해를 입힌다. Xenobiotics의 정화에는 물리학적, 화학적, 생물학적 정화가 있는데 앞선 두개의 정화법에는 많은 돈과 시간이 필요하며 추가로 환경에 2차 피해를 야기할 수 있다. 따라서 값이 싸고 자연친화적이며 지속가능한 생물학적 정화에 관심이 많아지고 있다. 본 연구에서는 xenobiotics중 하나인 유기인계 농약인 paraoxon의 분해하는 미생물을 찾기위해 태안의 농가 토양에서 40개의 세균을 분리하였다. 분리된 세균은 단일탄소원으로 paraoxon을 사용해 분리를 하였고 HPLC를 통해 분리된 세균의 paraoxo분해를 확인하였다. 그중 paraoxon분해율이 가장 좋은 한 균주를 MMS21-TAE1-1T로 명명하였으며 16S rRNA를 확인하였을 때 paenarthrobacter의 신종임을 확인하였다. MMS21-TAE1-1T 균주의 전장유전체 분석을 통해 paraoxon분해에 관여하는 phosphotriesterase 유전자를 annotation하였으며, annotation된 유전자는 포유류의 PON1단백질과는 유사성이 멀고 bacterial phosphotriesterase와 유사한것으로 나타났다. 추가로 MMS21-TAE1-1T 균주는 Paraoxon의 분해산물인 p-nitrophenol을 분해하는 것으로 확인되었기에 생물학적 정화에 더 유용할 것으로 예상된다.

LAMMER Kinase is a positive regulator for differentiation and biofilm formation of Aspergillus fumigatus

우슬아 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

LAMMER kinase는 효모에서 사람에 이르기까지 모든 진핵생물에 보존되어 있으며, 곰팡이에서 분화에 관여하는 것으로 보고되었다. 곰팡이 감염에서 형태학적 변화는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 기회 감염성 인간 병원체인 Aspergillus fumigatus의 LAMEMR kinase (LkhA) 기능은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 A. fumigatus 분화에서 LAMMER kinase 기능을 분석하기 위해 LkhA 결손 균주와 회복 균주를 제작했다. 결손 균주의 영양 생장 속도가 감소하였고, 무성 포자인 conidia 생산량이 감소하였다. 무성 분화를 위한 중심 조절 유전자 (brlA, abaA, vosA)의 발현도 결손 균주에서 감소하는 것으로 보아, 이들 유전자의 발현 감소로 인해 표현형의 변화가 나타난 것으로 보인다. 유성 분화 과정에서는 결손 균주가 비정상적인 형태의 유성 포자(ascospore)를 생성하였고, 생산량도 감소하였다. 유성 생식에 관여한다고 알려진 유전자 (vosA, veA, steA)의 발현도 결손 균주에서 감소하였으며, 유전자의 발현 감소로 인하여 유성 생식에도 영향을 미친 것으로 보인다. 감염에서 생물막 형성은 곰팡이가 항진균제에 저항하는 것에 중요한 역할을 한다. 결손 균주는 생물막 형성 능력이 저하하였으며, 생물막 형성에 관여하는 유전자 (ags1, aspF1, rodA, rodB)의 발현도 감소하였다. 이상의 결과를 종합하면, LAMMER kinase는 A. fumigatus의 생장, 무성 분화, 유성 분화 및 생물막 형성에 관여하는 양성 조절자라는 것을 알 수 있었다. 본 연구의 결과로 A. fumigatus의 LAMMER kinase 가 곰팡이의 형태학적 변화와 생물막 형성에 관여해 곰팡이의 병독성에 영향을 줄 수 있을 것이라고 예측되었다.

LAMMER kinase is a regulator of virulence factors in Aspergillus fumigatus

정재완 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

LAMMER kinase는 다양한 진핵생물에서 진화적으로 서열이 보존되어 있고, 다양한 생리학적인 과정에 관여한다. 이전 연구 결과에서 진균류의 LAMMER kinase가 분화, 세포 주기, 스트레스 반응 등의 다양한 세포 과정에 관여하는 것이 밝혀졌다. 하지만 A. fumigatus에서 독성 인자 생성과 스트레스 반응에 대한 영향은 연구된 바가 없어 본연구에서 그 영향을 분석하였다. LkhA 결손 균주는 야생형과 비교하였을 때 2차대사산물인 글리오톡신의 생합성 양이 증가하였다. 이러한 결과는 글리오톡신 생합성에 관여하는 gliP, gliZ 및 gliA 유전자가 높게 발현되는 결과와 일치하였다. 그리고 LkhA가 결손된 균주는 외부로 분비되는 프로테아제의 생합성량이 증가하였다. 특히 독성 인자로 작용하는 알칼리성 프로테아제의 생합성에 관여하는 유전자인 alp1의 발현을 증가시킴으로써, 알칼리성 프로테아제의 생합성을 증가시킨다는 결과를 얻었다. 세포 손상을 예방할 수 있는 물질로 작용하는 트레할로스의 균사내의 양을 측정하였을 때, LkhA 결손 균주에서 그 양이 증가하였다. 이러한 결과는 LkhA가 결손되었을 때 트레할로스 생합성에 필수적인 유전자인 tpsA 및 tpsB의 전사를 증가시킴으로써 생합성에 영향을 미친다는 결과를 얻었다. 또한 항산화제 역할을 하는 클루타치온의 양을 일반적인 영양 생장 단계와 산화스트레스 조건에서 배양한 뒤 그 양을 측정하였을 때 LkhA가 결손된 경우 그 양이 증가하였다. 이에 대해 LkhA가 관련 유전자의 발현을 조절하여 해당 양상이 나타난 것으로 보였다. 종합하면, 본 연구에서 LAMMER kinase가 A. fumigatus의 독성 인자와 스트레스 반응에 중요한 역할을 하는 물질들의 생합성에 영향을 미치는 것을 밝혀냈다.

Taxonomy and Quorum Quenching Potential of Reyranella spp. Isolated from Riverside Soil

이동현 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

본 연구는 Reyranella 균주의 분류학적 특성 및 N-acyl-homoserine lactone (AHL)에 기반한 quorum sensing(QS) system의 길항작용인 quorum quenching(QQ)능력을 가진 Reyranella 균주에 대한 최초의 연구이다. 토양 시료의 옥천의 보청천의 3 장소에서 수행 되었으며, 총 분리한 182종 중 Reyranella는 3종이 발굴 되었다. Reyranella 속에 속하는 5개의 종과 분리한 3종을 대상으로 농도별 QQ 능력을 확인한 결과 모든 8개의 균에서 QQ활성을 확인 할 수 있었다. 이는 Reyranella의 QQ 능력이 유전자 수준에서 보존 되었을 가능성을 보여준다. 발굴된 3종 모두 QQ능력을 가지고 있었지만, 그 중 QQ 활성이 가장 좋으며 생장조건이 뛰어난 Reyranella MMS21-HV4-11T를 대상으로 연구를 수행하였다. Whole genome 분석을 통해 MMS21-HV4-11T의 AHL degradation enzyme에 연관된 3개의 유전자를 찾을 수 있었고, 이는 protein structure를 예상 수 있는 프로그램을 통해 N-acyl homoserine lactonase 2개와 N-acyl homoserine acylase 1개로 추정 및 구조적 확인을 하였다. 병원균의 QS을 억제할 수 있는지 보기 위해 Pectobactrium carotovorum supsp. carotovorum의 soft rot 억제능력 과 Pseudomonas aeruginosa QS작용 중 하나인 Swarming motility를 억제하는 것을 확인하여 간접적으로 biofilm형성 억제의 가능성을 확인하였다. MMS21-HV4-11T은 최근연종과 orthoANI 와 GGDC에서 각각 90, 39이하의 값을 보여 신종이며, 본 연구를 통해 MMS21-HV4-11T의 분류학적 특성을 확인하였다. A novel Gram-negative, rod shaped bacterial strain MMS21-HV4-11T displaying N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL)-degrading potential was isolated from riverside soil. The strain was found to be closely related to members of the genus Reyranella and showed 16S rRNA gene sequence similarities of 98.74, 97.87, and 97.80% with R. aquatilis seoho-37T, R. soli KIS14-15T and R. massiliensis 521T, respectively. Reyranella genus currently contains 5 species, and the quorum quenching activity of the type strains of 5 known species along with the isolate was tested. All strains of Reyranella were capable of degrading C6-HSL, thus showing quorum quenching potential at the genus level. Decomposed C6-HSL showed restoration from some concentrations under acidic conditions. The genome analysis indicated that strain MMS21-HV4-11T was found to have two lactonase and one acylase candidate genes, and SWISS MODEL confirmed the expected protein structures. In the quorum sensing inhibition assay using a plant pathogen Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, the development of soft rot was significantly inhibited by MMS21-HV4-11T. In addition, the swarming motility by Pseudomonas aeruginosa was also significantly inhibited. Since the isolate did not display direct antibacterial activity against both species, this inhibition was certainly due to the quorum quenching activity by MMS21-HV4-11T. This is the first study on quorum quenching activity from Reyranella, and MMS21-HV4-11T was confirmed as a new species through chemotaxonomic and phylogenomic characterization, for which a new species Reyranella okcheonensis sp. nov. is proposed (type strain=MMS21-HV4-11T =KCTC 82780T =LMG 32365T).