Characterizing Antiviral Activity of a Triazine-based Compound Against Plant RNA Viruses

정리라 서울대학교 대학원 2020 국내석사

Plant viruses are highly contagious and their effects on plants are often drastic. Plant invasions of viruses cause physiological imbalances in various crops, resulting in significant economic losses caused by reduced crop yields and qualities. Although many catastrophic viral diseases are managed through tolerance or resistance varieties, chemical or biological control of insect vectors, quarantine of infected plants, etc., rapid emergences of plant virus diseases are growing concern due to the expansion of global trade and climate change. In order to effectively control epidemics caused by emerging plant viruses, the need for plant virus control agents is increasing. However, up to date no commercial chemical control agent is available. The purpose of this study is to characterize a triazine-based compound as potential antiviral agent by spraying this compound followed by infecting several plant RNA viruses in Nicotiana benthamiana. For this, the triazine-based compound, atrazine, with concentration of 50 µM and 100 µM was sprayed 1 hours after the virus inoculation on the 4-week-old N. benthamiana. I tested effect of spraying atrazine against six viruses which belong to different genera, i.e. Pepper mottle virus (PepMoV; Potyvirus), Potato virus Y (PVY; Potyvirus), Potato virus X (PVX; Potexvirus), Cucumber mosaic virus (CMV; Cucumovirus), Tomato spotted wilt virus (TSWV; Tospovirus) and Pepper mild mottle virus (PMMoV; Tobamovirus). The inhibitions of virus replication and movement were observed in the systemic leaves of infected plants that sprayed with the atrazine compared to that of control. In case of PMMoV, however, the atrazine treatment did not completely inhibit virus movement to the upper systemic leaves. Interestingly, mild symptoms were observed on atrazine-treated N. benthamiana, possibly due to a decrease in the level of accumulation of PMMoV RNAs upon atrazine. To investigate the major signaling pathways associated with atrazine-induced resistance, quantitative RT-PCR was performed using specific primer sets for selected genes involved in the typical signal transduction pathway(s). Expression levels of R gene, nitric oxide (NO), salicylic acid (SA) and jasmonic acid-ethylene hormone pathways related genes were significantly increase in the atrazine treated plants compared to those of mock plants. Moreover, the replication and movement of virus was also inhibited in upper systemic leaves of NahG (SA-defective) plants, suggesting atrazine-induced resistance is likely does not related to the SA pathway. Taken together, these results suggest that the atrazine-induced resistance might be involved by other signaling pathways than the SA pathway, that resulted in inhibiting plant virus replications. In conclusion, atrazine could be used as the chemical candidate for controlling or inhibiting plant RNA virus infections. 식물바이러스병은 다양한 작물에서 생리학적 불균형을 일으켜 작물의 수확량과 품질을 떨어뜨리고 경제적 손실을 초래한다. 식물바이러스병의 방제방법으로는 내병성 또는 저항성 품종을 사용하거나 바이러스 병을 매개하는 매개충 방제, 감염된 식물이나 씨앗의 제거 등이 있다. 최근 기후 변화 및 세계 무역의 확대로 인하여 식물바이러스병 발생률이 증가하고 있으며 이에 따라 화학적 방제제의 필요성이 더욱 대두되고 있다. 그러나, 지금까지 식물바이러스병 방제를 위한 상업적으로 이용할 수 있는 제제가 없다. 따라서 본 연구는 트리아진계 화합물인 아트라진의 항바이러스성 특성을 구명하고 잠재적인 항바이러스 제제로의 개발 가능성을 확인하고자 하였다. 이를 위해, Nicotiana benthamiana에 바이러스 접종 1시간 후 50 µM과 100 µM 농도의 아트라진을 경엽처리하였고 7일, 10일, 14일 경과 후 바이러스의 증식 및 이동을 관찰하였다. 사용된 바이러스는 각각 다른 속에 속하는 6종이며, Potato virus Y (PVY; Potyvirus), Pepper mottle virus (PepMoV; Potyvirus), Potato virus X (PVX; Potexvirus), Cucumber mosaic virus (CMV; Cucumovirus), Tomato spotted wilt virus (TSWV; Tospovirus) 그리고 Pepper mild mottle virus (PMMoV; Tobamovirus)이다. 연구 결과, GFP가 삽입된 infectious clone을 사용한 PepMoV, PVX, CMV의 경우, 대조군과 비교하여 아트라진을 처리한 식물의 상엽에서 바이러스의 GFP 발현이 관찰되지 않았으며 이는 바이러스의 증식과 이동이 억제되었음을 뜻한다. PVY와 PMMoV는 바이러스에 감염된 조직을 접종원으로 사용하였다. PVY의 경우, 아트라진을 처리한 식물에서 증상발생이 관찰되지 않았으며, RT-PCR 결과에서 바이러스의 RNA가 검출되지 않았다. 그러나, PMMoV의 경우, 아트라진 처리 시 상엽으로의 바이러스 이동이 억제되지 않았으며, 대조군에 비하여 증상 발생 정도가 약화된 것을 관찰할 수 있었다. 이는 qRT-PCR 결과에서 PMMoV RNA 축적 감소를 통해 확인할 수 있다. 이러한 아트라진에 의해 유도되는 저항성과 관련된 주요 신호 경로를 조사하기 위해, 식물의 신호전달경로에 관련된 유전자의 특이적 프라이머 세트를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 식물의 방어반응과 관련된 R gene, nitric oxide, salicylic acid, jasmonic acid-ethylene 경로 관련 유전자의 발현 수준이 mock과 비교하여 아트라진을 처리한 식물에서 유의미하게 증가하였다. 또한, NahG (salicylic acid-defective) 식물의 상엽에서 바이러스의 증식 및 이동이 억제되었으며 아트라진-유도 저항성이 salicylic acid 경로와 관련성이 낮다는 것을 시사한다. 종합하자면, 아트라진-유도 저항성이 salicylic acid 경로 이외의 다른 신호전달경로와 관련되어 식물바이러스 증식을 억제함을 도출할 수 있었다. 결론적으로, 아트라진은 식물 RNA 바이러스의 감염을 제어하거나 억제하기 위한 화학적 방제제 후보 물질로의 이용가능성을 제시하였다.

벼 도열병균의 발달과 병원성에 대한 수모화의 기능 구명

임유진 서울대학교 대학원 2022 국내박사

번역 과정은 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질을 만들어내는‘central dogma’의 마지막 단계이다. 그러나 생물은 번역 과정에서 한 단계 더 나아가 번역 후 수정 과정을 거쳐 생물학적 기능의 다양성을 이룬다. 단백질 번역 후 수정 과정은 특정 작용기 또는 작은 단백질을 기질 단백질에 결합하는 것으로, 대표적으로 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화(ubiquitination), 수모화(SUMOylation)가 있다. 대부분의 단백질 번역 후 수정 과정은 전 세계적으로 식량안보에 큰 피해를 끼치는 식물 병원성 곰팡이의 생장과 병원성에 중요하다고 연구되어 왔으나, 수모화는 연구가 이루어진 바 없다. 수모화는 수모 단백질(SUMO), E1 활성화효소, E2 접합효소, E3 결합효소, 단백질 분해효소와 같이 5개의 핵심 단백질들의 참여로 세포주기, DNA 수정, 전사조절과 같은 중요한 생물학적 과정들에 관여한다. 벼 도열병균은 벼와 밀에 침입하여 전 생육기에 걸쳐 발병시켜 사회경제적 피해를 주며, 기주 병원체 상호작용의 모델 생물체로 연구되어왔다. 따라서 본 연구에서는 벼 도열병균의 병원성에 대한 단백질 번역 후 수정 과정의 역할을 알아보기 위해 식물 병원성 곰팡이 최초로 수모화에 참여하는 단백질들을 동정하였다. 동정된 참여 단백질 중 수모 단백질(MoSMT3), 2개의 E1 활성화효소(MoAOS1, MoUBA2), E2 접합효소(MoUBC9)을 부호화하는 유전자의 삭제를 통해 균사생장, 분생포자와 침입 기관의 형성과 병원성에 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다. 또한, 이 참여 단백질들이 벼 도열병균의 수모화에 필수적이며 영양결핍, DNA 수정 과정 방해와 산화 스트레스에 대한 저항성에 관여하고 있었다. 기주식물을 침입할 때 노출되는 환경 스트레스 중 하나인 산화 스트레스에 의해 4개의 단백질 모두 핵에 위치하는 것으로 보아 핵단백질의 수모화는 식물 병원성 곰팡이의 스트레스 저항성에 관여할 것이라는 가능성과 함께 병원성에 대한 수모화의 역할에 대한 새로운 시각을 제시하였다. 또 다른 단백질 번역 후 수정 과정인 유비퀴틴화는 수모화와 같은 도메인을 공유지만 수모화 참여 단백질과는 다른 종류의 E1 활성화효소, E2 접합효소, E3 결합효소의 순차적 참여에 의해 기질 단백질에 유비퀴틴을 결합시킨다. 유비퀴틴화는 수모화와 달리 단백질의 분해과정에 참여하여 단백질의 품질을 관리하는 중요한 역할을 하며, 그 기질을 선택하는 데 있어 유비퀴틴화의 E3 결합효소는 매우 필수적이다. 벼 도열병균에서 유비퀴틴화에 참여하는 단백질과 병원성에 대한 연구는 다소 이루어져 있지만, Skp1/Cullin/F-box (SCF) 복합체를 이루는 F-box 도메인만을 가지고 있는 단백질(F-box only protein)과 소포체 관련 분해(endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD)) 복합체에 참여하는 E3 결합효소에 대한 이해는 매우 부족하다. 본 연구에서는 각 복합체에 참여하는 MoFBX15(F-box only protein)과 MoCUE1 (ubiquitin system component cue)의 기능분석을 수행하였다. MoFBX15와 MoCUE1은 벼 도열병균의 발달과 병원성에 관여하는데, 특히 MoCUE1은 소포체 스트레스 저항성과 식물 병원균의 병원성 인자인 이펙터(effector)의 분비와 이동에 중요하다. 게다가 각각의 E3 결합효소 부호화 유전자를 삭제한 돌연변이체에서 유비퀴틴화 뿐만 아니라 수모화가 감소하였고, 수모 단백질을 기질에서 분리시켜주는 단백질 분해효소의 발현이 감소하였다. 이를 통해 벼 도열병균의 병원성에 대한 유비퀴틴화의 역할뿐만 아니라 수모화와 유비퀴틴화의 상호작용(cross-talk)에 대한 가능성을 제시하였다. 따라서 본 연구는 식물 병원성 곰팡이의 병원성에 대한 단백질 번역 후 수정과정의 역할의 이해를 도우며, 독립적안 단백질 번역 후 수정 과정이면서 상호작용하는 수모화와 유비퀴틴화의 관계를 조명함으로써 도열병균을 포함한 식물 병원성 곰팡이에서 단백질 번역 후 수정 과정에 대한 새로운 연구방향을 제시한다. The translation process is the final step in 'central dogma', the sequential conversion process into RNA and protein. However, organisms additionally achieve a diversity of biological functions through post-translational modifications (PTMs). The PTM processes including phosphorylation, methylation, acetylation, glycosylation, ubiquitination, and SUMOylation are involved in forming various proteome by binding a specific functional group or polypeptide to substrate proteins. SUMOylation, one of the well-conserved PTMs, regulates diverse biological processes including cell cycle, DNA repair, and transcriptional regulation with the participation of five key components, SUMO, E1-activating enzyme, E2-conjugating enzyme, E3 ligase, and protease. Most PTMs have been reported to be necessary for the development and pathogenicity, but the roles of SUMOylation are not well understood in plant fungal pathogens. Magnaporthe oryzae, the rice blast fungus, is the most important fungal pathogen, causing socioeconomic damage by invading rice and wheat throughout the growing season and has been studied as a model organism for host-microbe interaction. In this study, to elucidate the roles of the SUMOylation in M. oryzae, SUMOylation components were identified for the first time in plant pathogenic fungi. Among the SUMOylation components, SUMO (MoSMT3), two E1-activating enzymes (MoAOS1 and MoUBA2), and E2-conjugating enzyme (MoUBC9) were crucial for mycelial growth, formation of conidia and infection structure, and pathogenicity. These components were essential for SUMOylation in M. oryzae and were associated with tolerance of nutrient starvation, interference of DNA repair, and oxidative stresses. In addition, four components located in the nucleus upon exposure to oxidative stress, which is one of the environmental stresses confronted when invading host plants. Taken together, this study provides the possibility of involvement between stress resistance and SUMOylation of nuclear proteins in M. oryzae, and a new perspective on the roles of SUMOylation in the pathogenicity of plant fungal pathogens. Ubiquitination, a well-known PTMs, adds ubiquitin to substrate protein by sequential participation of E1-activating enzymes, E2-conjugating enzymes, and E3 ligases, which share the same domains with SUMOylation, but are different from the SUMOylation components. Ubiquitination plays an important role in protein quality control by participating in the ubiquitin-proteasome system, unlike SUMOylation, and the E3 ligase is crucial for selecting the substrate for degradation. Although the roles of ubiquitination on the pathogenicity of M. oryzae have been studied, but little is known about the understanding of the E3 ligases forming Skp1/Cullin/F-box (SCF) complex and the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) complex. In this study, we performed functional analysis of MoFBX15 (F-box only protein) and MoCUE1 (ubiquitin system component cue protein) that participate in each complex. MoFBX15 and MoCUE1 are required for the development and pathogenicity in M. oryzae. MoCUE1 is important for endoplasmic reticulum stress resistance and the secretion and translocation of cytoplasmic effectors, virulence factor in plant pathogens. In addition, in ΔMofbx15 and ΔMocue1, SUMOylation as well as ubiquitination, decreased and the expression of SUMOylation protease coding genes that separate SUMO from the substrate was increased. This study helps to decipher the roles of ubiquitination in pathogenicity, and provides new insight on the crosstalk between ubiquitination and SUMOylation in rice blast fungus and other plant pathogenic fungi. This study provides a more comprehensive understanding of the roles of post-translational modification in the pathogenicity of fungal pathogens and illuminates the relationship between SUMOylation and ubiquitination, which are independent post-translational modifications that crosstalk with each other. Taken together, this work shed light on the post-translational modification in plant pathogenic fungi.

Identification of a quorum sensing-dependent two component system that confers pleiotropic phenotypes in Burkholderia glumae

곽지영 서울대학교 대학원 2012 국내석사

Burkholderia glumae is a Gram-negative bacterium, which causes grain rot (panicle bight) and wilt in rice. B. glumae produces a broad-host range phytotoxin, called toxoflavin that holds a key virulence factor in rice grain rot disease and bacterial wilt in many field crops. The biosynthesis of toxoflavin is regulated by quorum sensing, which is a cell to cell communication mechanism that bacteria count their own numbers by producing and detecting the accumulation of a signaling molecule that they export into environment. The accumulation of a signaling molecule is the LysR-type transcriptional activator ToxR. ToxR depends on N-octanoyl homoserine lactone (C8-HSL) that is biosynthesized by TofI and its cognate receptor is TofR. The TofR and C8-HSL complex activates qsmR expression by binding to the qsmR promoter region and help bacteria to respond to its environment. In bacteria, most two-component signal transduction systems (TCS) are composed of a sensor histidine kinase and a response regulator. TCS is the predominant means by which bacteria sense and respond to extracellular signals to allow cells to adapt to its prevailing conditions by modifying initiating programs of gene expression. In this study, a mutation in TCS transcriptional regulator gene (grtR) and phosphocarrier protein HPr gene (HPr) in B. glumae has been a focus to show the cell growth and morphogenesis are affected by quorum sensing dependent TCS. When TCS is defective (grtR mutant), along with a point mutation in HPr, the mutant colony resulted pleiotripic phenotypes and its morphology dramatically changed that its colonial surface became very glossy in B. glumae wild type background mutant. However, there was no pleiotropy accompanied by glossy colonial surface in HPr knock out mutants that they rather have had matte colonial surface. In the case of grtR and qsmR double mutant, there was very dense crystal formation indicating an ability to adjust its cytoplasmic pH in B. glumae with defective TCS and a mutation in citrate synthase gene. Therefore, the above study may be concluded as follow: when TCS is defected in B. glumae, the mutant cannot regulate certain genes for the better fitness in their environment causing incorrect signal sensing and responding, hence resulting pleiotropic phenotypes for their survival. Burkholderia glumae는 세균밀도인식기작, quorum sensing (QS)에 의존하여 세균성 벼알마름병의 병원성, 독소(Toxoflavin)의 생합성과 분비, biofilm의 형성, flagella motility, 환경적응을 위한 two component system (TCS) 등을 조절한다. 본 연구에서는 B. glumae에서 QS의 조절을 받는 TCS중의 하나인 grtK와 grtR에 Tn3-gusA insertion으로 인한 grtR에 mutation이 일어나면 pleiotropic phenotype을 나타내는 것을 확인하였다. Pleiotropic phenotypes 중 흥미로운 표현형 두 가지 중 하나는 whole genome sequencing 결과에 의하면 QS 할 수 없는 mutant strain 에서 grtR에 Tn3-gusA insertion으로 인한 mutation과 citrate synthase에 spontaneous mutation으로 인해 QS를 할 수 있게 되어 mutant colony 안에 crystal을 합성이 가능해 지는 것 과 또 다른 하나의 표현형은QS가능한 strain에서 Tn3-gusA insertion으로 인한 grtR에 mutation 때문에glossy한 colony surface를 가지는 것으로써 whole genome sequencing 결과에 의하면 phosphocarrier protein HPr (HPr) 에 point mutation으로 인한 phenotype으로 확인되었다. 이를 토대로 지금까지 발견 되지 않았던glossy한 표현형을 중심으로 EZTn5 insertion으로 인한 HPr knock out mutant를 통해 glossy colonial surface phenotype을 확인 해보았으나 matte한 colonial surface를 가지는 phenotype이 발현되는 것을 확인 하였다. 따라서 TCS를 이루는 grtK와 grtR은 B. glumae의 환경 변화에 따른 적응에 필요한 유전자 발현 경로에 영향을 미치는 것으로 추정되었다.

Identification of a major cyclic-di-GMP synthase gene involved in pellicle formation in Burkholderia glumae

정혜윤 서울대학교 대학원 2012 국내석사

셀룰로스가 주성분인 pellicle은 액체 배지와 공기 사이에 형성되는 얇은 막으로 여러 가지 환경적인 스트레스로부터 생물체를 보호하는 생물막의 일종이다. 세균이 형성하는 생물막은 주로 밀도인식기작인 quorum sensing과 second messenger인 cyclic-di-GMP (c-di-GMP)의 조절을 받는 것으로 알려져 있는데, 세포 내의 c-di-GMP 농도는 GG(D/E)EF와 EAL domain을 통해 합성, 분해되어 조절된다. 본 연구에서는 세균성벼알마름병을 일으키는 병원균인 Burkholderia glumae의 주요 c-di-GMP 합성유전자가 과발현되었을 때 pellicle 형성이 촉진되는 동시에 flagella의 기능에 영향을 미침으로써 motility를 저해함을 밝혔다. B. glumae의 wild-type strain인 BGR1을 Luria-Bertani (LB) 배지에 접종하여 28℃에서 4일 동안 배양하면 배지표면에 pellicle이 형성되는 것을 관찰하였다. Tn3-gusA fusion을 통해 B. glumae의 셀룰로스 합성유전자들이 pellicle 형성과 관련이 있고, GG(D/E)EF와 EAL domain을 encoding하는 여러 유전자 중 pelI가 IPTG inducible promoter로 과발현되었을 때 pellicle 형성이 촉진되는 것을 관찰하였으며, swimming assay와 bacterial cell의 속도 측정을 통해 과발현된 pelI가 flagella function에 영향을 주는 것을 확인하였다. Cellulose is important for protection of bacteria from environmental stresses and consequently makes them live longer and persist their virulence. The wild-type strain of Burkholderia glumae forms pellicle composed of cellulose at surface in Luria-Bertani (LB) medium. B. glumae is a Gram-negative bacterium that causes rice grain rot at the flowering stage. The wild-type strain of B. glumae forms pellicle at 28℃ whereas the quorum sensing (QS) -defective mutants failed to produce pellicle in LB. However, the QS-defective mutants formed pellicle in a buffered LB with 100 mM HEPES. The mutational analysis of genes that are involved in cellulose biosynthesis in B. glumae confirmed that cellulose biosynthetic genes are involved in pellicle formation. In many bacteria, bacterial multi-cellular behaviors including pellicle formation is often regulated by cyclic di-GMP (c-di-GMP), a second messenger. The GGDEF protein synthesizes c-di-GMP, while EAL and HD-GYP proteins hydrolyze c-di-GMP. In the B. glumae BGR1, 21 genes which encode GGDEF and/or EAL domains were identified. All 21 genes were individually mutated with Tn3-gusA or over-expressed under inducible promoter to determine which gene is the most important for pellicle formation. Mutational analysis did not give any clue to identify the most important gene for c-di-GMP synthesis and pellicle formation. Instead, when bglu_2g07220 called pelI was over-expressed in the wild-type strain, pellicle weas formed much faster than the wild-type strain carrying the empty vector. Moreover, the swimming motility was reduced under over-expression of pelI. The swimming velocity decreased and direction of swimming became irregular when pelI was over-expressed. In conclusion, QS does not directly regulate cellulose biosynthetic genes. Failure of pellicle formation by the QS-defective mutant is probably due to indirect influences by QS. Among 21 genes that encode GGDEF and/or EAL domains, pelI plays a major role in cellulose biosynthesis and pellicle formation. The results of swimming assay and velocity measurement in the wild type strain under over-expression of pelI indicate that elevated production of c-di-GMP influences both cellulose biosynthesis and flagella functions in B. glumae.

Biological characteristics of Bacillus species in the suppression of Bipolaris cactivora causing stem rot of grafted cactus

배수일 서울대학교 대학원 2012 국내석사

Grafted cactus composed of two cactus species Hylocereus trigonus and Gymnocalycium mihanovichii as stock and scion, respectively, is an ornamental plant, for which its major production area is Korea that comprises about 70% in the world market. One of the most important limiting factors for the production of grafted cacti in Korea is the qualitative and quantitative yield loss derived from stem rots of the cactus especially caused by Bipolaris cactivora. Control measures of this disease have not been well established until now. Thus, the purpose of this study is to develop microbial control agents useful for the control of the Bipolaris stem rot in the grafted cactus. Two antifungal bacterial isolates (GA1-23 and GA4-4) out of 943 microbial isolates finally selected for the biocontrol of the stem rot had cream-colored, flat or raised, and undulated colonies, rod shaped bacilli, Gram-positive, which were identified as Bacillus subtilis and B. amyloliquefaciens, respectively, by the cultural characteristics and Biolog program and 16S rRNA sequencing analyses. These two bacterial isolates showed both 40% inhibition rates of conidial germination on agar (solid) culture conditions, and 30% and 50% inhibition rates, respectively in broth (liquid) conditions. Also, they inhibited over 50% for the mycelial growth of other cactus pathogens such as Alternaria, Botrytis, Colletotrichum, Fusarium species. In vitro assay for the control of the stem rot using cactus stem discs revealed that the control efficacy of the bacterial isolates was higher in their pre- treatment than simultaneous and post- treatments. In vivo test for the biocontrol of the stem rot showed that only simultaneous treatments of the bacterial isolates reduced the disease severity significantly (control value of 64.3%), while no significant disease reduction of disease severity occurred by their pre- and post- treatments, compared to the control. To know the mechanism of their antifungal activity, fungal hyphae and spores were observed by light and scanning electron microscopy. Light microscopy of the pathogen treated with the bacterial isolates showed the inhibition of spore germination with malformation of germ tubes. Ten days after inoculation, conidia inoculated with antifungal bacteria formed circle-like vesicles. Scanning electron microscopy of the pathogen treated with the bacterial isolates showed the inhibition of spore germination with malformation of germ tubes and hyphal disruption sometimes accompanied by hyphal swellings adjacent to the bacteria. All of these results suggest the two bacterial isolates have a good potential to be developed as biocontrol agents for the Bipolaris stem rot of grafted cactus.

(A) phenome-based functional analysis of transcription factors in the cereal head blight fungus, Fusarium graminearum

손호경 서울대학교 대학원 2012 국내박사

Fusarium graminearum은 주요 곡류에 이삭마름병을 일으키며 곰팡이 독소를 생성하여 인축에 중독증을 일으키는 중요한 병원균이다. 본 연구에서 657개의 F. graminearum의 전사조절인자 후보 유전자 삭제 돌연변이체를 제조하여 17개의 형질을 관찰한 후 11,000여개의 발형체(phenome)을 구축하였다. 이를 바탕으로 F. graminearum의 생장, 발달, 스트레스 저항성, 병원성, 독소 생성 등에 영향을 주는 요소들의 조절 및 이들의 유전자 발현간의 연관관계를 규명하였다. 또한 유성생식과 관련된 전사조절인자는 곰팡이 종에서 더 잘 보존되어 있으며 이들의 삭제 돌연변이체는 다양한 형질의 변화를 보였다. 본 연구에서 확보한 돌연변이집단과 발형체는 F. graminearum의 전사조절인자의 기능을 규명함은 물론 이들 유전자 발현 상호 네트워크 구축 및 전사 차원에서 다양한 생리현상의 조절 연구를 위한 초석이 될 것이다. Fusarium graminearum is an important plant pathogen that causes head blight of major cereal crops. The fungus produces mycotoxins that are harmful to animal and human. In this study, a systematic analysis of 17 phenotypes of the mutants in 657 Fusarium graminearum genes encoding putative transcription factors (TFs) resulted in a database of over 11,000 phenotypes (phenome). This database provides comprehensive insights into how this cereal pathogen of global significance regulates traits important for growth, development, stress response, pathogenesis, and toxin production and how transcriptional regulations of these traits are interconnected. In-depth analysis of TFs involved in sexual development revealed that mutations causing defects in perithecia development frequently affect multiple other phenotypes, and the TFs associated with sexual development tend to be highly conserved in the fungal kingdom. Besides providing many new insights into understanding the function of F. graminearum TFs, this mutant library and phenome will be a valuable resource for characterizing the gene expression network in this fungus and serve as a reference for studying how different fungi have evolved to control various cellular processes at the transcriptional level.

Functional analysis of MYB transcription factors in Gibberella zeae

Lin, Yang 서울대학교 대학원 2012 국내박사

The ascomycete fungus Gibberella zeae (anamorph: Fusarium graminearum) is an important plant pathogen that causes Fusarium head blight (FHB) in cereal crops and Fusarium ear and stalk rot in maize throughout the world. The fungus produces mycotoxins that are harmful to animal and human. Sexual reproduction plays a pivotal role in the epidemics of FHB, the genetic diversity and genetic stability of fungus population, the survival of fungus during the winter season and so on. Thus, a greater understanding of sexual development in G. zeae is prerequiste for a comprehensive control strategy of the diseases caused by this fungus. In ascomycetes, fruiting body formation requires the temporal and spatial control of cell differentiation, which is a process under polygenic control. Transcription factors orchestrate gene expression under the control of cellular signaling pathways and are key mediators of cellular function. Researches on transcription factors that play important roles in regulation of sexual development will enable us to link upstream signaling pathways with downstream genes. In this study, forward and reverse genetics-based methods helped us find two interesting sexual development-related putative transcription factors. Firstly, we characterized an insertional mutant Z39P105 with a defect in sexual development and identified a gene encoding a putative transcription factor designated as MYT1. This gene contains a Myb DNA-binding domain and is conserved in the subphylum Pezizomycotina of Ascomycota. The MYT1 protein fused with green fluorescence protein localized in nuclei, which supports its role as a transcriptional regulator. The MYT1 deletion mutant showed similar phenotypes to the wild-type strain in vegetative growth, conidia production and germination, virulence, and mycotoxin production, but had defect in female fertility. A mutant overexpressing MYT1 showed earlier germination, faster mycelia growth, and reduced mycotoxin production compared to the wild-type strain, suggesting that improper MYT1 expression affects the expression of genes involved in the cell cycle and secondary metabolite production. Secondly, we selected a previously reported putative transcription factor MYT2 containing the Myb DNA-binding domain for an in-depth study on sexual development. The deletion of MYT2 resulted in a larger perithecium, while its overexpression resulted in a smaller perithecium when compared to the wild-type strain, suggesting that MYT2 regulates perithecium size differentiation. MYT2 overexpression affected pleiotropic phenotypes including vegetative growth, conidia production, virulence, and mycotoxin production. Nuclear localization of the MYT2 protein supports its role as a transcriptional regulator. Transcriptional analyses of trichothecene synthetic genes suggest that MYT2 additionally functions as a suppressor for trichothecene production. Studies of both MYT1 and MYT2 should provide important clues to help elucidating the molecular mechanisms of sexual reproduction in G. zeae. 자낭균에 속하는 Gibberella zeae(붉은곰팡이, 무성생식세대명: Fusarium graminearum)는 중요한 식물 병원성 곰팡이로서 전 세계적으로 곡물에 이삭 마름병과 옥수수에 줄기 및 이삭 썪음병을 일으키며 인축에 해로운 곰팡이독소를 생성한다. G. zeae의 유성생식은 개체군의 유전적 다양성의 확보, 월동기간 중의 생존뿐만 아니라 1차 감염원으로서 역할을 하는 자낭포자를 생성하는 과정이므로 매우 중요하며 이에 대한 분자수준의 이해는 이 곰팡이가 일으키는 식물병의 종합적 방제를 위해서 필수적이라고 할 수 있다. 자실체의 형성에는 시, 공간적으로 세밀하게 조절되는 세포 분화 과정이 필요하며 이 과정에는 다양한 유전자가 관여한다. 전사조절인자는 유전자 발현을 조절하는 역할을 하며, 세포의 기능에 있어 핵심 매개체로 기능한다. 유성생식에 중요한 역할을 하는 전사인자에 대한 연구는 유성생식에 관여하는 상위 신호조절 단계와 하위 유전자간의 연결을 가능케 할 것이다. 본 연구에서는 전•후방향 유전학적 연구 기법을 통해 유성생식에 관여하는 전사인자로 추정되는 2개의 유전자를 확보하였다. 유성생식에 있어 장애를 보인 삽입 변이체인 Z39P105는 MYT1이라 명명된 전사조절인자를 암호화 하는 유전자에 변이가 있었다. 이 유전자는 Myb DNA-binding domain을 가지며 자낭균의 아문인 Pezizomycotina에서 잘 보존되어 있다. 형광단백질과 결합된 MYT1 단백질이 핵 안에 존재한다는 것은 이것이 전사조절인자로써 작용한다는 것을 뒷받침한다. MYT1 결실돌연변이체의 경우 균사생장, 무성포자생성과 발아, 병원성, 그리고 독소생성에 있어서 야생형과 유사한 형질을 보였으나 유성생식에서의 Female fertility에는 장애를 보였다. MYT1을 과 발현 시킨 변이체의 경우 야생형과 비교하여 이른 발아와 빠른 균사생장, 그리고 독소 생성량의 감소 등의 형질을 보였고 이는 MYT1의 발현 이상이 세포주기와 이차 대사산물의 생성에 관여하는 유전자에 영향을 준다는 것을 의미한다. 다음으로 유성생식에 대한 심도 있는 연구를 위해 기존에 알려진 Myb DNA-binding domain을 포함하는 전사조절인자인 MYT2를 선발하였다. MYT2 결실돌연변이체의 경우 야생형과 비교하였을 때 더 큰 크기의 자낭각을 생성하였고 이 유전자를 과 발현 시킬 경우 반대로 야생형보다 작은 크기의 자낭각을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 MTY2가 자낭각 크기를 결정하는데 관여하는 것을 의미한다. MYT2를 과 발현 시킬 경우 균사생장과 무성포자 생성, 병원성, 그리고 독소 생성 등의 다양한 형질에 변화를 보였다. MYT2 단백질이 핵 내부에 위치한다는 것은 “MYT2가 전사조절인자로 작용한다는 것을 뒷받침한다. 곰팡이독소인 trichothecene 합성 유전자의 전사량 분석 결과는 MYT2가 부가적으로 trichothecene 합성에 억제인자로 작용한다는 것을 의미한다. MYT1과 MYT2에 관한 연구는 G. zeae의 유성생식에서의 분자 수준의 조절기작을 설명하는데 중요한 단서를 제공할 것이다.

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