High Content Screening for Compounds that Induce Early Stages of Human Embryonic Stem cell Differentiation

지주현 차의과학대학교 대학원 2012 국내석사

인간배아줄기세포는 자가 재생 능력과 다분화 능력을 지니고 있어 인체의 분화된 세포들을 대체 할 수 있는 가능성을 가지고 있는데, 이는 최종적으로 손상된 조직을 치료하고 할 수 있다는 면에서 그 가능성을 인정받고 있다. 이러한 줄기세포연구는 세포치료제 개발과 더불어 이를 위한 신약개발 분야 중 소분자 화합물 스크리닝 기술로 줄기세포에서의 분화 화합물을 검색하는 분야에서 그 중요성이 제기되고 있지만 널리 이용되기 위해서는 아직 해결해야할 문제점들이 남아 있다. 이러한 문제점들 중 한 가지는 줄기세포를 분화 시키는 데에 있어서의 복잡성으로, 현재 보고된 프로토콜들의 경우 대부분 줄기세포를 비슷한 동종의 세포들로 무작위 적으로 분화시키는 등 분화의 효율적인 면에서 그 문제점이 나타나고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 세포를 좀 더 효율적으로 안전하게 분화시키기 위하여 줄기세포내의 분자적 조절기작에 영향을 미치는 화합물을 발굴하게 되는데 이와 같은 화합물검색의 필요성은 점점 더 크게 요구되고 있는 실정이다. 따라서 줄기세포의 초기 분화에 있어서 큰 영향을 미치는 새로운 분자적 화합물의 검색을 위하여, 우리는 인간배아줄기세포를 이용하여 이미지분석을 기반으로 하여 고속화합물탐색 시스템을 개발하였다. 우리연구는 줄기세포의 분화를 유도하는 화합물들 선택적으로 선택하고, 그 외에 분화효과가 없는 화합물들 또한 선택적으로 검색 해내는 이미지 기반 소프트웨어를 개발 하였다는 데에 그 의의가 있으며, 이미 상업적으로 등록되어있는 약 3520개의 화합물 라이브러리로부터 줄기세포의 분화에 영향을 미치고, retinoic acid와 비교 하였을 때에 여러 가지 형태적 특징변화를 일으키는 소분자 화합물들을 스크리닝 하였다. 핵심되는 말 : 인간 배아 줄기세포, 이미지 기반 스크리닝, 형질 분류 Embryonic stem cells due to their self-renewal and pluripotency properties can be used to repair damaged tissues, and as an unlimited source of differentiated cells. Although stem cells represent an important opportunity for cell based therapy, and small molecules screening in the context of drug or target discovery, many drawbacks are still preventing their widespread uses. One of the most significant limitations is related to the complexity, as well as the reliability, of current protocols driving stem cells into any homogeneously differentiated cellular population. In this respect there is a strong demand for molecular agents promoting differentiation and thereby enabling robust, efficient and safe production of differentiated cells. In order to identify novel molecules that enhance early stages of differentiation, we developed an image based high content screening (HCS) approach using human embryonic stem cells (hESC). In our approach, we took advantage of custom image mining software specifically adapted for the selection of stem cell differentiation agents and the rejection of false positive hits. As a prove of concept we screened ~3500 small molecules originating from commercial libraries and were able to identify molecules of interests that show stem cell differentiation properties comparable to the phenotypic signature obtained with retinoic acid.

Research on the use of neural stem cells for treating neurological diseases

김현문 차의과학대학교 2023 국내박사

Neural crest stem cells (NCSCs) are multipotent cells that can differentiate into a broad array of cell types, including peripheral neurons, melanocytes, and mesenchymal stem cells (MSCs). Derivation of NCSCs from human pluripotent stem cells (hPSCs) has been induced by regulation of various signaling pathways, such as TGF-β/Activin A/Nodal, BMP, WNT, Notch, and FGF pathways. Many protocols used WNT activation in combination of dual SMAD inhibition or inhibition of only TGF-β/Activin A/Nodal signaling: WNT activation is required because conventional dual SMAD inhibition generates only small number of NCSCs. In this study, by modulating BMP signaling of dual SMAD inhibition, we generated large numbers of HNK+p75+ NCSCs in the absence of WNT activation. We showed that spherical cell clumps, a distinct structure formed after differentiation, mainly consisted of p75high NCSC population, which enabled us to easily isolated p75high NCSCs by mechanical dissection. We displayed a significant difference between p75high and p75low cells and showed that both p75high and p75low cells differentiated into MSC, while only p75high cells had additional capability to become peripheral neurons. This study will provide a framework for generation and isolation of NCSC populations for effective cell therapy for peripheral neuropathies and MSC-based cell therapy. Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of dopaminergic neurons in the midbrain. Mitochondrial dysfunction has been implicated in the pathogenesis of PD, and drugs that target mitochondrial function may provide therapeutic benefit. However, current in vitro models for PD drug screening do not fully recapitulate the complexity of the human brain. In this study, we generated midbrain organoids by mutating the park2 gene with CRISPR in human pluripotent stem cells and characterized dopaminergic neurodevelopmental and mitochondrial function. Then, mitochondrial dysfunction was induced using CCCP, a mitochondrial plasma membrane depolarizing drug, and used in the study. Using this model, we screened a library of drugs that target mitochondrial function and identified several compounds that improved mitochondrial recovery and dopaminergic neuron survival in PD model. These findings suggest that midbrain organoids can be used as a platform for drug screening in PD and highlight the potential of targeting mitochondrial function for PD therapy. Glioblastoma multiforme (GBM) is a devastating brain tumor. Epidermal growth factor receptor variant type III (EGFRvIII) is the most common mutation of EGFR and is found in ~25% of all GBMs. Since EGFRvIII is mostly found in GFAP+ astrocytic tumors, such as GBM, we hypothesized there may be a connection between EGFRvIII and astrogenesis. In this study, we used CRISPR/Cas9 to introduce monoallelic or biallelic EGFRvIII mutations in hESCs which were used to generate cerebral organoids. Whereas EGFRvIII-organoids had abundant astrocytes, wt-organoids had no detectable astrocytes at day 49. In contrast, TUJ1+ neurons were more abundant in the wt-organoids than EGFRvIII-organoids. In addition, the EGFRvIII-organoids were larger and had more Ki67+ cells than the wt-organoids, indicating enhanced cell proliferation as a result of the mutation. In summary, EGFRvIII mutations induced astrogenesis and were associated with massive cell proliferation. These results provide new insights into the role of the EGFRvIII mutation in gliomagenesis. Human pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells (NPCs) have the potential to recover from nerve injury. We previously reported that human placenta-derived mesenchymal stem cells (PSCs) have neuroprotective effects. To evaluate the potential benefit of NPCs, we compared them to PSCs using R28 cells under hypoxic conditions and a rat model of optic nerve injury. NPCs and PSCs (2 × 106 cells) were injected into the subtenon space. After 1, 2, and 4 weeks, we examined changes in target proteins in the retina and optic nerve. NPCs significantly induced vascular endothelial growth factor (Vegf) compared to age-matched shams and PSC groups at 2 weeks; they also induced neurofilaments in the retina compared to the sham group at 4 weeks. In addition, the expression of brain-derived neurotrophic factor (Bdnf) was high in the retina in the NPC group at 2 weeks, while expression in the optic nerve was high in both the NPC and PSC groups. The low expression of ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba1) in the retina had recovered at 2 weeks after NPC injection and at 4 weeks after PSC injection. The expression of the inflammatory protein NLR family, pyrin domain containing 3 (Nlrp3) was significantly reduced at 1 week, and that of tumor necrosis factor-α (Tnf-α) in the optic nerves of the NPC group was lower at 2 weeks. Regarding retinal ganglion cells, the expressions of Brn3a and Tuj1 in the retina were enhanced in the NPC group compared to sham controls at 4 weeks. NPC injections increased Gap43 expression from 2 weeks and reduced Iba1 expression in the optic nerves during the recovery period. In addition, R28 cells exposed to hypoxic conditions showed increased cell survival when cocultured with NPCs compared to PSCs. Both Wnt/β-catenin signaling and increased Nf-ĸb could contribute to the rescue of damaged retinal ganglion cells via upregulation of neuroprotective factors, microglial engagement, and anti-inflammatory regulation by NPCs. This study suggests that NPCs could be useful for the cellular treatment of various optic neuropathies, together with cell therapy using mesenchymal stem cells.

무 지지세포 (feeder-free) 환경에서 히스톤 탈아세틸효소 저해제들을 이용한 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포의 배양방법

김형택 차의과학대학교 대학원 2012 국내석사

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell ; hESC)는 미분화 상태를 유지하며 무한 증식할 수 있는 능력과 인체의 모든 조직과 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있다. 이러한 특성을 활용하여 다양한 종류의 세포로 분화를 통해 질병치료를 위한 치료제로써의 가능성을 가지고 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 인간만능줄기세포, 즉 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포들을 특정 세포로 분화시켜 신약 스크리닝이나 치료제 효능평가, 혹은 독성평가의 세포모델로 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행이 되고 있다. 이러한 세포모델들은 기존의 방법에 의해 소모되었던 과도한 시간, 비용, 과 인력을 줄일 수 있는 기회를 제공해 주고 있다. 전통적으로 인간 배아줄기세포의 배양은 일반적으로 생쥐 배아섬유세포(mouse embryonic fibroblast)와 같은 동물유래 지지세포 위에 세포를 배양한다. 하지만, 지지세포를 사용하는 경우 신약 스크리닝이나 효능 및 독성평가 시 지지세포의 변형에 기인한 실험결과 분석 상의 오류를 유발할 가능성이 매우 크기 때문에 극복해야 할 문제가 되어왔다. 또한 고속대량 스크리닝 (high-throughput screening)시 지지세포 접종은 시간, 비용, 노력이 많이 들게 하고 실험결과의 신뢰도에 영향을 많이 주게 된다. 본 연구에서는 히스톤 탈아세틸효소 저해제(histone deacetylase inhibitors)들을 이용한 후성학적인 조절(epigenetic control)을 통해 무지지세포 하에서도 인간만능줄기세포를 배양할 수 있는 배지를 조성하고 이들의 배양효능을 분석하는데 초점을 맞추었다. 대표적인 히스톤 탈아세틸화 저해제인 Sodium butyrate, Valproic acid, Trichostatin A를 사용 했을 때 비슷한 효율을 보였으며, 점착률과 성장속도에 있어서도 배양되어 안정적인 배양을 할 수 있었다. 배양된 배아줄기세포는 면역형광 염색과 유전자 발현에서도 미분화와 분화가 잘 유지되고 있음을 확인하였고, 안정적인 배양으로 적합하다는 것을 확인하였다. Human pluripotent stem cells (hPSCs) such as human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (hiPSCs) retain the capacity to self-renew and differentiate into cells of all three germ layers of the body. These unique properties of hiPSCs make them an ideal cell source for cell-replacement therapies to treat many incurable diseases. Conventionally, hESCs have been cultured on feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MEFs) which often ham-per successful genetic modification or screening of small molecules. In the previous study, we reported that sodium butyrate, a histone deacetylase inhibitor (HDACi), can replace basic fibroblast growth factor in culture of hESCs using MEFs as feeder cells. However, the effects of HDACis in a feeder-free culture condition were yet to be investigated. Here we set out to explore whether various HDACIs played any role in culture of hPSCs without differentiation. We found that the three commonly used HDACis, sodium butyrate, valproic acid, and trichostatin A supported undifferentiated growth of hESCs and hiPSCs efficiently. In addition, the HDACi-containing culture media also supported stable cell attachment to the bottom of vitronectin-coated dishes during each passage. The expanded hPSCs were shown to express undifferentiation markers at a significant level, while the expression of three germ layer markers was very low. Karyotyping analysis revealed no abnormal change in the chromosomes after culture of hPSCs in these HDACi-containing media. Taken together, our results suggested that HDACis can be useful to design media that can support undifferentiated growth of hPSCs in the absence of feeder cells. Keywords : human embryonic stem cells, human induced pluripotent stem cells, feeder-free culture, histone deacetylase inhibitor

임상적용 가능한 역분화만능줄기세포의 제작과 역분화 인자로서의 Glis3에 대한 연구

이서영 차의과학대학교 대학원 2014 국내석사

Induced pluripotent stem cell (iPSC) can be generated by overexpression of four reprogramming factors (OCT4, SOX2, KLF4, and C-MYC) from somatic cells. Human iPS cells exhibit many characteristics identical to those of inner cell mass-derived ES cells that are obtained from blastocyst and they have many advantages which can overcome both ethical issues and immune rejection as cell based therapy is used. However, many problems still remain when we applied iPSCs to clinically uses and studies in the fields of regenerative medicine. First, chromosomal-integration free method and virus-free method necessary for reprogramming protocols as well as xeno-free/feeder-free culture systems without animal-derived components need to be developed. Second, we should get over some problems about low efficiency of generating iPSCs and alternating factors of oncogenes that have a risk in patient-specific cell therapy. In this study, we generated hiPSCs with xeno-free/feeder-free culture medium that is previously formulated and also mRNA transfection method that is one of the footprint-free technique for clinical application of hiPSCs and we characterized hiPSCs generated in this study. Furthermore, we discovered Gli-similar protein (Glis3) improves the reprogramming efficiency when Glis3 overexpressed with four-reprogramming factors. It named Glis3-hiPSCs and then examined and identified the pluripotency and differentiation potential of Glis3-hiPSCs. 역분화만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)란 분화가 완료된 체세포에 네 가지 역분화 전사인자(OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC)의 과 발현에 의해 만들어질 수 있다. 이는 수정란의 배반포 단계(blastocyst)로부터 얻을 수 있는 배아줄기세포와 같은 특징을 가지고 있지만, 배아를 사용하지 않기 때문에 생명 윤리를 극복할 수 있으며, 자가 세포를 이용하기 때문에 면역거부반응 문제를 극복할 수 있다는 매우 큰 장점을 가지고 있다. 따라서 최근 환자 특이적 세포치료 대체방법으로 활발히 연구되고 있다. 하지만 이러한 역분화만능줄기세포를 임상 수준으로 이용 및 연구하는 데는 아직 해결 해야 할 과제들이 많이 남아 있다. 우선 역분화만능줄기세포 제작 시 크게 숙주세포의 염색체 비 삽입 (chromosomal- integration free) 및 바이러스를 사용하지 않는 방법으로 역분화만능줄기세포를 제작해야 하며, 동물유래 물질의 오염이 없는 xeno-free/feeder-free 배양 시스템을 개발하여야 한다는 점이 있다. 이 뿐만 아니라 non-oncogenic 유전자 역분화 인자를 대체하고, 역분화 효율을 높여야 한다는 점 또한 해결해야 할 과제로 남아있다. 따라서 우리는 역분화만능줄기세포의 임상적용 가능한 제작을 위해 기존에 개발한 xeno-free/feeder-free배지를 사용하여 염색체 비삽입 방법인 mRNA transfection방법을 이용해 인간 역분화만능줄기세포 제작에 성공하였으며, 이렇게 제작된 인간 역분화만능줄기세포가 인간배아줄기세포와 마찬가지로 미분화를 유지하며 배양이 가능하고, 만능분화능을 가짐을 증명하였다. 또한 역분화 인자 대체 및 역분화 효율증진을 위해 Gli-유사 단백질인 Glis3라는 transcription factor를 이용하여 Glis3-인간 역분화만능줄기세포를 제작하였고, 네 가지 역분화 인자와 함께 과 발현 시켜 제작하였을 때, 역분화 효율이 증가하며, 제작한 Glis3-인간 역분화만능줄기세포 또한 인간배아줄기세포와 마찬가지로 미분화 유지 및 만능분화능을 평가하여 동일한 특성을 가짐을 확인 하였다.

히스톤 탈아세틸화 저해제인 sodium butyrate (NaB)를 사용한 인간 배아줄기세포의 배양

장보미 차의과학대학교 대학원 2011 국내석사

인간 배아줄기세포(hESC)는 인간배아에서 기원한 세포로 무한히 분열할 수 있는 self renewal한 특성과 인체의 모든 조직(three germ layer)으로 분화할 수 있는 pluripotency한 능력을 가지고 있다. 이러한 특성으로 미래 세포치료제로서의 가능성을 가지고 연구가 진행되고 있다. 세포치료제로의 이용을 위하여 안정적이며 임상적용 가능한 다량의 미분화 hESC를 배양 할수 있는 기술이 필요하고, 이 후 원하는 시기에 원하는 방향으로의 분화를 유도 할 수 있는 기술 또한 요구되어진다. hESC를 배양은 전통적인 방법으로 mouse embryonic fibroblast (MEF)와 같은 동물유래 지지세포를 위에 basic FGF (bFGF, FGF2)를 처리한 배양배지를 사용하여 미분화를 유지하는 방법이 가장 대표적이다. 최근 들어서 많은 연구에선 serum을 제거하고 그를 대체할 수 있는 KnockOut Serum replacer와 함께 bFGF의 농도를 조절하거나 다양한 조건들을 조절하여 animal contamination 없이 hESC와 iPSC (induced pluripotent stem cells, 유도만능줄기세포)를 배양할 수 있는 배양배지를 개발하는 연구를 진행하고 있다. 이와 같은 목표를 가지고 본 연구에서는 hESC의 특성을 유지하는데 histone modifications이나 DNA methylation이 중요한 조절자로 역할 한다는 사실을 필두로 histon deacetyration inhibitor인 sodium butyrate를 처리하여 hESC를 배양할 시 어떠한 영향을 주며 지속적인 계대배양에 있어서도 안전하게 배양이 가능한지 평가하였다. 우리는 0.2mM sodium butyrate 배양배지에서 가장 효율적으로 hESC를 배양할 수 있었으며 20passage이상 계대 배양이 가능하였으며 동결과 해동 후에도 정상적으로 미분화 상태를 유지하며 배양이 가능하였다. 점착률과 성장속도에 있어서도 큰 이구 없이 배양되어 안정적인 배양조건으로 판단되어지며 배양된 hESC는 단백질 면역형광염색과 유전자발현 수준에서도 다양한 미분화 특이적 요소들을 발현하였다. 또한 지속적으로 계대 배양을 진행한 후에도 hESC의 정상적인 핵형을 확인함으로써 sodium butyrate처리를 이용한 배양이 hESC를 안정적으로 배양하는 방법으로 적합하다는 것을 확인 하였다. Human embryonic stem cells (hESCs) are mostly derived from the inner cell mass of the blastocyst and possess the ability to self-renew and differentiate into all the cells composing our body. These properties make hESCs a promising cell source for future cell replacement therapy. In order to use hESCs for clinical purposes, several issues have to be resolved such as avoidance of the xenogen contamination, prevention of tumor formation and efficient differentiation of the hESCs into a specific cell type of interest. Conventionally, hESCs has been cultured on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells in the medium containing knockout serum replacer (KSR) and basic fibroblast growth factor (bFGF). Several efforts have been made to develop more efficient media that could support undifferentiated growth of hESCs. Most of these developments have been taking advantage of the signaling pathways critically involved in self-renewal of hESCs. In this study, we tried to evaluate a method to culture hESCs by regulating epigenetic status using a histone deacetylase inhibitor, sodium butyrate (NaB). In our study, 0.2 mM of NaB could efficiently support undifferentiated growth of hESCs more than 20 passages. The hESCs cultured in the NaB-based medium were shown to express typical undifferentiated markers when analyzed by immunostaining and RT-PCR experiments. Finally, hESCs maintained for more than 20 passages displayed normal karyotype. Cumulatively, our results indicate that epigenetic regulators such as NaB could be used to culture hESCs by replacing otherwise essential growth factors such as bFGF. This study would provide useful information which might be translated into culturing hESCs for future clinical applications. Keywords : Human embryonic stem cell, Sodium butyrate, NaB, histone deacetylase inhibitor

Study on the immortalization of iPSC-derived erythroid progenitor cells via tetracycline-regulated gene expression

김유림 차의과학대학교 일반대학원 2024 국내석사

테트라사이클린 조절성 유전자 발현을 활용한 유도만능줄기세포 유래 적혈구 전구 세포 불멸화 연구 <지도교수 황 동 연> 차의과학대학교 대학원 생명과학과 김 유 림 수술, 항암치료, 만성 혈액질환 등에서 수혈은 필수적이나, 인구 고령화와 헌혈 기증자 감소로 인해 혈액 부족 문제가 심화되고 있다. 본 연구는 Rh- O 유도만능줄기세포를 활용하여 범용 수혈용 적혈구 생산을 위한 불멸화 적혈구 전구세포 주 개발을 목표로 하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 AAVS1 위치에 테트라사이클린 유도성 발현 시스템과 HPV16 E6/E7 유전자를 도입하였으나, 조혈모세포에서 유전자 침묵 현상이 관찰되었다. 이를 극복하기 위해 STEMdiff™ Erythroid Kit 로 조혈모세포로 분화시킨 후, 렌티바이러스를 통해 HPV16 E6/E7을 도입하는 방식으로 전환하였다. 그 결과, 조혈모세포(CD34+CD43+)와 적혈구 계열 세포(CD71+CD235a+)의 분화 효율이 각각 71%, 80%에 달했으며, 생존율도 98%, 79%로 높게 나타났다. HPV16 E6/E7 도입 세포는 40일 간의 장기 배양에서도 안정적인 증식을 보였고, CD71+CD235a+ 세포 비율이 27%에서 42%로 증가하여 적혈구 계열 특성이 유지되었다. 특히 증식 능력이 높은 전적혈구(Pro- E)와 호염기성 적혈구(Baso-E) 단계에서 E6, E7 단백질에 의한 p53 억제와 Rb 불활성화가 세포 주기 진행을 촉진하여 증식 속도를 높이고 장기 배양을 가능케 한 것으로 보인다. 본 연구는 테트라사이클린 의존적 발현 조절이 가능한 불멸화 적혈구 전구세포주의 확립을 목표로 하여, 이를 체외 적혈구 생산 연구의 플랫폼으로 활용하고자 하였다. Rh- O 유도만능줄기세포를 활용하여 면역거부반응이 낮은 범용 수혈용 적혈구 생산 가능성을 제시하였다는 점에서 의의가 있으며, 향후 추가 연구를 통해 이를 검증할 필요가 있다. Keyword: 불멸화 적혈구 전구세포, HPV16 E6/E7, 유도만능줄기세포, 테트라사이클린 유도성 발현 시스템

허혈성 뇌 손상 후 뇌 조직 파쇄물에 의한 신경발생 증진 효과

엄장현 차의과학대학교 대학원 2014 국내석사

전 세계적으로 인구의 고령화와 더불어 뇌혈관의 위험성이 크게 증가하고 있으며, 우리나라에서도 암 다음으로 뇌혈관 질환의 사망률이 급격히 증가하고 있는 현대사회의 대표적 질병이다. 이런 뇌혈관 질환 중 뇌졸중은 뇌혈관이 막혀서 발병하는 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)과 뇌혈관 파열로 인해 뇌 내부로 혈액이 유출되어 발병하는 출혈성 뇌졸중 (hemorrhage stroke)이 있다. 기존의 연구결과들은 뇌졸중뿐만 아니라 뇌병변이 생기면 신경세포의 증식으로 인해 손상된 병변부의 복구가 진행된다는 사실을 설명하고 있다. 따라서 본 연구에서 뇌졸중에 대한 자연 치유력의 효과를 확인하기 위해서 병변이 일어났을 때 신경세포발생 및 증식을 확인하고, 이런 현상을 유도하는 미지의 단백질을 밝혀내고자 한다. 허혈성 뇌졸중 모델에서 신경발생 및 증진효과를 검증하기 위해 흰쥐에 뇌졸중(stroke model)을 유발시켜 7일간 단백질 변화를 유도하였다. 대조군(sham model)과 함께 뇌 조직을 적출하고, 그들의 파쇄물(brain lysate)을 채취한 뒤, 정상 흰쥐의 뇌에 각 적출된 뇌 조직 파쇄물을 직접 주입하여 신경세포의 발생과 증식 여부를 관찰하였다. 조직면역염색법을 통해 파쇄물 주입 후, 증식하는 세포수를 BrdU 항체를 이용해 확인하였으며, 신경세포 확인용 단백질들을 이용하여 증식하는 세포가 신경세포임을 관찰하였다. 또한 LC-MS/MS 프로테옴 분석법을 이용한 질량분석을 수행하여 신경세포의 발생 및 증식과 연관된 후보 단백질을 동정하였다. 최종적으로 수행된 연구결과로부터 허혈성 뇌손상 뇌 조직 파쇄물은 신경세포의 발생과 증식을 유도한다. 프로테옴 분석을 통해 신경세포의 발생 (neurogenesis) 및 증식 (proliferation)과 연관된 후보 단백질을 동정하였으며, 기능성 후보 단백질을 선별하였다. 향후 이들의 기능분석은 뇌졸중 치료에 무한한 응용 가능성을 제시할 것이다. The risk of cerebrovascular diseases have been significantly increased with the aging of population around worldwide, and its mortality rate is increasing rapidly followed by cancer in Korea. Of cerebrovascular disease, stroke is mainly divided two types; 1) ischemic stroke caused by blockage of blood vessels in brain, 2) hemorrhage stroke caused by release of blood into brain due to the breakdown of the blood. Previous studies demonstrated that the damaged tissue would be restored by the increased neural cells as stroke occurs. Thus, this study was conducted to confirm the effects of neurogenesis, and identified the unknown proteins involved in the neurogenesis for the natural healing in stroke model. To verify the promotion of neurogenesis in ischemic stroke, stroke model was artificially generated with the changes of proteins during 7 days, and each brain lysate (sham and stroke) was directly injected by the brain of normal rat. After the surgery, BrdU+ cells were significantly increased as injected the stroke lysate compared to sham model, and strongly expressed the neural makers at the same time. Furthermore, a number of proteins associated with the neurogenesis were selected by the LC-MS/MS proteomic analysis. Finally, ischemic stroke lysate induce the increased neurogenesis and proliferation. Selected proteins from the proteomic analysis will be presented the unlimited possibility for the therapeutic application in stroke.

Generation of immune-compatible human embryonic stem cells using CRISPR-mediated genome editing

이건구 차의과학대학교 일반대학원 2021 국내박사

Human embryonic stem cells (hESCs) hold promise in regenerative medicine but allogeneic immune rejections caused by highly polymorphic human leukocyte antigens (HLAs) remain a barrier to their clinical applications. Here, we used a CRISPR/Cas9-mediated HLA-editing strategy to generate a variety of HLA homozygous-like hESC lines from pre-established hESC lines. We edited four pre-established HLA-heterozygous hESC lines and created a mini library of 14 HLA-edited hESC lines in which single HLA-A and HLA-B alleles and both HLA-DR alleles are disrupted. The HLA-edited hESC derivatives elicited both low T cell- and low NK cell-mediated immune responses. Our library would cover about 40% of the Asian-Pacific population. We estimate that HLA-editing of only 19 pre-established hESC lines would give rise to 46 different hESC lines to cover 90% of the Asian-Pacific population. This study offers an opportunity to generate an off-the-shelf HLA-compatible hESC bank, available for immune-compatible cell transplantation, without embryo destruction.

A study of generation of induced pluripotent stem cells from human adipose stromal cells and human foreskin fibroblast cells

이강인 차의과학대학교 대학원 2011 국내석사

역분화 만능 줄기세포란 만능 분화능 (pluripotency) 을 가지고 있지 않던 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 만능 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 유도만능줄기세포 (iPS: induced Pluripotent StemCell) 라고도 한다. 분화된 세포를 배아줄기세포와 유사한 세포로 역분화 시키는 기술은 일본 교토대학의 야마나카 신야 박사가 2006년 처음 개발해 세계적으로 이목을 받으며 세포치료제의 실용화를 한발짝 앞으로 당겼다. 일반적으로 유도만능 줄기세포는 인간 섬유아 세포나 다른 기타 분화 세포에 일반적인 4가지 요소 (Oct4,Sox2,Klf4,cMyc)를 레트로 바이러스나 렌티 바이러스에 실어 넣은 후에 지지세포(Feeder cell)위에서 인간 배아줄기세포 배양용 배지상태로 유도하게 된다. 이번 연구에서는 인간 섬유아 세포 (Human fibroblast)와 지방유래 기질세포 (human adipose stromal cell) 두 가지 세포에서 유도만능줄기세포를 제작하고 인간 배아줄기세포와 그 특징을 비교하였다. 또한 유도되는 시간과 그 특징에 대해서 분석하였다. 그 결과 인간 섬유아 세포와 인간 지방세포 모두에서 유도만능줄기세포를 얻을 수 있었고, 단백질 면역 형광염색과 유전자 발현 수준에서 인간 배아줄기세포와 비슷한 수준의 미분화 특이적 요소들을 발현하였다. 또한 두 가지 세포에서 유도만능 줄기세포가 유도되는 시간과 효율에서 차이가 있음을 알 수 있었다.

뇌졸중 후 신경발생에 미치는 미세아교세포의 영향

서진주 차의과학대학교 대학원 2013 국내석사

뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막혀서 생기는 허혈성 뇌졸중(뇌경색, Ischemia stroke)과 터져서 생기는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈, Hemorrhage stroke)으로 나뉜다. 이 중 뇌경색이 더 많이 발병을 한다. 뇌졸중이 걸린 후에는 신경줄기세포의 빠른 분열과 손상부위로의 이동 그리고 신경세포로의 분화가 일어난다. 이 현상들은 뇌졸중을 회복시키는 것에 기여 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 neurogenesis를 더 증진 시킬 수 있는 무언가를 찾으면 치료제로써 개발될 가능성이 아주 높다. 그래서 우리는 neurogenesis를 일으키는 무언가를 찾고자 했다. 먼저 뇌에 존재 하고 있는 세포들이 뇌졸중이 걸린 후에 어떤 변화가 일어나는지 확인했다. 머리에는 뇌에서 중요한 면역역할을 하는 세포로서 미세아교세포(microglia)가 존재 하고 이는 여러 형태의 뇌 손상에서 활성화 된다. 이 미세아교세포는 염증이 발생하면 그 수가 급격히 증가를 하는데 뇌졸중이 발병을 하고 나서 보이는 BrdU+한 세포의 증가와 감소 패턴이 미세아교세포랑 매우 흡사하다. 따라서 우리는 미세아교세포랑 신생세포생성 간에 관계가 있는지 확인을 하였고 더 나아가서 SDF1α가 미세아교세포에서 neurogenesis에 중요한 역할을 하는 것인지 알아냈다. There is two major types of stroke; ischemic stroke and hemorrhagic stroke. Ischemic stroke is the most common form of stroke and occurs when there is an abrupt interruption of blood flow to the brain. Stroke is increased neuroblst in the subventricular zone(SVZ) area and generation of mature striatal neuron and also migration to the damaged area. This effect is contributed to stroke damage recovery. So, we found neurogenesis factor. First, we researched cells that present in the brain and observed any changes after stroke. Microglia are immune cells of central nervous system(CNS), which are activated in response to injury and diseases. Increased the microglia cells by occur of immflamation So, that it is very similar, pattern of the increase and decrease BrdU+cell, after ischemic stroke. Therefore, we investigated between microglia and newborn cells. Furthermore, we found SDF1α what important role the incresed neurogenesis in microglia Keywords : microglia, ischemia stroke, neurogenesis, SDF1α