노로바이러스 타겟 펩타이드를 이용한 새로운 측면유동 면역분석법 기반 바이오센서 개발

정우진 인하대학교 대학원 2022 국내석사

노로 바이러스는 전세계적으로 유행하는 음식 매개의 바이러스 중 하나이다. 이 바이러스는 항생제로 치료가 되지 않고, 크기가 매우 작다. 본 연구에서는 이러한 노로 바이러스를 검출하는 펩타이드 기반 체외진단 기반 측면 유동도 면역분석 바이오 센서를 개발하였다.설명한다. 항체 기반의 측면 유동도 면역분석법(Lateral flow immunoassay; LFA)보다 펩타이드 기반의 LFA는 더욱 가격적인 면에서 뛰어나다. 작은 바이러스 입자 검출을 위한 노로 바이러스 결합 펩타이드 (NoroBPnonfoul-(FlexL)2)와금 나노 입자(gold nanoparticle; AuNP)를 결합하여 검출하였다. LFA 상에서 검출을 위하여 최적화를 진행하였고 다양한 농도의 노로 바이러스로 실험을 진행하였다. 또한 노로 바이러스의 검출한계는 107^7 particle/ml이다. 이러한 결과는 펩타이드를 이용한 LFA가 기존 항체 기반의 LFA 와 비교하여 펩타이드 기반의 LFA가 효과적인현장진단 바이오센서 플랫폼이 될 수 있음을 시사한다.

Portable Colorimetric Hydrogel Beads for Point-of-Care Antimicrobial Susceptibility Testing

송서윤 인하대학교 대학원 2024 국내석사

Sepsis is a life-threatening condition with systemic inflammatory responses caused by bacterial infections. Considering the emergence of antibiotic-resistant bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), sepsis is a great threat to public health. The gold standard methods for antimicrobial susceptibility testing (AST), however, take at least approximately 3 days to implement the entire blood culture, pure culture, and AST processes. To overcome the time-consuming nature of conventional AST, a method employing a chromatic biosensor composed of poly(diacetylene), alginate, and LB broth (PAL) is introduced in this study. Compared to the gold standards, AST with PAL biosensors can be completed within a time frame as short as 16 h. Such a significant reduction in time is possible because the consecutive cultures and AST are carried out simultaneously by encapsulating the bacterial nutrients and detection molecules into a single component. The bead-like hydrogel sensors were used in their freeze-dried form, which endows them with portability and stability, thus making them adequate for point-of-care testing. The PAL biosensor yields minimum inhibitory concentrations comparable to those from the Clinical and Laboratory Standards Institute, and the applicability of the biosensor is further shown in MRSA-infected mice.

Exploring the Role of Lysozyme-Lipid Interactions in Tear Film Lipid Layer Functionality

이드보라 인하대학교 대학원 2024 국내석사

Dry eye disease (DED) is a chronic condition characterized by ocular dryness and inflammation. The tear film lipid layer (TFLL) is the outermost layer composed of lipids and proteins that protect the ocular surface. However, environmental contaminants can disrupt its structure, potentially leading to DED. Although the importance of tear proteins in the TFLL functionality has been clinically recognized, the molecular mechanisms underlying TFLL–protein interactions remain unclear. In this study, we investigated tear protein–lipid interactions and analyzed their role in the TFLL functionality. The results show that lysozyme (LYZ) increases the stability of the TFLL by reducing its surface tension and increasing its surface pressure, resulting in increased TFLL evaporation and bacterial invasion resistance, with improved wettability and lubrication performance. These findings highlight the critical role of LYZ in maintaining ocular health and provide potential avenues for investigating novel approaches to DED treatment and patient well-being.

향상된 CHO 세포 배양 성능을 위한 실험 계획법을 사용한 화학적 정의 배지 최적화

이주민 인하대학교 대학원 2024 국내석사

생명공학기술과 함께 많은 발전을 이루고 있는 바이오 의약품인 치료용 재조합 단백질 (therapeutic recombinant proteins)과 단클론항체 (monoclonal antibodies)의 생산에는 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주가 널리 사용되고 있다. 생성물은이 당그룹이 연결되어 있는 복잡한 단백질이기 때문에 단백질 합성뿐만 아니라 번역 후 수정(post-translational modification)을 잘 수행할 수 있는 안전한 동물세포를 이용하는 것이 제품의 품질면에 있어서 중요하기 때문이다. 그리고 CHO 세포주에서 단백질의 높은 생산성을 위해서, 특정 세포주와 생산되는 재조합 단백질의 특성에 따라서 동물유래성분을 포함하지 않은, 화학적으로 성분이 명확한 화학 조성 배지 (Chemically Defined Medium, CDM)를 개발하는 것은 높은 생산성과 고품질의 생산 공정 설계에 있어 중요하다. 본 연구에서는 CDM 조성 및 농도를 최적화하기 위해서 Design of Experiment (DoE)을 사용하여 자체 화학 조성 배지 내 vitamins, lipids, polyamines, nucleoside, Pluronic F68, 아미노산에 대하여 세포 성장 및 생산성에 대한 영향을 평가하였다. screening DoE로 PBD (Plackett-Burman design)를 사용했으며, Characterization을 위해 Optimization 단계를 거쳐 Sequential DoE를 진행하였다. 유의미한 요인들의 농도를 재설정하는 단계를 거쳐 배지를 최적화하였다. 결과적으로, 기존의 자체화학조성 배지와 비교하여 세포 농도와 생산량을 1.5배 이상 향상 시키는 결과를 얻을 수 있었다. Recombinant therapeutic proteins produced in CHO cells represent a major class of biopharmaceuticals. The reason for this wide use of CHO cells is mainly their ability to perform post-translational modifications and correctly fold recombinant proteins, as well as their proven track record of being safe hosts. To produce high recombinant protein yields in CHO cells, media development is an integral step for this optimal growth environment for cells and a fundamental part in the design of upstream cell culture processes. Additionally, many industrial-scale production techniques now use Chemically Defined Media (CDM) to facilitate downstream processing and reduce the risk of adventitious infectious agents and contaminants. This study focuses on developing the CDM for recombinant CHO cells using Design of Experiments (DoE) regarding Peak Viable Cell Density (PVCD) and production (Titer). Identify the impact of vitamins and lipids, polyamines, nucleosides, Pluronic F68 were selected using Plackett-Burman Design (PBD). Subsequently, a Fractional Factorial Design (FFD) and Central Composite Design (CCD) were used to identify optimal levels and interaction among effective groups of medium components. In the optimal condition, the cells successfully reached PVCD and productivity was 1.5-fold improvement over the control culture. Our findings contribute to more efficient way for optimizing the effective fomulation and to attain higher growth and productivity to develop CDM in CHO cells.

Development of Gene Amplification-Based Expression System for High-Production Recombinant Proteins in Animal Cell

고영훈 인하대학교 대학원 2024 국내석사

Animal cell culture technology is a technique used for the production of therapeutic proteins, antibodies, and pharmaceuticals. Currently, there is a continuous increase in demand for recombinant protein therapeutics produced in mammalian cell in the biopharmaceutical market. Among these, Chinese hamster ovary (CHO) cells are widely utilized as the primary cell for commercial production of therapeutic proteins. CHO cell offer the advantage of being capable of suspension culture, making them suitable for large-scale production of recombinant proteins. Additionally, the technology for efficient gene amplification systems and high-expression cell line selection is well-established in CHO cell. While using animal cells for expression systems has various advantages, it also has the drawback of lower productivity compared to microbial systems. Furthermore, the development of techniques for large-scale protein production in cells has traditionally been based on information from the cell's genome, transcriptome, proteome, and metabolome. Particularly, at the genomic level, the technology for amplifying target genes, which can be considered as the starting point for protein production, has traditionally involved codon deoptimization of the host cell and the use of selection markers with high selective pressure. To meet the high demand for biopharmaceuticals, it is essential to quickly obtain high-productivity cells with low levels of selective pressure in a short time. However, the existing gene amplification systems, such as PEST codon deoptimization and selection marker genes, suffer from the challenge of requiring high selective pressure and an extended duration to enhance productivity. In addition, if the production period is prolonged, the stability of the cell genome can decrease, potentially impacting the productivity of the target protein. Therefore, in this research, efforts were made to establish a new amplification system for the production of target proteins in cell. As a result, the degron sequences, when compared to known gene amplification systems, were found to have a high degradation capacity and relatively short sequences, reducing the likelihood of causing structural issues with the target protein. These degron sequences were fused to selection marker genes, which were used to produce the target protein. Cell transfection was employed for the generation and selection of cells that produce the target protein through electroporation. This approach aimed to establish efficient expression vectors for high-productivity cell line development. Among various Degron sequences, including UbR, UbK, and UbS, which exhibit different levels of degradation strength, we fused each of them to the upstream region of the nutritional marker gene DHFR. This fusion was carried out to co-express these Degron sequences with the target protein, human transforming growth factor-beta Ⅰ (hTGF-β1). To facilitate this co-expression, the IRESatt sequence was inserted between the expression cassette for hTGF-β1 and the expression cassette for DHFR. Using the engineered marker, we selected the cell line with the highest expression as determined by ELISA among the transfected cell lines, and then proceeded with a clone selection process through limiting dilution. This study provides insights into the development of high-productivity cell lines and the selection process, including the use of degron sequences fused to upper selection marker genes for gene amplification mechanisms and production analysis through recombinant vectors and transfected cell. 동물세포배양기술은 치료용 단백질이나 항체 및 의약품의 생산들에 쓰이는 기술이다. 현재 바이오 의약품 시장에서 포유류 세포에서 생산되는 재조합 단백질 치료제에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 그 중 Chinese hamster ovary (CHO) 세포가 치료용 단백질의 상업적인 생산을 위한 주요 세포로 이용되고 CHO 세포는 부유배양이 가능해 재조합 단백질의 대량 생산에 용이하며, 효율적인 유전자 증폭시스템과 고 발현 세포주 선별에 대한 기술이 잘 밝혀져 있다는 장점이 있기 때문이다. 세포주 개발에는 CHOpro3-로부터 DHFR 유전자가 모두 결손 된 CHO-DG44 (DHFR-/-) 세포주가 일반적 으로 널리 사용되고 대신 되고 있는데 이러한 동물세포를 이용한 발현시스템에는 여러 가지 장점이 있지만 미생물에 비해 생산성이 낮다는 단점도 있다. 또한 세포에서 목적 단백질을 대량으로 생산하는 기술 개발은 세포 내 유전체, 전사체, 단백체, 대사체의 정 보를 기반으로 이루어져 왔다. 특히, 단백질 생산의 시작이라 할 수 있는 유전체 수준에 서 목적유전자의 증폭 기술은 분해서열과 선별마커유전자의 코돈 비최적화가 전통적으 로 사용되고 있다. 최근 바이오 의약품에 대한 높은 수요에 대응하기 위해서는 낮은 농 도의 선택압으로 단기간에 고생산능 세포를 확보하는 것이 중요하다. 그러나 기존에 사 용하는 유전자증폭시스템인 PEST 분해서열과 선별마커 유전자의 코돈 탈최적화는 생산 성을 높이는데 높은 농도의 선택압과 오랜 시간이 걸린다는 문제점을 가지고 있다. 그 리고 제작기간이 오래 걸리면 세포 유전체의 안정성이 감소하여 목적단백질의 생산성에 영향을 끼칠 수 있다. 이에, 본 연구에서는 세포에서 목적단백질 생산을 위한 새로운 증 폭 시스템을 구축하고자 노력한 결과, 분해서열 Degron은 기존에 알려진 유전자증폭시 스템과 비교하여 분해능이 높고 비교적 짧은 서열을 가지고 있어 목적단백질의 구조적 인 문제를 야기할 가능성이 낮아 Degron 서열을 선택 마커 유전자에 융합하였다. 세포 형질감염은 목적단백질을 생산하는 세포를 전기침공법으로 생성 후 선별하는데 사용함 으로써, 고생산능 세포주 개발을 통해 세포주개발 기술을 구축하고 세포주 개발에 있어 서 효율적인 발현벡터를 사용하여 고생산능 세포주를 얻는 과정을 확립하고자 하였다. Degron의 여러 서열 중에서 분해강도가 상, 중, 하의 세기를 갖는 UbR, UbK, UbS를 각 각 영양요구성마커 유전자 DHFR의 상위에 융합하여 목적단백질로 생산하는 인간전환성 장인자(hTGF-β1)와 함께 발현하기 위해 IRESatt를 hTGF-β1 발현 카세트와 DHFR 발현 카세트 사이에 삽입하였다. 융합된 마커를 통해 형질감염한 세포주 중 가장 높게 발현 되는 마커를 선택하였고 제한희석을 통해 Clone 선별과정을 진행하였다. 본 연구는 분 해서열 Degron을 영양요구성마커 유전자의 상위에 융합하여 유전자 증폭기작을 통해 목적 단백질의 생산성을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질감염된 세포 를 통한 생산량 분석을 통해 고생산성 세포주 개발 및 선별과정을 제공한다.

면역세포를 포함한 동물실험 대체용 3차원 인공 피부 시스템의 개발 및 평가

조윤지 인하대학교 대학원 2021 국내석사

화장품 및 소재의 독성시험 관련 규제가 엄격해짐에 따라 동물실험의 대안으로 인공 피부를 활용하는 경우가 증가하고 있으며, 치료 혹은 연구의 목적으로 인공 피부 플랫폼을 사용하기도 한다. 이러한 이유로 인해 in vivo와 유사한 시스템을 개발하려는 노력들이 이루어지고 있다. 하지만 지금까지 개발된 인공 피부 시스템은 대부분 2차원 배양을 기반으로 하거나 면역세포가 포함되어 있지 않기 때문에, 보다 복잡하고 실제와 유사한 시스템 개발의 필요성이 증가하고 있는 추세이다. 본 연구에서는 면역세포를 포함한 3차원 인공 피부 배양 시스템을 개발하였다. 면역세포가 포함된 시스템과 대조군에 염증반응을 유도하여 면역 인자의 발현 양상을 비교하였으며, 2차원 배양과 3차원 배양 시스템을 비교하여 시스템의 타당성을 입증하였다. 또한, 염증반응 유도 여부에 따른 배지를 회수하여 matrix metalloproteinase의 발현량을 비교하였다. 추가적으로, 개발된 시스템에 건선을 유도함으로써 피부 질병 모델로의 활용 가능성에 대해 확인하였다. 건선을 유발하였을 때 건선 인자 발현량이 증가함을 확인하였고, H&E staining을 통해 histology를 확인하여 각질층의 두께가 증가함을 확인하였다. 개발된 인공 피부 시스템을 응용한다면 추후 두드러기, 아토피 피부염, 알레르기 모델 등 면역 세포와 관련 있는 피부 질병 모델로도 적용할 수 있을 것으로 보인다.

암세포 표면의 박테리아 막 성분 기능화에 기반한 대식세포 유도 면역치료 전략

유동준 인하대학교 대학원 2026 국내석사

Macrophages possess an inherent capacity to detect and remove aberrant cells, making them attractive agents for cell-based immunotherapy against cancer. Nonetheless, their innate tumor-killing functions, such as phagocytosis and inflammatory signaling, are often impeded in the immunosuppressive tumor microenvironment, diminishing overall therapeutic efficacy. Reinforcement of macrophage immune activity was achieved by functionalizing tumor cell membranes with bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), thereby restoring their responsiveness toward cancer cells. The resulting bacteria- like cancer cells retained strong immunostimulatory activity, leading to markedly increased macrophage-mediated phagocytosis of tumor cells and elevated secretion of inflammatory cytokines. In murine tumor models, intratumoral administration of these PAMP-decorated nanoparticles effectively suppressed tumor growth in a macrophage-dependent manner. Collectively, these results highlight a versatile macrophage-based immunotherapy strategy that transforms tumor cells into bacteria-like targets, thereby reprogramming macrophages within the tumor microenvironment to achieve potent antitumor responses.

고흡수성 수지를 사용한 측면유동 면역분석법 기반 바이오센서의 민감도 향상

유태영 인하대학교 대학원 2021 국내석사

항체 기반의 측면유도 면역분석법(Lateral flow immunoassay; LFA)은 저 렴하고 간단하며 신속하게 진단이 가능하지만, 낮은 검출 한계를 가지 고 있으며 충분한 검출 정확도가 확보되지 않는다. 이러한 단점을 극 복하고 LFA 감도를 향상시키기 위해, 본 연구에서는 고흡수성 수지 (superabsorbent polymer; SAP)로 변형된 니트로 셀룰로오스 막을 사용하 는 대안을 제시한다. SAP는 하이드로겔로 분류되는 친수성 폴리머로, 물 분자와의 수소 결합을 통해 자체 질량에 비해 많은 양의 액체를 흡수하고 보유할 수 있다. 또한, 총 흡수성 및 팽윤 용량은 하이드로 겔 제조에 사용되는 가교제의 유형 및 혼합 비율에 따라 조절된다. 따 라서 변형된 LFA 시스템에서 SAP는 니트로 셀룰로오스 막에 혼입되 어 나노 크기 검출 프로브의 미세모세관 유동을 지연시킨다. LFA의 민 감도에 대한 SAP 농도 변화의 영향은 ImageJ를 사용하여 평가되었고, 수정된 SAP 장치에서의 유속은 기본 프로세스를 더 잘 이해하기 위해 수학적으로 시뮬레이션 되었다. 전반적으로 수정된 SAP 장치의 효과 는 기존 LFA 플랫폼에 비해 모델 분석물로서 Human IgG의 검출에 대 해 최대 10배 감도 향상이 되었다.

Analysis of the association of parabens with multiple toxicities and neurodegenerative diseases in a C. elegans model

이민아 인하대학교 대학원 2025 국내석사

파라벤은 유해한 박테리아와 곰팡이의 성장을 억제하고 줄이는 효과가 있는 물질로, 무취∙무미의 특성, 높은 화학적 안정성과 낮은 생산 비용 등의 장점을 지녀 전 세계적으로 화장품 및 식품의 방부제로 널리 사용되고 있다. 하지만, 내분비계 교란을 초래하여 인체 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 연구 결과들이 다수 보고되었다. 또한, 여러 선행 연구에서 파라벤의 신경 독성에 대한 우려가 제기되었으나, 이에 대한 전반적인 이해는 아직 미흡한 상태다. 본 연구에서는 예쁜꼬마선충을 실험 모델로 활용하여 파라벤의 생체 내 다중 독성을 분석하고, 신경퇴행성 질환 발병 가능성과의 연관성을 조사하고자 하였다. 이를 위해 가장 일반적으로 사용되는 메틸파라벤과 뷰틸파라벤을 분석 대상으로 선정하였다. 연구 결과, 파라벤 처리 그룹에서 성장 저해, 운동 장애, 도파민성 뉴런 손상 및 알파-시뉴클린 응집 변화가 나타났으며, 이와 관련된 유전자의 발현 변화 결과를 통해 파라벤이 다중 독성을 유발함을 확인하였다. 더 나아가 도파민성 뉴런 손상과 알파-시뉴클린 응집은 파킨슨병 발병 환자들의 대표적인 특징이기 때문에 궁극적으로, 본 연구는 파라벤의 생체 내 다중 독성 유발을 규명하고, 파라벤과 파킨슨병 간의 연관성을 밝히는 데 기여할 것으로 기대된다. Parabens are substances that inhibit and reduce the growth of harmful bacteria and fungi and are widely used worldwide as preservatives in cosmetics and food products due to their odourless and tasteless properties, high chemical stability and low production costs. However, a number of studies have reported adverse effects on human health through endocrine disruption. In addition, several previous studies have raised concerns about the neurotoxicity of parabens, but the overall understanding of this issue is still incomplete. In this study, we aimed to analyze the multiple in vivo toxicity of parabens and to investigate their association with the development of neurodegenerative diseases using C. elegans as an experimental model. Methylparaben and butylparaben, the two most commonly used parabens, were selected for analysis. The results showed growth retardation, motor impairment, dopaminergic neuronal damage and altered alpha-synuclein aggregation in the paraben-treated group, and the expression changes of the genes involved confirmed that parabens cause multiple toxicities. Furthermore, as dopaminergic neuronal damage and alpha-synuclein aggregation are typical hallmarks of Parkinson's disease patients, this study is ultimately expected to contribute to the elucidation of the in vivo multi-toxicity of parabens and to elucidate the link between parabens and Parkinson's disease.

Evaluation of Paraben Effect and Development of Microphysiological System on Liver-Muscle Glucose Metabolism

윤진경 인하대학교 대학원 2025 국내석사

간은 주로 식이 및 구강 섭취를 통하여 외부의 chemical에 노출될 수 있다. 이때, 포도당 대사 면에서 주요 장기로 꼽히는 간이 특정 chemical에 반응하면서 포도당 및 지질의 대사에서 이상이 발생할 가능성이 있다. 그리고 간은 다른 장기들과 유기적으로 연결되어 있기 때문에, 간의 대사 이상은 다른 장기에도 영향을 미칠 가능성이 있다. 파라벤은 식품 및 의약품의 방부제로써 널리 사용되는 물질로, 구강 섭취를 통해 간으로 유입될 수 있다. 보통의 경우 인체에 무해하다고 알려져 있으나, 잠재적 위험성을 시사하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 간에서 파라벤의 대사 및 노출에 의한 반응도 연구되어 오고 있지만, 현재로써 인간과 동물 연구가 대부분이었다. 따라서 이 연구는 in vitro 환경에서 간 그리고 포도당 대사의 또다른 주 장기인 근육 사이에서의 장기 간 crosstalk를 확인하고자 하였다. 웰 플레이트에서 배양액을 옮김으로써 이를 모방하였다. 간에서 농도에 따른 메틸파라벤의 영향과 그로 인해 근육에서 발생하는 이상을 RT-PCR을 통해 차례로 분석했다. 간이 메틸파라벤에 노출되었을 시 포도당 대사 연관 유전자 발현에 변화가 발생하였고, 지방산 대사 연관 유전자 발현이 증가하였다. 또한, 간에서의 변화가 정상 근육에서의 염증 및 미토콘드리아 기능에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 이 결과는 간이 파라벤에 의해 위협받을 수 있으며, 장기 간 상호작용을 통해 근육의 기능에도 영항을 줄 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 생리학적 관련성을 보장하고자 microphysiological system (MPS)을 제작했다. PDMS 재질의 플랫폼에서 간세포를 증식시켰고, 근아세포를 근관으로 분화시켜 이 MPS에서 세포를 이용한 실험의 진행 가능성을 제시한다. Liver can be exposed to foreign chemicals, mainly through diet and oral intake. As a key organ in glucose metabolism, the liver reacts to certain chemicals, which can lead to abnormalities in the metabolism of glucose and lipids. And because the liver is connected to other organs, metabolic abnormalities in the liver can affect other organs as well. Parabens are widely used as preservatives in food and pharmaceuticals and can enter the liver through oral ingestion. Although they are generally considered harmless to humans, there is a steady stream of research suggesting potential risks. The metabolism of parabens in the liver and the response to exposure have been studied, but to date, most studies have been conducted in humans and animals and have dealt with only hepatocytes on well plates. Therefore, this study aimed to identify organ-to-organ crosstalk between the liver and muscle, the other main organ of glucose metabolism, in an in vitro setting. The crosstalk was mimicked by transferring culture medium in well plates. The concentration-dependent effects of methylparaben (MeP) in the liver and the resulting abnormalities in the muscle were analyzed by RT-PCR. Exposure of the liver to methylparaben resulted in changes in the expression of genes involved in glucose metabolism and increased expression of genes involved in fatty acid metabolism. Furthermore, at the genetic level, it was found that the changes in the liver affected inflammation and mitochondrial function in normal muscle. These results suggest that the liver may be threatened by parabens and that muscle function may also be affected through organ-to-organ interactions. To further ensure physiological relevance, a microphysiological system (MPS) was created. Hepatocytes were proliferated and myoblasts were differentiated into myotubes in a PDMS microchip platform, suggesting the possibility of conducting experiments with cells such as paraben effects in this MPS.