Correction of hostile brain environment by co-grafting astrocytes improves cell therapeutic outcomes in a Parkinson's disease animal model

송재진 한양대학교 의생명공학전문대학원 2019 국내박사

Development and efficacy evaluation of skin-permeable recombinant botulinum toxin A light chain 

강진선 한양대학교 의생명공학전문대학원 2023 국내박사

Investigation of cell-to-cell variations of gene expression profiles via single-cell AmpliSeq

이주연 한양대학교 의생명공학전문대학원 2023 국내석사

Epigenetic Regulation of Anti-Tumor Immunity by SMYD3 in Breast Cancer

지은채 한양대학교 의생명공학전문대학원 2024 국내석사

Roles of follicular helper T and T helper 17 cells in Sjögren's syndrome development

최석산 한양대학교 의생명공학전문대학원 2020 국내박사

Sjögren’s syndrome (SS) is a chronic inflammatory autoimmune disorder that affects mainly salivary and lacrimal glands, but its cause remains largely unknown. Clinical data indicating that SS occurs in a substantial proportion of patients with lupus and rheumatoid arthritis point to common pathogenic mechanisms underlying these diseases. To address this idea, we asked first whether SS develops in the lupus-prone mouse strain sanroque. Owing to hyper-activation of follicular helper T (Tfh) cells, female sanroque mice developed lupus-like symptoms at approximately 20 weeks of age but there were no signs of SS at that time. However, symptoms typical of SS were evident at approximately 40 weeks of age, as judged by reduced saliva flow rate, sialadenitis, and IgG deposits in the salivary glands. Increases in serum titers of SS-related autoantibodies and numbers of autoantibody-secreting cells in cervical lymph nodes preceded the pathologic manifestations of SS and were accompanied by expansion of Tfh cells and their downstream effector cells. Thus, our results suggest that chronic dysregulation of Tfh cells in salivary gland-draining lymph nodes is sufficient to drive the development of SS in lupus-prone mice. Next, we examined whether SKG mice, a cardinal model of T helper 17 (Th17) cellmediated arthritis, also develop a secondary form of SS-like disorder. We found that SKG mice developed xerostomia upon systemic exposure to purified curdlan, a type of β-glucan. The reduced production of saliva was not caused by focal immune cell infiltrates but was associated with IgG deposits in salivary glands. Sera from curdlan-injected SKG mice contained elevated titers of IgG (predominantly IgG1), autoantibody to the muscarinic type 3 receptor (M3R) and inhibited carbachol-induced Ca2+ signaling in salivary acinar cells. These results suggest that the Th17 cells that are elicited in SKG mice promote the production of salivary gland-specific autoantibodies including anti-M3R IgG; the antibodies are then deposited on acinar cells and inhibit M3R-mediated signaling required for salivation, finally leading to hypofunction of the salivary glands. This type II hypersensitivity reaction may explain the origin of secondary SS occurring without focal leukocyte infiltrates. This study provides evidence that Tfh and Th17 cells play critical roles in the development of autoantibody-mediated secondary SS. Autoantibodies produced under the help with Tfh and Th17 cells may elicit either inflammatory damage of salivary gland tissue or non-inflammatory blocking of salivation signals. This study also suggests sanroque and SKG mice as secondary SS models.

질편모충에 감염된 전립선암세포와 지방세포의 crosstalk에 의한 대식세포의 M2 극성화

정효영 한양대학교 의생명공학전문대학원 2019 국내석사

질편모충(Trichomonas vaginalis)은 성병을 일으키는 편모충으로 전립선암 및 전립선비대 환자의 전립선조직에서 발견되었다. 전립선암의 병인은 확실히 밝혀지지 않았으나 염증반응이 관여하며, 전립선세포와 염증세포의 crosstalk이 전립선암의 침습을 일으키는데 기여한다고 알려져 있다. 비만은 전립선암을 포함해 여러 종류의 암 발병과 악화에 연관된다. 전립선 주변의 지방세포에 의해 생산되는 chemokine은 대식세포의 이동을 자극하고 M2 대식세포로 극성화를 일으킨다고 알려져 있으며, 또한 M2로 극성화된 대식세포는 전립선암세포의 침습을 증가시킨다고 보고되었다. 질편모충에 의한 전립선의 염증반응에 대해서는 연구 된 바 있으나, 활성화된 지방세포가 질편모충에 감염된 전립선세포와의 crosstalk에 의해 M2 대식세포 극성화를 유도한다는 연구는 없다. 이 연구에서는 비만인 전립선암 환자에 질편모충 감염 시 활성화된 지방세포가 대식세포의 M2 극성화를 유도하여 전립선암을 악화시킬 수 있다는 가설을 세우고 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 마우스 전립선암세포(TRAMP­C2)에 살아있는 질편모충을 감염시켰을 때 CXCL1과 CCL2의 생산이 유의하게 증가하였다. 이 chemokine들을 포함하는 전립선암세포의 염증반응물질(Trichomonad­conditioned medium, TCM)은 지방전구세포(preadipocyte, 3T3­L1)의 이동을 증가시켰다. 2. TCM을 지방세포(3T3­L1)와 반응시키면 지방세포는 활성화되어 IL­4, IL­13, CCL2 및 IL­6의 단백질과 mRNA 발현이 증가하였다. TCM에 의해 활성화된 지방세포의 분비물질(culture supernatant of adipocytes stimulated with TCM, ATCM)은 대식세포(RAW264.7)의 이동을 증가시켰는데 ATCM은 TCM에 비하여 대식세포의 이동을 유의하게 증가시켰다. 3. ATCM을 처리한 대식세포의 M2 극성화를 알아보고자, M1 및 M2 마커의 발현을 관찰하였을 때, M2 마커인 Arginase1, CD206, CXCL1 및 IL­10의 단백질 생산과 mRNA 발현이 증가한 반면, M1 마커인 TNF­α, CXCL10, iNOS, IL­1β 및 IL­6의 단백질 생산과 mRNA 발현이 저조하였다. 따라서 ATCM은 대식세포를 M2 대식세포로 극성화를 유도함을 알 수 있었다. 4. ATCM으로 극성화된 M2 대식세포의 분비물질(macrophage­ATCM, M­ATCM)에 의한 전립선암세포의 침습은 TCM과 ATCM에 비하여 유의하게 증가되었다. 이상의 결과를 종합하면 질편모충 감염에 의한 전립선암세포의 염증반응은 지방세포를 활성화시켜 대식세포의 M2 극성화를 유도함으로써 전립선암의 침습을 증가시켰다.

Bacteroides fragilis 장독소로 자극한 장상피세포에서의 CXCL11 발현

명현수 한양대학교 의생명공학전문대학원 2019 국내석사

Bacteroides fragilis는 장내세균 중 하나로서 Enterotoxigenic B. fragilis 및 Non-eneterotoxigenic B. fragilis로 나뉜다. 이 중 Enterotoxigenic B. fragilis는 B. fragilis enterotoxin (BFT)라고 부르는 독소를 생산하는데 이 BFT는 장세포에서 염증과 관련된 여러 단백질의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있으며 설사와 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)의 원인으로써 주목받고 있다. IBD의 기전에 대해서는 자세히 알려지지 않았지만, 미생물의 밀도가 높은 결장에서 주로 발생함에 따라 미생물의 자극에 대한 면역 반응이 장세포를 손상하여 염증을 일으킨다고 이해할 수 있다. 한편, chemokine중 하나인 C-X-C motif chemokine ligand 11 (CXCL11)이 염증성 장질환인 궤양성 대장염 환자의 혈청에서 높은 수준으로 존재함을 관찰한 연구가 있다. CXCL11은 receptor인 CXCR3에 결합하여 T림프구 활성화를 시키며, 활성화된 T림프구와 자연살해세포를 감염된 부위로 이동시키는 기능이 있고 Th1 세포에서 interleukin-6의 발현을 유도하는데 이 interleukin-6는 IBD에서 장 기능의 이상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 여러 기전으로 염증반응을 일으키는 CXCL11이 BFT에 의한 장 염증반응에도 영향을 끼치며, 관련된 조절경로가 있을 것으로 추정된다. 따라서, CXCL11의 발현이 BFT로부터 기인하는지, 어떤 조절경로를 거치는지를 규명하는 것을 연구의 목적으로 삼았다. 실험모델로 HCA-7 장상피세포를 사용하였으며, BFT를 처리하여 CXCL11의 발현이 BFT 처리시간에 따라 증가, 감소함을 확인하였다. 또한 BFT가 CXCL11의 발현을 유도함에 영향을 끼치는 전사인자를 확인하기 위하여 dominant negative (dn)-IκBα DNA를 lentivirus로 transduction시킨 HCA-7을 사용하였다. 그 결과로 nuclear factor kappa B (NF-κB)가 BFT에 의한 CXCL11의 발현에 영향을 끼침을 확인하였다. 이 연구를 통해 BFT에 의해 장상피세포에서 CXCL11의 발현이 유도될 수 있으며, 이 작용에는 NF-κB의 활성화가 관여함을 규명하였다.

3-(2-Carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonic acid 의 histone deacetylase 5 인산화에 의한 항우울효과에 대한 연구

박민협 한양대학교 의생명공학전문대학원 2018 국내석사

3-(2-Carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonic acid (CPP), a competitive N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist, produces rapid antidepressant-like effects in animal models of depression. Here, I showed that CPP rapidly stimulates histone deacetylase (HDAC) 5 phosphorylation and nuclear export in rat hippocampal neurons. Consequently, BDNF protein levels increased rapidly with the administration of CPP. Behavioral experiments revealed that CPP induced an antidepressant-like response and substantiated that viral-mediated hippocampal knockdown of HDAC5 blocked the antidepressant effects of CPP in stressed animals. Taken together, these results imply that CPP acts via HDAC5.

남극 지의류 유래 대사체 lobarstin이 교모세포종 세포주에 미치는 항암효과에 대한 연구

이영림 한양대학교 의생명공학전문대학원 2017 국내석사

교모세포종은 뇌의 교세포에서 기원한 뇌종양의 일종으로 예후가 극히 불량한데, 이는 일반적인 고형암과 달리 다른 기관으로의 전이는 거의 일어나지 않으나 두개골 내에서 광범위하게 침습하고 완벽한 수술적 제거가 어려워 재발하기 때문이다. 침습과 동반된 현상으로 주변 세포외기질의 분해가 나타나는데, 교모세포종이 분비하는 효소인 matrix metalloprotease 2 (MMP2)가 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에 MMP2를 표적으로 한 연구가 활발하나 임상적으로 적용할 수 있는 MMP2 억제제는 아직 개발이 되지 않은 상태이다. 로바스틴(Lobarstin)은 인산가수분해효소인 PTPN1을 억제하는 생리활성을 탐색하여 분리한 남극 지의류의 대사체이다. 최근 PTPN1은 다양한 암종에서 악성 표현형의 개시 및 유지와 관련이 높다는 보고에 따라 신규 항암제 개발의 표적으로 연구가 활발하다. 실제로 본 연구실에서 PTPN1 억제제인 로바스틴을 교모세포종과 급성골수백혈병 세포주에 기존 항암제와 병용 처리하였을 때 항암제의 독성이 제고되는 효과에 대한 선행연구가 있으나, 침습에 대한 효능은 아직 연구된 바 없다. 한편, 최초로 발견된 종양유전자인SRC는 암세포의 침습을 조절하는 역할이 보고된 바 있는데, AKT의 활성화를 경유하여 MMP2유전자의 발현을 촉진하는 분자적 기전이 알려져 있다. SRC는 인산화에 의해 활성이 조절되는 단백질인산화효소인데, PTPN1의 작용으로 탈인산화 되면 활성화 될 수 있다. 이상의 기존 연구결과에 착안하여 로바스틴에 의해 교모세포종의 침습이 억제될 수 있다는 가설을 세웠고, 다양한 교모세포종 세포주를 로바스틴으로 처리한 후 MMP2의 활성과 발현변화를 검정하였다. 교모세포종 세포주 중 MMP2의 발현이 높아 침습성이 가장 높은 U-87MG 세포주로 invadopodia assay를 수행하여 로바스틴을 처리한 실험군이 vehicle을 처리한 대조군에 비해 젤라틴을 매질로 한 침습현상이 유의미하게 감소함을 관찰하였다. 배지로 분비된 MMP2의 활성을 측정하는 zymography를 수행하여 로바스틴을 처리한 실험군의 MMP2 활성이 더 낮음을 보았고, 면역블롯팅으로 분비된 MMP2 단백질의 양도 감소하였음을 관찰하였다. 세포 내의 발현량을 검정하기 위해 qPCR과 면역블롯팅을 수행하여 mRNA와 단백질 수준에서 MMP2의 발현이 감소하였음도 관찰하였다. 로바스틴을 처리한 세포에서 인산화된 불활성형 SRC가 대조군에 비해 증가하였고, 인산화된 활성형 AKT는 감소함을 보았다. 이와 같은 결과를 종합하면 인간 교모세포종 기원 세포주의 침습이 로바스틴에 의해 억제 되며, SRC와 AKT의 조절을 통해 MMP2의 발현을 억제하는 로바스틴의 항암효과를 제시할 수 있었다.

Phosphatidic acid induces decidualization through regulation of Akt-PP2A binding in human endometrial stromal cells

이소영 한양대학교 의생명공학전문대학원 2016 국내석사

사람 자궁내막세포 (humans endometrial stromal cells)의 탈락막화 (decidualization)는 착상과 임신 유지에 있어 중요하게 작용하는 생화학적, 형태학적 분화과정이다. 여성의 자궁은 28일을 주기로 다양한 변화가 규칙적으로 일어나는 데, 이 때 자궁내막의 두께의 변화와, estrogen 그리고 progesterone과 같은 성호르몬의 농도변화가 규칙적으로 일어난다. 탈락막화는 progesterone의 농도가 증가하고, 자궁내막의 두께가 두꺼워 지는 배란 이후의 분비기 (secretory phase) 에서 일어나며, 이 때 세포 내 cAMP 농도 또한 함께 증가함이 밝혀진 바 있다. 이 탈락막화 과정에서 인지질 분해효소인 phospholipase D1 (PLD1) 와 그것의 산물인 phosphatidic acid (PA)는 매우 중요한 매개체로 작용함이 보고 되었다. 하지만 아직 PA 하위의 어떠한 기전이 탈락막화를 유도하는 신호체계로 작용하는 지에 대해선 알려지지 않았기 때문에 본 논문은 이와 관련하여 기술하였다. PA 하위에서 자궁내막 세포의 탈락막화를 유도하는 신호체계를 밝히기 위해 PA를 처리하여 탈락막화가 유도 되었음을 형태학적 변화와 표시자인 IGFBP-1 과 prolactin 의 mRNA 발현 양의 증가로 확인하였다. 이와 더불어 PA 처리에 의해서 Akt와 FoxO1의 인산화가 감소되었다. 이 현상은 PLD1의 억제에 의해 모두 복구 됨으로써, PLD1이 탈락막화에 중요한 조절자임을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 cAMP와 PA 처리에 의해 PP2A와 Akt가 결합하였고 이 결합으로 인해 Akt가 탈락막화 동안 비활성화 즉, 탈인산화 되는 것임을 확인하였다. PP2A의 억제제인 Okadaic acid에 의해 Akt의 탈인산화가 억제 되었고 또한 탈락막화가 억제 되었다. 따라서 본 연구에서는 PA가 PP2A와 Akt의 결합을 증가시키는 메커니즘을 조절하여 cAMP에 의해 유도 되는 탈락막화를 조절한다는 새로운 사실을 제시할 수 있었다. Decidualization of human endometrial stromal cells (hESCs) is a crucial differentiation phenomenon for successful uterine implantation and maintenance of pregnancy. We previously reported that phospholipase D1 (PLD1) is a key enzyme for cAMP-induced decidualization in hESCs. However, the mechanism by which phosphatidic acid (PA), the enzymatic product of PLD1, regulates decidualization is not known. We confirmed PA-induced hESCs decidualization by observing morphological change and measuring increased level of decidualization markers such as IGFBP-1 and prolactin mRNA expressions. Treatment with PA reduced phosphorylation of Akt and FoxO1, respectively, subsequently increasing IGFBP-1 and prolactin mRNA levels. Conversely, PLD1 knockdown rescued Akt phosphorylation, implying PLD1 is a potent regulator of hESC decidualization process. Interestingly, binding of PP2A and Akt was increased in response to cAMP or PA, suggesting that their binding is directly responsible for the inactivation of Akt during decidualization. Consistent with this observation, treatment with okadaic acid, a PP2A inhibitor, also inhibited cAMP-induced decidualization by blocking Akt dephosphorylation by PP2A.