핵전이에 의한 Aspergillus속과 Penicillium 속의 잡종으로부터 생산된 esterase특성

양영기,문명님,임채영 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1994 유전생물공학연구지 Vol.4 No.-

핵전이에 의해 Aspergillus oryzae var oryzae와 MPV 31 사이의 잡종을 획득하였고, 그특성과 esterase 활성 및 동위효소 양상을 조사한 결과는 다음과 같다. UV와 MNNG의 이중처리에 의해 A. oryzae var oryzae와 P. verruculosum F-3의 영양요구성 돌연변이를 각각 3주, 6주를 획득하였으며, 핵전이를 위한 원형질체 형성의 최적조건은 PH 5.8, 1.0% Novozym 234, 0.6 M KCl 그리고 효소의 처리시간은 2 시간으로 하였다. 또한 원형질체 재생을 위한 삼투안정제도 역시 0.6 M KCl이었으며, 재생율은 각각 56.4%, 52.3%로 나타났다. 핵전이에 의한 형질전환율은 3.0 x 10<윗첨자>-5</윗첨자>~1.0 x 1<윗첨자>-5</윗첨자>으로 나타났으며, 형질전환체의 유전적 안정성과 conidial size, 핵염색, 그리고 DNA 함량의 측정결과핵형은 aneuploid로 추정되었고 효소 활성의 측정결과 형질전환체가 모균주에 비해 1.3~2.2배 가량 증가하였으며, 동위효소 양상은 형질전환체와 모균주에서 유사하게 나타났으나 효소활성에 차이가 있음을 알수 있었다. Intergeneric hybrids formed between Aspergillus oryzae var oryzae and Penicillium verruculosum F-3 were obtained by nuclear transfer technique. Several auxotrophic mutants isolated from conidiospores of the two strains mutagenized with ultraviolet and N-methyl-N-nitrosoguani-dine. Optimal conditions for formation of intergeneric hybrids were investigated. Frequencies of hybrid formation by nuclear transfer were 1 x 10<윗첨자>-5</윗첨자>~3 x 10<윗첨자>-5</윗첨자>. From observation of genetic stability, conidial size, DNA content, nuclear stain, it was suggested that their karyptypes are aneuploid. The hybrid posses the 1.2~l.8 fold higher esterase activities than those of parental strains. It was also revealed that some hybrids had different isozyme patterns compared with those of parental strains by esterase activity assays.

PCR 방법에 의한 Renin cDNA의 증폭합성과 클로닝을 통한 유전자 발현

차영주,이숙영,김성준,박영순 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1991 유전생물공학연구지 Vol.1 No.1

본 실험은 생쥐 악하선의 renin mRNA로부터 cDNA를 합성하였으며 분자 육종을 통하여 rennin cDNA의 유전자 발현을 유도하여 얻은 결과는 다음과 같다. 생쥐 악하선으로부터 총RNA를 GIT/CsCl 방법에 의하여 분리하고 oligo(dT) cellulose와 poly(U) sepharose 4B matrix를 이용하여 mRNA를 분리하였다. Renin cDNA로부터 primer Ⅰ과 primer Ⅱ를 합성하여 polymerase chain reaction(PCR)방법으로 cDNA를 합성하고 증폭하였다. cDNA를 pUC19 플라스미드에 ligation시켜 재조합 플라스미드(pUCR1)를 제조하였다. pUCR1을 E. coli JM103 균주에 형질전환시켰으며 rennin 유전자를 갖는 형질전환체를 Southern blot analysis 방법에 의하여 확인하였다. 형질전환체인 E. coli JM103에서 renin 유전자의 발현물질인 분자량이 45,000되는 rennin 단백질을 확인하였다. These experiments were designed to investigate the molecular cloning of renin cDNA synthesized from renin mRNA of mouse submaxillary gland, and thus to characterize the renin protein expressed by the renin cDNA. The results obtained were as follows: The total RNA was isolated from the mouse submaxillary gland by the method of GIT/CsCl, and the mRNA was separated by using oligo(dT) cellulose and poly(U) sepharose 4B matrix. Primer Ⅰ and primer Ⅱ was synthesized from renin cDNA, and cDNA was transcribed reversely and amplified by the method of polymerase chain reaction(PCR). The recombinant plasmid(pUCR1) was constructed by ligating the cDNA into the pUC19 plasmid of E. coli vector, and then pUCR1 was transformed into E. coli(JM103) and the recombinant plasmid was identified with southern blot analysis. The renin gene expression was identified with polyacrylamide gel electrophoresis and the molecular weight of renin was 45,000.

벼의 早期老化 變異체의 形態, 生理 및 生化學的 特性

金弘燮,林采圭 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1993 유전생물공학연구지 Vol.3 No.-

人爲 突然變異 誘起에 의한 새로운 遺傳形質開發과 有用한 遺傳子 情報를 밝히기 위해 기호벼에서 얻어진 早期老化系統에 대하에 葉色素 含量, 千粒重의 경시적 변화, 葉의 組織特性, 光 反射率 및 透過率, 同位酸素 및 蛋白質 特性 등을 기호벼와 比較 分析하였다. 얻어진 結果를 要約하면 다음과 같다. 1. 기호벼에서 誘起 選拔된 早期老化系統은 生育初期에는 正常葉으로 表現되다가 出穗 後 20日傾부터 갑자기 葉이 黃變하여 급속히 老化가 進行되는 特性을 가지고 있다. 이 系統을 老化에 關聯되는 生理 生化學的 代謝機作을 밝히는 材料로 利用될 수 있을 것이다. 2. 早期老化系統의 總 葉綠素 含量은 出穗 後 20日 이후 급격히 減少하여 기호벼 葉綠素 含量의 67%를 나타냈고, carotenoid色素들에 있어서도 出穗 後 20日이후 급격히 減少하였다. 3. 早期老化系統의 總 葉綠索 含量은 出穗 後 20日부터 급격히 減少하였으나 千粒重은 出穗 後 25日부터 增加가 둔화되어 최종 千粒重은 기호벼에 比해 9% 減少하였다. 4. 早期老化系統과 기호벼에 있어서 葉 細胞 微細器菅의 差異는 出穗 後 20日까지는 볼 수 없었으나, 出穗 後 30日에는 뚜렷한 差異를 나타냈다. 특히 早期老化系統은 grana의 배열이 變形되면서 澱粉粒이 축적되어 葉綠體 모양이 파괴되어 있었다. 5. 個葉狀態에서 早期老化系統은 기호벼에 比에 光合成에 關與하는 400~700nm의 波長에서 反射率 및 透過率이 높았으며, 특히 560∼700nm의 赤色帶에서 더 높았다. 群落狀態에서도 早期老化系統의 反射率은 赤色帶부근에서 기호벼보다 높았다. 6. 等電點 電氣泳動法으로 esterase와 peroxidase 同位酸素 特性을, 그리고 SDS-PAGE 法으로 蛋白質 特性을 登熟時期別로 調査한 結果 두 系統間 質的인 差異는 보이지 않았으나 時期別로는 量的差異를 나타냈다. The early senescence mutant induced from Gihobyeo by γ-ray irradiation was determined. The mutanted gene expression was identified with comparing the characteristic of original cultivar. The mutant had so similar the morphological characteristics to original cultivar that it couldn't be distinguished until senescence occurred at about 20 days after heading. Suddenly yellow leaves were observed within a few days due to great decreases in total chlorophyll and various carotenoid contents. Transmission electron microscopy showed the formation of starch granules, destortion of fine structure of leaf cell organelles, especially grana structures, and the decrease in grain filled after senescence occurred. But banding patterns of total proteins and isozymes have not show any differences. The early senescence mutant will be very useful for study material not only on physiology and biochemistry of plant senescence but also on gene expression regulating senescence which gives great influence on yield potential and its stability.

식초로부터 분리한 초산발효균들의 특성에 관한 연구

전홍성,박종필,이양수,김연순,김종승,김성준 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1992 유전생물공학연구지 Vol.2 No.-

본 실험은 호남 지역에서 한국고유의 전통적인 방법으로 발효시킨 막걸리 식초와 포도 식초, 석류초, 사과초 등에서 초산발효균을 분리하여 그 특성을 조사하고 초산 발효 유전자를 탐색하고자 하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 분리균주는 모두 gram-negative의 간균 또는 구균으로서, AP-32, PM-18, GJ-30, KC-6은 Gluconobacter, GA-32, HA-36, KA-32, GV-16은 Acetobacter속에 속함을 확인하였다. 2. 분리균주는 전반적으로 기존의 초산발효균과 다른 생화학적 특성을 보였다. 3. 분리균주 모두 4일 이상의 완만한 성장특성을 나타내었다. 4. Methylprednisolon에 GJ-30을 제외한 모든 균주가 상당한 내성 (512㎍/ml)을 보였고, Kanamycin(0.5-8㎍/ml)에 분리균주 모두 감수성을 나타내었다. 5. 분리균주 모두 중금속인 ferric chloride에 상당한 내성(50-400g/ml)을 보여주었다. HA-36, GA-32, KA-32균주는 거의 동일한 중금속 내성정도를 나타내었다. 수은과 질산은, cadmium에 대해서는 모든 균주가 감수성을 보였다. 6. wild type Tn5를 conjugation시킨 결과 HA-36와 GA-32에서 1×10^-5-5×10^-7범위로 conjugants가 나타났다. 7. Ethanol이용도를 비교한 결과 mutants가 wild type보다 50%이상 그 이용도가 낮아졌다. 8. 돌연변이주 들을 Bromcresol purple을 indicator로 첨가한 선택배지에서 선발한 결과 color변화가 전혀없는 번이주와 yellow color로 바뀌는 변이주가 나타났다. yellow coler로 바뀌는 변이주는 acetate에서 TCA cycle로 들어가는 과정에 관여하는 유전인자에 삽입된 것으로 추정할 수 있으며, color변화가 전혀없는 변이주는 초산발효 관련 유전자에 끼어들어가 酸度변화를 나타내지 못하는 것으로 추정할 수 있었다. Eight strains of bacteria were isolated from vinegar produced in Honam area. Among eight strains of vinegar producer, four isolates identified as Genus Gluconobacter and the others identified as Genus Acetobacter on the basis of physiological and biochemical characterization. Optima of temperature and of pH for growth of isolates were 28-30℃ and 5.5-6.0, respectively. Although most of the selected strains were sensitive to antibiotics, the selected strains showed resistance to Methylprednisolon and also most of the isolates were showed resistance to such heavy metals as ferric chloride, CuCl_2. The wild type transposon Tn5 was used for transposon mutagenesis to detect the genes related to Ethanol oxidation in isolated strains. Tn5 was introduced from Tn5 vectors into HA-36, GA-32 at the frequency of 1.0x10^-5-5.0x10^-7.

토양으로부터 분리한 Bacteriophage SJ-5의 분자 생물학적 특성

김도경,박경진,이병권,전홍성,박종필,이숙영,김성준 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1993 유전생물공학연구지 Vol.3 No.-

최근 분자생물학 분야에서 중요하게 인식되고 있는 새로운 E. coli의 bacteriophage를 토양으로부터 분리해서 그 물리적인 특성과 핵산을 분석한 결과는 다음과 같다. E. coli 를 숙주균으로 하는 phage를 토양으로부터 분리하여 SJ-5라 명명하였다. SJ-5 phage는 숙주 특이성을 나타내 E. coli에만 감염이 되었다. SJ-5 phage DNA는 전기영동 겔상에서 23 Kb 이상의 single 밴드를 나타내었고, S1 nuclease, Exonuclease Ⅲ, λ -exonuclease에 반응을 하지 않은 결과로 보아 이중나선 환상 DNA로 사료된다. Southern blot hybridization 실험에서, SJ-5 phage DNA는 λ phage DNA와 상동서열이 전혀 없었다. Spheroplast transfection 실험에서는 E. coli, A.aceti, S. kasugaensis KCTC 2113은 SJ-5 phage DNA애 의해 transfection 되었다. The molecular characteristics of the bacteriophage SJ-5 which was isolated from soil were examined. Phage SJ-5 infected easily into E. coli and formed clear and round plagues with halozones. Agarose gel electrophoresis of phage SJ-5 DNA showed a single band at about higher than 23kb. SJ-5 DNA could always be recognized as a double-stranded circular form by the unaffected patterns of S1 nuclease, ExonucleaseⅢ, γ -exonuclease treatment. In Southern hybridization experiments, Phage SJ-5 had no homology with γ phage DNA. From the transfection experiments, E. coli, Acetobacter aceti and Streptomyces kasugaensis KCTC 2113 were transfected by phage SJ-5.

황색 포도상구균의 vancomycin 내성 원인 유전자의 동정

전준연,양영기,송민동 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1991 유전생물공학연구지 Vol.1 No.1

임상 분리되는 Gram 양성균인 황색 포도상구균(Staphyhcoccus aureus)에 대한 각종 학생물질의 최소 발육저지농도 측정(Minimal Inhibitory Concentration: MIC test)과 내성 pattern을 조사하였으며, 이들 균주 중 특히 vancomycin에 대하여 높은 내성을 나타내는 균주(Vancomycin resistant Staphylococcus aureus: VRSA)에 대한 vancomycin 내성원인 유전자의 탐색 및 cloning을 실시하여 vancomycm 내성기구의 연구에 필요한 조사를 수행하였다. Vancomycm에 내성인 균주(VRSA)를 고온(43.5℃) 처리하여 계대 배양을 한 다음, replica plating method에 의 해 vancomycin 감수성 균주(Vancomycin-sensitive Staphylococcus aureus: VSSA)를 얻었으며, VRSA 균수와 VSSA 균주로부터 membrane protein을 준비한 다음 SDS-poly-acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 전기 영동하여 그 단백질 pattern을 비교한 결과, VRSA 균주에서는 분자량(Mr: relative molecular weight)이 약 127Kadl 그리고 30Kdal 정도 되는 부위에서 vancomycin 내성에 관계되는 듯한 특이적인 단백질을 관찰할 수 있었다. 그러나 VSSA 균주에서는 이러한 단백질을 관찰할 수 없었다. 한편 이들 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 다음 agarose gel electrophoresis하여 그 pattern을 분석한 결과, VRSA 균주에서는 약50Kb부위에서 plasmid DNA밴드가 관찰되었으나 VSSA 균주에서는 아무런 밴드도 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 볼때 vancomycin 내성유전자는 plasmid DNA상에 존재한다고 생각되어진다. This study was carried out to study the characterization of the gene that is responsible for the vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) In order to obtain vancomycin-sensitive S. aureus(VSSA)from VRSA stain, vancomycin-resistant S. aureus(VRSA) was subcultured twice at the high temp.(43.5℃)and then VSSA was obtained by replicaplating method after MIC test with vancomycin in high temp. treted VRSA strain. Membrane proteins were prepared from VRSA and VSSA strain and protein patterns of those were compared bny 7.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Only in VRSA strain appeared novel protein bands at a position about 120 Kdal, 80 Kdal and 30Kda1, but it did not appear in VSSA strain. The patterns of plasmid DNA in VRSA and VSSA strain were clearly classified. Plasmid DNA band in VSSA strain appeared at a position about 50Kb, but it did not appear any band in VSSA strain. These results suggested that plasmid DNA may be encode the gene that is responsible for vancomycin-resistance.

형광성 Pseudomonas에서 Siderophore 생합성 유전자 탐색

김현희,고한철,여명구,김호상,서영우,박열 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1993 유전생물공학연구지 Vol.3 No.-

Kanamycin-sensitive Pseudomonads을 Tn5를 이용한 돌연변이 유도를 실시하여 kanamycin에 내성을 갖는 transconjugants를 선별하였고, siderophore 생합성하지 못하는 돌연변이체를 선별하기 위하여 MKB 평판배지에서 황색 hallow를 형성하지 못하는 colony를 선별하였다. 선발된 돌연변이체들의 genomic DNA애 Tn5가 삽입되었음을 확인하기 위하여 Southen blot hybridiz-ation을 실시하여 intact Tn5에 homology를 나타내는 밴드를 확인하였다. 각각의 변이주에서 밴드의 위치가 서로 다르게 관찰됨으로써 Tn5가siderophore 생합성 유전자에 무작위적으로 삽입되었음을 알 수 있었다. Gene library를 제조하기 위하여 wild typePY002의 genomic DNA를 Sau3A Ⅰ로 부분 절단하여 15-30kb 절편을 cosmid pLAFRS3에 접합하여 in vitro packaging 한 후 E. coli HB101얘 형질도입하여 P. fluorescens PY002의 genomic library를 재조하였으며, 이 library의 평균삽입 DNA 크기는 21kb였다. Pseudomonas fluorescens PY002, isolated from soil, was mutagenized with a transposon Tn5. The transposon Tn5 was randomly transposed into the chromosomal DNA of P. fluorescens PY002, as judged by Southem blot analysis with Dig-dUTP-labelled pSUP5011 (pBR325::Tn5) as probe. To construct a gene library from P. fluorescens PY002, the Sau3AI partial digested chromosomal DNA fragments of 15-30kb in sizes were ligated with BamHI-restricted cosmid vector pLAFR3. After the in vitro packaging, the resulting phages were transfected into E. coli HB101 and plated onto LBagar plate containing tetracyclin (12.5 ㎍/ml). The average sizes of insert DNA contained in the constructed gene library were approximately 21 kb in size range and the transduction number per 1 ㎍ of insert DNA was 9 x 10^3.

E. coli의 유전자 발현 및 플라스미드 DNA 구조의 특성에 관한 연구

김성준,박열,이숙영,김홍섭,김우갑 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1991 유전생물공학연구지 Vol.1 No.1

Characterization and electron microscopic visualization of the plasmid and the gene expression of Escherichia coli were carried out. Transcriptional units of active structural genes were observed after lysis of Escherichia coli cells. The ribosomes attached to the E. coli genome on mRNA molecule as polyribosomes. From this gradient of polyribosome length, we estimated location of mRNA synthesis initiation site. In this experiment, a granule is ofen present which may correspond to a RNA polymerase at the promoter site. pOX1, pOX7, pOX7A, pOX7Δ1, pSTP36, pSTP21, pBR322, and pJH12 were visualized by way of electron microscope, and their estimated sizes were determined to be 5.70±0.08 ㎛, 2.25±0.06 ㎛, 2.15±0.10 ㎛, 2.14±0.12 ㎛, 7.39±0.08 ㎛, 4.03±0.04 ㎛, 1.50±0.03 ㎛ and 1.25±0.09 ㎛ respectively. One micrometer of measured length corresponded to about 3.0 Kb. Mica-press adsorption method that allows selectivs visualization of the plasmid DNA released in situ from the bacterial cell is rapid and useful for visualization of plasmids. The released plasmid DNA was adsorbed preferently on mica in a divalent cation-free solution. Miller chromatin-spreading method was useful to observe the plasmid and transcripts. BAC method and cytochrome C monolayer were useful to observe the plasmid DNA. Our ability to visualize ultrastructural aspects of the expression of E. coli has given us a unique tool with which to study the regulation the level of an individual gene.

토양으로부터 分離한 Bacteriophage의 특성

박현균,김도경,박경진,전홍성,박종필,김종승,김성준 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1992 유전생물공학연구지 Vol.2 No.-

환경 미생물 분야와 산업미생물 분야 및 분자생물학 분야에서 주목을 받고 있고, 많은 연구가 된 새로운 E. coli의 bacteriophage를 토양으로 부터 분리해서, 그 물리적인 특성과 핵산을 밝혀내, phage상호간의 관련성을 검토하여 보았다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 토양으로 부터 분리한 phage는 숙주균에 따라 SJ-1, SJ-2, SJ-3, SJ-4, SJ-5, SJ-6, SJ-7이라 명명하였다. SJ phage들은 높은 숙주특이성을 나타내 phage SJ-2, SJ一7은 단일종 숙주균에만 감염이 되었고, SJ-1, SJ-3, SJ-4, SJ-5, SJ-6은 다중독성을 나타내었다. 2. 7종류의 SJ-phage는 본 실험조건하에서는 모두 virulent phage임이 밝혀졌다. 모든 용균반의 형태는 중앙이 투명한 둥근 모양이었으며 주변에 무리가 있는 것과 없는것 두가지 형태를 나타냈다. 용균반의 크기는 1-5mm이었으며, SJ-5phage의 용균반이 5mm로서 가장 컸고 SJ-7 phage가 가장 적었다. 숙주균은 OD_600 0.3-0.5상태에서 가장 감염되기가 좋았다. 그리고 상층배지의 한천 농도와 양은 0.5%와 3ml이 가장 좋은 조건이었다. 3. 일단 증식 실험의 결과를 보면 SJ-phage는 잠복기가 15-50분이었고 평균 phage방출수는 190-250이었다. SJ-6과 SJ-7이 잠복기가 15분으로 가장 짧았고 SJ-4가 50분으로 가장 길었다. 평균 방출수는 SJ-3과 SJ-5가 250정도로 많았으며 SJ-1과 SJ-2는 약 190정도였다. 4. SJ-phage는 PD buffer에서 안정하였고, magnesium ion 5×10^-3M의 첨가는 phage에게 큰 안정성을 주었다. SJ-phage는 pH6과 pH9사이에서 안정하였으며 그 pH는 숙주균의 최적 pH였다. SJ-phage의 온도 불활성화는 40 ℃이상에서 불활성화되기 시작하여 60 ℃이상에서는 완전히 불활성화 되었다. 자외선 조사에 의한 불활성화에서 SJ-phage는 120초 이후에 완전히 불활성화 되었다. All phages used in this experiment were isolated from soil of the surburbs of Chun-Nam, and they designated as phage SJ-1, SJ-2, SJ-3, SJ-4, SJ-5, SJ-6, SJ-7. The hosts were JM105, JM109, K802, LE392, MC1000, MV1184 and PSM CC, respectively. These phages were virulent under the experimental conditions. They produced plaques with dear and round without halo. The size of plaques was 1-5mm in diameter. SJ-phages were stable in 5×10^-3M Mg^2+. Thermostability experiments indicated that SJ-phages were stable at 37℃. Optimal pH of the phages were 6-9. Exposure of the phages to U.V. for 120 seconds resulted in complete inactivation. In one-step growth experiments, the latent period at 37 ℃ was about 15-50 min and the average burst see was 190-250. Agarose gel electrophoresis of the phage DNA showed single band of high molecular weight from SJ-1 to SJ-7 phages

핵전달법에 의한 Aspergillus 속과 Penicillium 속의 잡종형성에 관하여

임채영,양영기 조선대학교 부설 유전생물공학연구소 1992 유전생물공학연구지 Vol.2 No.-

Intergeneric hybrids between A. phoenicis KCTC 1228 and P. verruculosum F-3, hypercellulolytic enzyme-producing fungi, were obtained by nuclear transfer technique. Nuclei isolated from wild type and auxotrophic mutant strains of P. verruculosum F-3 were transferred into the protoplasts of different auxotrophic mutant as a recipient strain of A. phoenicis. Conidiospores of A. phenicis and P. verruculosum were mutagenized with U. V. and NTG. Various auxotrophic and cellulase mutants were isolated. Optimal conditions for intergeneric hybrids using conidial protoplasts of two strains invesgated. Maximun production of conidial protoplasts were obtained by preincubation of conidiospores on liquid minimal medium supplemented with 2-Deoxy-D-Glucose (25㎍/ml) for 10-13 hrs. and by reaction with 0.1% Novozym 234 at 30 ℃ for hrs. The most effective concentration of osmotic stabilizers for the isolation of protoplasts was 0.6M KCl. requency of intergeneric hybrid formation by nuclear transfer was 1 x 10^-5 ~ 3 x 10^-5. In contrast, hybrid was not isolated by protoplast fusion between two different genus. From the result of observations of genetic stability, measurement of DNA content, and cocidial size, it was confirmed that nuclear transfer occurred in the transformants. Their karyotypes were aneuploid and 3 taransformed strains showed high genetic stability at continuous subculture. Three strains selected for cellulase activity revealed aboutl.4-2.2 folds higher than the wild or parental strains. It was strongly supported by results of this study that nuclear transfer technique is much more efficient in the formation of intergeneric hybrids than protoplast fusion and is very useful for the improvement of strains.