Inactivation of Escherichia coli O157:H7 on radish seeds by applying chlorine dioxide and dry heat treatment

김해영 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

새싹채소는 생식하는 식품이므로 식중독균과 같은 위해 요소로부터 미생물학적 안전성을 확보하는 것이 무엇보다도 중요하다. 이 연구는 대표적 살균소독제인 이산화염소와 건열 처리의 조합인 허들 테크놀로지를 이용하여 발아율에 영향을 미치지 않으면서 무순 종자에 존재하는 E. coli O157:H7을 완전하게 사멸시키기 위한 살균기술 개발에 목적을 두고 있다. 우선적으로 살균소독제와 건조환경의 조합이 E. coli O157:H7을 저감화하는데 상승 효과가 있는지를 살펴보기 위하여, 차아염소산칼슘, 이산화염소, 또는 멸균증류수로 E. coli O157:H7이 접종된 무순 종자를 세척한 후 24시간에 걸쳐 건조를 실시하였다. 그 결과 200 ppm의 이산화염소로 세척 후 25±1℃에서 24시간 건조시킨 무순 종자에서 E. coli O157:H7을 비롯한 일반세균과 곰팡이/효모의 개체수가 초기 균수와 비교하여 대략 2 log CFU/g씩 감소되는 효과를 보였고, 무순 종자의 발아율은 94.3% 이상 유지됨을 확인하였다. 그러나 이산화염소와 건조 환경의 조합처리가 무순 종자에 오염된 E. coli O157:H7을 완전하게 사멸시키지 못하므로 이를 해결하기 위하여 이산화염소의 농도를 500 ppm으로 증가시키고, 상대습도(23%)와 더불어 온도 (55, 60, 70℃)를 허들 스트레스로 추가하였다. 이산화염소 (500 ppm, 5분) 처리를 한 후 60℃와 상대습도 23%에 48시간 종자를 노출시키면 E. coli O157:H7은 종자와 후에 발아된 새싹채소에서 모두 완전하게 사멸됨을 확인 할 수 있었다. 하지만 멸균 새싹 종자의 발아율이 57.3-77.0%로 낮아지는 문제점을 관찰할 수 있었다. 고온에서의 건열 처리에 의한 종자의 손상을 최소화 시키고자 45℃에서 24시간 건조하여 종자의 수분활성도를 0.3 이하로 조절하고 이후 60, 65, 70℃에서 건열 처리를 실시하면 종자의 손상을 막아 발아율을 86%까지 상승시킬 수 있었다. 그 결과 500 ppm의 이산화염소로 E. coli O157:H7이 106 CFU/g으로 접종된 무순 종자를 5분간 세척한 후 45℃와 23% 상대습도 조건에서 24시간 처리하고, 최종적으로 70℃와 23% 상대습도 조건에서 48시간 처리하면 무순 종자의 발아율을 85%이상 유지하면서 접종된 E. coli O157:H7을 완전하게 사멸 시킬 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 무순 종자에 접종된 E. coli O157:H7를 완전하게 사멸시킨 이산화염소 (500ppm, 5분) 세척과 건열 (70℃, 23% 상대습도)의 조합 처리는 향후 다양한 새싹 종자에서 식중독균을 완전하게 사멸시키기 위한 연구에 중요한 자료로 활용될 것이다.

Imaging and characterization of LRP-APP interaction with adaptor proteins involved in APP processing

권오연 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내박사

Amyloid precursor protein (APP) which genetically linked to Alzheimer disease interacts with the low density lipoprotein receptor-related protein (LRP), a multifunctional endocytic cell surface receptor. I used fluorescence resonance energy transfer (FRET) between labeled LRP and APP to examine the subcellular location of interactions and the molecular domains involved in the LRP-APP interaction. FRET between LRP and APP770 can be detected in cells and this interaction was sensitive to the LRP inhibitor receptor-associated protein (RAP), suggesting the specific interaction between the extracellular domains of APP770 and LRP. APP695 also interacts with LRP to lesser degree and this ectodomain interaction is not altered by RAP. APP770 binds to both ligand binding domain II and IV of LRP. These findings demonstrate that LRP interaction with APP occurs via both extracellular and intracellular protein interaction domains. The cytoplasmic tail of APP possesses the NPXY motif to which several phosphotyrosine-binding (PTB) domain containing proteins bind, including FE65 and Dab1. I hypothesized that Fe65 and Dab1 may compete for binding to APP. I examined the effect of Dab1 on nuclear translocation of Fe65 in COS7 cells expressing Fe65 and APP. Fe65 was no longer located in the nucleus in double transfections of APP and Fe65. However, Fe65 was unable to interact with APP by co-expressed Dab1, thus Fe65 is localized in the nucleus in APP/Fe65/Dab1 triple transfected cells. Co-immunoprecipitation experiments in HEK293 cells demonstrated that Dab1 decreased the amount of Fe65 bound to APP. The overlapping of APP cytoplasmic domain involved in the binding of Fe65 and Dab1 suggests the existence of competitive mechanisms regulating the binding of various ligands to this cytoplasmic domain of APP. Surprisingly, I found that Fe65 interacts with Dab1 via C-terminal region of Dab1 and unphosphorylated Dab1 is capable of binding Fe65. Dab1 is another adaptor protein that interacts with APP as well as with LRP. Dab1 also significantly decreased the interaction of LRP and APP, and APP processing. These effects depended on the phosphotyrosine binding domain of Dab1. Understanding the competing binding of intracellular adaptor proteins will be vital in describing the regulation of transmembrane proteins like LRP and APP. APP (amyloid precursor protein)는 유전적으로 알츠하이머 질병과 연관되어 있으며, 다기능적 세포 표면 수용체인 LRP (the low density lipoprotein receptor-related protein)와 상호작용을 한다. 우리는 LRP와 APP를 각기 다른 형광단백질로 붙인 다음 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 방법을 이용하여 세포 내 위치 및 LRP와 APP의 상호작용에 관여하는 도메인을 조사하였다. 세포 내에서 LRP와 APP770 사이의 FRET이 검출 되었으며, 이 상호작용은 LRP의 억제자인 RAP (receptor-associated protein)에 민감하게 반응한다. 이것은 LRP와 APP770의 extracellular 도메인 사이에서 상호작용이 일어난다는 것을 제시한다. APP695 또한 약하게 LRP와 상호작용을 하며, 이 상호작용은 RAP에 의해 영향을 받지 않는다. APP770의 경우 LRP의 리간드 바인딩 도메인 2번과 4번에 결합을 한다. 이 결과들은 LRP와 APP의 상호작용은 extracellular와 intracellular interaction 도메인 양쪽 둘 다를 통해서 일어난다는 것을 증명한다. APP의 cytoplasmic tail에는 NPXY motif를 가지고 있으며, 이 부분을 통해 Fe65와 Dab1을 포함한 PTB (phosphotyrosine-binding) 도메인을 가진 단백질들과 결합한다. 우리는 Fe65와 Dab1이 APP에 경쟁적으로 결합할지도 모른다는 가정을 하고 Fe65와 APP가 발현되는 COS7 세포에서 Fe65의 핵으로의 이동에 Dab1이 미치는 영향을 조사하였다. APP와 Fe65가 트랜스펙션된 세포에서 Fe65는 더 이상 핵 안으로 이동하지 않았다. 그러나 Dab1의 동시 발현에 의해 APP와 결합하지 못한 Fe65는 핵 안으로 이동하였다. HEK293 세포의 면역침전 실험에서도 Dab1은 APP에 결합하는 Fe65의 양을 감소시키는 것으로 증명되었다. Fe65와 Dab1 결합하는데 관여하는 APP cytoplasmic 도메인이 중복되는 것은 다양한 리간드가 APP에 결합하는 것을 조절하는 경쟁적 메커니즘이 존재한다는 것을 제시한다. 놀랍게도 우리는 Fe65가 Dab1의 c-terminal 부분을 통해서 서로 결합한다는 것과 Dab1의 인산화 과정 없이 Fe65와 결합할 수 있다는 것을 발견하였다. Dab1은 LRP 뿐만 아니라 APP와 결합하는 adaptor 단백질이며, 흥미롭게도 LRP와 APP의 상호작용 및 APP processing을 감소시키고, 이 영향들은 Dab1의 PTB 도메인에 의존한다는 것을 확인하였다. Intracellular adaptor 단백질들의 경쟁적 결합에 대한 이해는 LRP와 APP 같은 transmembrane 단백질의 조절기작을 설명하는데 매우 중요할 것이다.

Selective inhibitory actions of pectin-like polysaccharides derived from medicinal plants on bacterial pathogen-host cell interactions

이지혜 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내박사

Bacterial adhesion to host cells is an important initial step in bacterial infection, which may be a promising target for an alternative anti-adhesive approach to antibiotics therapy. To examine the inhibitory effects of carbohydrates on bacterial adhesion to host cells and to understand the anti-adhesive mechanism, acidic polysaccharides from medicinal plants including Artemisia capillaris (AC), Camellia sinensis (CS), and Panax ginseng (PG), were purified, characterized and assayed for their inhibition functions as carbohydrate receptor analogs. These acidic polysaccharides (AC-F2, CS-F2, PG-F2, and PG-HMW) may be pectin-like arabinogalacturonan-type polysaccharides. They consist of galacturonic and glucuronic acids, with a molecular weight of 10 - 80 kDa, along with rhamnose, arabinose, glucose, and galactose as minor components. Inhibition assays were performed on anti-adhesive activities against Helicobacter pylori, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Propionibacterium acnes, and Staphylococcus aureus. PG-F2, PG-HMW, and CS-F2 showed marked anti-adhesive activities using erythrocytes and host cell lines with minimum inhibitory concentrations (MICs) of 10 - 1000 ㎍/mL and IC50 values of 1.0 - 3.2 mg/mL. PG-F2 and PG-HMW demonstrated high and broad spectrum of anti-adhesive activities against gastric, oral, and skin pathogens, whereas the inhibition by AC-F2 was limited to H. pylori adhesion. Notably, the CS-F2 showed higher activity than that of PG-F2 and AS-F2 against H. pylori, P. acnes, and S. aureus. Due to the low yield of CS-F2, however, green tea extract (CSI-4) was utilized, which was found to be composed of a major proportion of carbohydrates containing 40% uronic acids. It showed strong inhibitory activities on the adhesions of pathogens, H. pylori, P. acnes and S. aureus, to erythrocytes (MICs of 10 - 500 ㎍/mL) and cell lines (IC50 values of 140 - 2300 ㎍/mL). While the complete hydrolysis of PG acidic polysaccharides via enzymatic digestion resulted in the loss of the anti-adhesive activities, limited hydrolysis yielded hydrolysates with activities comparable to those of the precursor acidic polysaccharides. Importantly, these oligo- and polysaccharides were shown to exert no inhibitory effects against beneficial or commensal bacteria such as Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Escherichia coli, or Staphylococcus epidermidis, demonstrating their selective anti-adhesive effects on pathogenic bacteria. The active acidic polysaccharides (AC-F2, CS-F2, PG-F2, and PG-HMW) and the CS extract (CSI-4) can be developed as potent inhibitors to protect hosts against infection by pathogenic bacteria. 병원성 박테리아에 의한 인체 감염은 박테리아와 인체 세포 표면의 당과의 부착으로 시작되는 상호작용이다. 그 동안 병원성 박테리아 감염 치료에 사용되어 온 항생제는 유해균 및 유익균의 인체 내 균형을 깨뜨리고, 항생제 내성 박테리아 출현 및 여러 가지 부작용을 일으킬 수 있어서 자연친화적이고 안전한 항생제 대체 물질 개발이 절실하다. 본 연구에서는 박테리아의 인체 세포 표면 부착을 초기에 차단하기 위하여 세포 표면의 당과 구조적으로 유사한 천연식물 소재의 당을 이용하였다. 즉, 인삼 뿌리 및 쑥, 녹차 잎에서 산성 다당류를 분리·정제하여 그 특성을 분석하고, Helicobacter pylori, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus 등의 병원균 및 Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus epidermidis 등의 유익균의 인체 및 동물세포 부착 저해 활성을 측정하여 항생제 대체물질로의 가능성을 탐색해 보았다. 인삼 뿌리 및 쑥과 녹차 잎에서 분리 정제한 PG-F2와 PG-HMW, AC-F2, CS-F2는 펙틴과 유사한 구조로, uronic acid를 다량 함유하면서, rhamnose, arabinose, galactose, glucose 및 미량의 fucose, xylose 등을 포함하는 10 - 80 kDa 가량의 산성 다당으로 분석되었다. 인삼의 산성 다당인 PG-F2와 PG-HMW 및 녹차의 산성 다당 CS-F2는 최소저해농도 10 - 1000 ㎛/mL에서 적혈구 응집을 저해하였고, 1.0 - 3.2 mg/mL 농도에서 인체 및 동물세포에 대한 병원체 부착을 50% 저해하여, 마이크로몰 농도 수준에서 높은 항부착 활성을 보였다. CS-F2는 H. pylori, P. acnes, S. aureus에 가장 높은 활성을 보였고, 정제 단계를 조절한 녹차 추출물 CSI-4의 경우에도, CS-F2와 유사한 높은 활성을 보여서 산업적인 응용이 기대된다. PG-F2와 PG-HMW는 위, 구강, 피부 병원균에 대해서 폭넓은 저해활성을 보인 반면에 쑥에서 분리 정제한 다당 AC-F2는 상대적으로 낮은 활성을 보였다. 인삼 다당의 부분적인 효소 가수분해 후에 분리 정제한 인삼 올리고당은 최소저해농도 10 ㎛/mL에서 적혈구응집을 저해하였다. 이들 다당 및 올리고당과 추출물은 인체 유익균에는 영향을 미치지 않는 선택적인 항부착 활성을 보였다. 우리나라에서 자생하는 천연식물에서 병원균의 인체세포 부착을 저해하는 펙틴 유사 구조의 당 소재를 분리 정제하였으며, 이들 당 소재는 인체 내 유익균에는 영향을 미치지 않으면서, 병원균의 인체세포 부착만을 선택적으로 저해하는 활성을 갖고 있어서, 항생제 대체 소재로서의 가능성을 보였다.

Preparation and characterization of starch based nano-particles

김종예 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내박사

전분을 이용한 나노 입자의 제조 공정을 개발 및 최적화 하기 위하여 분쇄와 재건축 접근 방식을 이용하여 나노 입자를 제조하였다. 분쇄방식의 경우 전분 입자 내에 존재하는 나노 수준의 단위체를 효소 가수분해를 이용하여 분리하였다. 재건축 방식의 경우 아밀로즈의 복합체 형성 특성을 이용하여 나노 입자를 제조하였다. 알파아밀라제 효소를 사용하여 찹쌀 전분을 가수분해 하여 나노 입자를 제조하였다. 시차열량주사계 분석에서 나타난 바와 같이 3시간 가수분해 후 전분입자의 용융 엔탈피는 증가하였고 이러한 현상은 전분 입자의 무정형 영역이 선택적으로 제거된 것을 의미한다. 이후 (6~24시간) 가수분해 속도는 감속하였고 결정의 용융 엔탈피가 감소한 것을 미루어 보아 결정영역 또한 점차 분해되었다. X선 회절 결과는 시차열량주사계 분석결과와 같은 경향을 보였다. 초기 가수분해 (3 시간) 후 부피 및 입자 수에 기초한 전분 입자의 평균 직경은 극적으로 감소하였다 (5.94 → 1.64 μm, 그리고 0.45 → 0.18 μm). 5.6 μm 크기의 찹쌀 전분 입자 분포는 3시간 가수분해 후 0.5와 3.6 μm 크기의 입자 분포를 보였다. 0.5 μm 의 전분 입자 파편들은 결정성 blocklet이라고 사료된다. 과도한 가수분해 (24 시간) 혹은 초음파는 전분 입자를 팽윤시키거나 뭉치게 하여 전분의 입자 크기의 증가시킨다. 고아밀로즈 전분을 DMSO용액에 녹인 후 여과막 (10 μm, 직경 47 mm) 을 통하여 부탄올 층으로 천천히 이동시켜 복합체를 형성시켰다. X선 회절 분석 결과 (d-spacings 0.657 와 0.446 nm) V6I 형의 전분-부탄올 복합체가 형성되었다. 평균 분자량 0.269 MDa 의 아밀로즈 가 주로 복합체를 형성하였다. 알파아밀라제를 이용하여 복합체의 무정형한 영역을 가수분해하여 크기가 10~20 nm인 V6I형의 결정성 입자를 분리하였다. 이 결정성 입자 내에 존재하는 전분의 평균 사슬 길이는 DP9이며 이러한 결과는 나노 입자가 1.5회 꼬여진 나선형 복합체의 집합으로 구성되어 있는 것을 보여준다. 아밀로즈의 복합체 형성 기작을 이용한 나노 입자의 수율을 증가시키기 위하여 고아밀로즈 전분을 산성 알코올 용액상에서 가수분해하여 여러 가지 분자량의 전분 덱스트린을 제조하였다. 덱스트린들을 DMSO용액에 녹인 후 70°C에서 6일 동안 여과막 (10 μm, 직경 47 mm) 을 통하여 부탄올 층으로 천천히 이동시켜 복합체를 형성시켰다. X선 회절 분석 결과 (d-spacings 1.123, 0.657 와 0.429 nm) V6I 형의 복합체가 형성되었다. 적절한 덱스트리화에 의하여 복합체 형성 수율이 대략 네 배 (7→28 %) 가량 증가하였다. 100 nm이하의 입자들과 무정형한 영역이 혼재되어 있는 형상이 DP_(n) 311과 142 복합체에서 관찰되었다. 반면 DP_(n) 39의 복합체는 다른 형태를 보였다. 가수분해 효소를 이용하여 DP_(n) 311 복합체의 무정형 영역을 선택적으로 가수분해하여 크기가 23~72 nm인 V6I형 (d-spacings 1.126, 0.655 와 0.428 nm) 의 입자들을 분리하였다. 그러나 DP_(n) 142과 39의 복합체는 가수분해에 의하여 녹아 입자들끼리 붙어서 커다란 집합체를 형성하였다. To optimize the preparation procedure of starch based nano-particles, the nano-particles were prepared using “top-down” and “bottom up” approach. In “top-down” approach, nano particles inherently existed in starch granules were isolated by enzymatic hydrolysis. In “bottom up” approach, the nano-scale starch particles were prepared using self assembling property of amylose chain. Nano starch particles were prepared by hydrolyzing waxy rice starch using α-amylase. Differential scanning calorimetry (DSC) revealed that a mild hydrolysis for 3 h increased the melting enthalpy of the starch, which might indicate that the hydrolysis was selectively in the amorphous regions. Later, at 6 ~ 24 h, the hydrolysis rate was reduced, with gradual decreases in DSC melting enthalpy, indicating that the crystalline regions were eroded simultaneously. X-ray diffraction patterns revealed the same trend as the DSC results. The average diameter of starch granules or particles was decreased dramatically in both volume- and number-based measurements (5.94 to 1.64 μm, and 0.45 to 0.18 μm, respectively) during early stage of rapid hydrolysis (up to 3 h). Native waxy rice starch exhibited a particle size distribution with a major peak at 5.6 μm. After the hydrolysis for 3 h, the volume distribution of starch granules was changed to two major size peaks at 0.5 and 3.6 μm. The starch fragment of 0.5 μm was assumed to be crystalline blocklets. With excessive hydrolysis (24 h) or ultrasonication, however, the diameter of starch particles was increased, indicating that the particles might be swollen or aggregated into clusters. Nano-particles were prepared using “bottom-up” approach. High amylose corn starch was dissolved in an aqueous dimethyl sulfoxide solution and allowed to form complexes by migrating gravimetrically into n-butanol layer through a membrane filter (10 μm pore size, 47 mm diameter) at 70℃. The starch-butanol complex yielded V6I-type crystals with broad reflections at d-spacings of 0.657 and 0.446 nm under an X-ray diffractogram. The amylose, the average Mw of 0.269 MDa as determined by size-exclusion column chromatography, mostly contributed to complex formation. Platelets of an average length less than 100 nm, interspersed in amorphous matrices, were observed in the crude complex. By hydrolyzing the crude complex with α-amylase, amorphous matrices were removed and starch crystallites of 10-20 nm, showing a V6I X-ray diffraction pattern at d-spacings 1.187, 0.685, 0.448 and 0.394 nm, were obtained. The average chain length of starch residing in the crystalline complex was DP 9, indicating that single crystallite units consisted of approximately 1.5 helical turn of anhydroglucose chains. To increase yield of preparing nano-particles using self assembly property of amylose chains, starch dextrins with various molecular weights were prepared by hydrolyzing a high amylose (70%) maize starch in an acidic alcohol solution. Dextrins were then dissolved in an aqueous dimethyl sulfoxide solution (90%) and allowed to form complexes by migrating gravimetrically into an n-butanol layer through a membrane filter (10 μm pore size, 47 mm diameter) during a storage at 70 ℃ for 6 days. The dextrin-butanol complex yielded V6I-type crystals with broad reflections at d-spacings of 1.123, 0.657 and 0.429 nm under an X-ray diffractogram. By proper dextrinization of starch, the yield of the nano-particles was increased approximately four times (7→28 %). Platelets of an average length less than 100 nm, interspersed in amorphous matrices, were observed in the complexes of DP_(n) 311 and 142; that of DP_(n) 39 showed different morphology and the formation of complexes was limited. By hydrolyzing the complex of DP_(n) 311 with an α-amylase, amorphous matrices were removed, and crystallites of 23~72 nm, showing a V6-I X-ray diffraction pattern at d-spacings 1.126, 0.655 and 0.428 nm, were obtained. However, crystallites in complexes of DP_(n) 142 and 39 were eroded by the amylolysis, forming large aggregates.

Colorimetric pH measurement of cell culture media

문수진 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

The monitoring of pH level in cell culture media is vital for bioprocess engineering and tissue engineering since cell behavior is highly sensitive to the surrounding microenvironments. Taking tissue engineering as an example, pH level is one of the key parameters that need to be constantly monitored during cell culture. The colorimetric pH measurement of cell culture media using absorbance at 570 and 630 nm was investigated. Suspension cell type and adhesion cell type were determined. The 99% reliability with suspension cell type was shown. In case of Vero cell and RAW264.7 cell, which is adhesion cell type, RAW264.7 of relatively small cell size and circular shape like suspension cell shape can be reliability but Vero cell cannot. Adhesion cell might be inconsistent because of the diffusion of light when measuring the absorbance. It can be appropriate as suspension cell type and also as a commercial application of suspension cell.

Entrapment of nucleic acids in opsonized erythrocyte ghosts for macrophage targeting

김상희 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

Gene therapy as nucleic acids is one of the powerful therapeutic tools. Delivery of nucleic acids into cell remains the major obstacle to its biological activity. To overcome this problem, proper vehicle systems are required. In this study, erythrocyte ghosts (EG) were tested as biocompatible delivery systems. For in vitro macrophage targeting, the EG was opsonized with antibody that is anti-RBC IgG. In hypotonic condition, the nucleic acids were condensed by polyethyleneimine (PEI) which was encapsulated into EG. To confirm the presence of nucleic acids in EG, fluorescein isothiocyanate (FITC) was labeled to nucleic acids for direct observation and quantification. To confirm the macrophages (J774, RAW 264.7) could engulf the opsonized EGs containing pCEV/GFP and FITC labeled AS-ODN. The opsonized EGs treated cells observed by microscope. The opsonized EGs attached cell membranes after washed with PBS. These results indicate the opsonized EG could induce phagocytosis of macrophages. 핵산 분자를 이용한 유전자 치료는 질병을 치료하기 위한 강력한 수단 중 하나이다. 그러나 핵산 분자는 음전하를 띄고 있어 세포 내로 전달이 어렵고, 생체내 짧은 안정성이 문제가 되어왔다. 이러한 문제를 개선 하기 위해서 발전된 전달 체가 필요하다. 이번 연구에서 적혈구 세포를 이용하여 생체 적합 형 전달 체를 개발 하였다. 저장액 상태에서 핵산 분자를 폴리에틸렌이민으로 압축 한 뒤, 적혈구내에 봉입 하였다. 봉인된 핵산 분자를 확인하기 위해야 형광 물질이 붙은 핵산 분자를 이용하여, 현미경을 통해 관찰 하거나, 형광정량기기를 통해 정량적으로 정량 및, 효소면역흡착 정량 법을 이용하여, 다시 한번 정량적으로 확인 하였다. 또한, 대식세포를 표적으로 하기 위하여 항 적혈구 항체인 IgG를 이용 하여 적혈구 주변을 둘러싸는 과정을 도입하였다. 이러한 과정을 옵소닌화라 한다. 대식세포에 옵소닌화 된 적혈구가 대식되는 현상이 일어나는지 확인하기 위해, 형광물질이 붙은 antisense-oligonucleotide 및 형광물질을 발현하는 plasmid를 이용하여, 대식세포에 처리하였다. 그 결과, 옵소닌화된 적혈구가 대식세포에 부착되는 것을 확인하고, 플라스미드를 가진 옵소닌화된 적혈구가 대식세포 내로 들어가 형광을 발하는 것을 확인하였다. 이 결과로 보아 옵소닌화된 적혈구의 대식세포로의 표적화가 가능해졌다.

(A)receptor for complement component C1q, gC1qR, is critical for growth factor-induced cellular responses.

박찬웅 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

Tumor specificity and therapeutic efficacy of chitosan based nano-formulations in photodynamic therapy

이소진 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

Nanoscale drug carriers, chitosan-based nanoparticles (CNPs) and drug conjugated polymer (glycol chitosan) can be used for photodynamic therapy. These carriers could encapsulate or conjugate a photosensitizer, protophorphyrin IX (PpIX), and deliver it to tumor tissue. In aqueous system, these formed nanoparticles. CNPs presented the enhanced tumor target specificity in cancer therapy and imbibed various water insoluble anticancer agents into the hydrophobic multicores of nanoscale particles. PpIX conjugated glycol chitosan (GC- PpIX) have specificity and high therapeutic efficacy due to the EPR effect or on-off system of PDT according to shape of nanoparticles in tumor tissues. In a cell culture system, cellular uptake of the PpIX-CNPs or PpIX-GC became highly phototoxic upon visible irradiation. In SCC7 tumor-bearing mice, PpIX-CNP or GC- PpIX exhibited enhanced tumor specificity and increased therapeutic efficacy compared to free PpIX. 광감작제를 암에 특이적으로 전달하여 암치료의 효율을 높이고자 키토산 나노입자를 이용한 광역동 치료를 연구 하였다. 키토산 나노입자는 친수성의 글라이콜 키토산에 소수성의 담즙산 (cholanic acid)을 화학적으로 결합시켜 수용액 상에서 자기 응집형 나노입자를 제조하였다. 암조직이 갖는 신생혈관은 혈관상피세포간의 간극이 느슨하고 림프조직이 덜 형성되어 혈관벽을 투과하여 키토산 나노입자가 암에 축적되게 된다. 소수성을 띄는 광 감작제 protoporpyrin IX (PpIX) 는 키토산 나노입자(CNPs)의 소수성 중심 부분에 물리적 상호작용에 의하여 봉입시켰다(PpIX-CNPs). 이 나노입자는 약 290nm 크기의 동그란 모양을 가졌으며 수용액 상태에서 매우 안정적이다. 키토산 나노입자로부터 PpIX는 서서히 방출되었고, 633nm 의 레이저를 조사해주면 단일항 산소를 발생시켰다. 이에, 직접 세포에 나노입자를 처리하였더니 세포질에 많이 이입되는 것을 관찰하였고 레이저를 조사하여 세포사멸을 관찰하였다. 암을 이식한 마우스에 PpIX와 PpIX-CNPs 를 주입하여 시간에 따라 암에 축적이 되는지 실시간 분자영상 장비를 통해 확인한 결과, PpIX보다 PpIX-CNPs 가 암 축적률과 치료효과가 훨씬 더 뛰어났다. 광감작제의 암전달 효율을 높이고자 글라이콜 키토산에 PpIX를결합시켜(PpIX-GC) 암 조직 전달용 나노입자를 제조하였다. 수용액 상태에서는 나노입자가 형광 (PpIX자체형광)이 나오지 않았고 레이저를 조사해도 단일항 산소 또한 나오지 않았다. 이것은 PpIX끼리 강하게 소수성결합을 하고 있기 때문에 형광과 단일항 산소가 소멸되는 효과라고 예상된다. 여기에 계면활성제인 SDS를 넣어주면 나노입자가 풀리면서 형광이 복원되고 레이저를 조사해주면 단일항 산소도 발생한다. 세포에 PpIX-GC를 처리하고 레이저를 조사하였더니 세포사멸을 관찰할 수 있었다. 암을 이식한 마우스에 PpIX와 PpIX-CNPs, PpIX-GC 를 주입하여 시간별로 관찰한 결과 암조직에 도달하기도 전에 혈관내에PpIX가 방출될 수 있는 PpIX-CNPs보다 결합되어 있는 PpIX-GC가 암 축적률과 치료효과가 훨씬 더 뛰어났다. 이를 통해 기존의 광감작제 보다 나노입자 CNPs 와 GC 를 이용한 광역동치료에 더 효과적임을 증명하였다.

Analysis of Proteome and Retinol Pathway in Hepatic Stellate Cells under High Glucose

김판겸 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내박사

Hepatic stellate cells (HSCs) are a major storage site for retinoids, containing more than 80% of vitamin A in the entire body. They are found between parenchymal cells and sinusoidal endothelial cells of the hepatic lobule. Under pathological conditions such as liver fibrosis, HSCs abrogate their original retinoid processing function and adopt an abnormal morphology. Although many studies have been conducted regarding the biological mechanisms in response to liver injury, few attempts have far focused on the proteome of HSCs under diabetic conditions, which may provide further insight into role of HSCs in the pathogenesis of diabetes mellitus (DM). To approach this, HSCs were cultured with or without retinol (100 μM) in the presence of 5 or 30 mM glucose which correspond to blood glucose concentrations during the early and late stages of diabetes, respectively, and their intracellular proteins were subsequently analyzed via two-dimensional electrophoresis (2-DE). Differentially expressed proteins were identified via ESI-Q-TOF MS and confirmed via Western blot. Under high glucose conditions, 10 up-regulated proteins and 5 down-regulated proteins were detected, whose functions were associated with glucose metabolism, antioxidant activity, and potent cancer. Most importantly, the expressions of glycolytic enzymes were dramatically changed, influencing the activity of protein kinase C (PKC). With retinol treatment, 35 proteins were differently expressed, including glucose metabolic enzyme, cellular regulators, calcium control proteins, albumin precursors and antioxidant proteins. Among them, Capz-beta significantly increased is recently known as a regulator in PKC signaling and calcium sensitivity protein in epithelia cells, and PKC is a key factor as pathogenesis of advanced DM. Therefore, a correlation between CpaZ-beta and PKC was assessed using an inhibitor (staurosporine) and an activator (phorbol ester) of PKC. The results indicate that between Capz-beta protein and PKC has direct correlation in HSCs under high glucose. These results will help in understanding abnormal change in the glycolytic pathway and PKC activity in HSCs during pathological process of DM. Some researches have shown that HSCs become unresponsive to retinoids or lost intracellular retinoids during activation. However, these studies were not clear for retinol pathway in activated HSCs. Furthermore, how high glucose induces change in the retinol pathway remain to be fully elucidated. Therefore, changes in the retinoid contents of the HSCs were analyzed with HPLC and LC/MS. The levels of retinoid contents in HSCs treated with retinol were found to be lower under high glucose conditions. To study the retinol pathway in detail, activities of the retinoid receptors, retinoic acid receptor (RAR) and retinoid X receptor (RXR) family, and cellular retinol binding protein (CRBP) were also examined. In the case of RAR and RXR family, not significantly differential responses to retinoids were observed between control and high glucose condition. In contrast, CRBP was clearly decreased in HSCs under high glucose. These results indicated that even though exogenous retinols were uptaken, HSCs exposed to high glucose can’t afford to keep the retinoids in the intracellular storage. On the basis of these in vitro results, in vivo tests using an animal model were also conducted. Total 30 rats were provided with different concentrations of retinol for 10 weeks. Among them, some rats were induced diabetes using streptozotocin (STZ). The retinoids levels in the plasma of the diabetic rats were higher than those of the control rats in the early stages (3-4 weeks). However, in the late stages (9-10 week), the retinoids levels were dynamically decreased, which were in part through down-regulation of retinol binding protein 4 (RBP 4). These results may help to provide some understanding of the retinol pathway in HSCs cultured under high glucose conditions and STZ-induced diabetic rats. Taken all together, although a large-scale study is necessary to confirm the clinical significance of the results in this study, they suggest that in high glucose exposed HSCs, the metabolism was changed through abnormal changed in not only glycolytic enzymes and cellular regulator proteins resulting in up regulated PKC activity, but also retinol pathway, which may provide understanding the role of HSCs pathogenesis with DM. Hepatic stellat cells (HSC)은 간에 존재한 세포로서 parenchymal 세포와 sinusoidal 상피세포 사이에 존재한다. HSC는 retinol을 저장하는 세포로서 전체 몸의 약 80%에 해당하는 retinoids를 저장하며 이에 대한 항상성 조절을 한다. HSC의 특징으로는 평소에는 retinoids를 저장하면서 그 개체수나 모양에 있어서 둥그스러운 모습을 띄고 있으나, 병리학적인 조건-바이러스, 화학품, 알코올 등-에서는 본래 retinol 대사의 항상성을 잃어 저장 능력등이 떨어지고 그 모양이 비정상적으로 변한다. 이와 함께 그 개체수가 급격하게 증가함과 동시에 cytoskeleton 단백질 즉, collage, smooth muscle actin등을 분비하면서 결과적으로 간경화를 야기시킨다. 기존의 연구에서는 간경화에 관련된 HSC의 연구가 대부분을 차지하며, 이 세포본연의 기능인 retinol 항상성에 관련된 연구는 드물었다. 더욱이 당뇨병적인 환경에서 HSC뿐만 아니라, 나아가 간 전체에도 손상을 입힐수 있음에도 불구하고 이에 대한 연구는 전무하다고 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 당뇨병적인 환경하에서 HSC의 전반적인 단백질 발현을 2-DE를 통해서 연구 진행하였다. 또한 이러한 조건에서 변화되는 retinol의 대사를 HPLC, LC/MS 등으로 확인하였다. 본 연구에서 제시하듯이, 당뇨병적인 환경 특히 high glusoe 조건에서는 HSC의 단백질 발현에 상당한 변화를 주었으며 특히 해당과정과 대사 조절 단백질 발현에 많은 변화가 있음을 알 수 있었다. 이러한 단백질 발현의 변화가 Protein Kinase C의 활성에 영향을 끼친다고 사료된다. 그리고, high glucose에서는 HSC가 retinol 수용체는 정상적으로 작용하였으나, 세포내 retinoids 저장에 관련된 CRBP의 단백질에 변화를 주어 세포내 저장능력에 변화를 주는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 연구를 통해 당뇨병하에서 HSC, 혹은 간대사의 변화되는 단백질에 대한 고찰과 레티놀 대사에 대한 전반적인 이해도를 높여준다고 사료된다.

Cathepsin D and Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 as Markers of Stress-Induced Premature Senescence

한나경 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내석사

Induction of premature senescence may be a promising strategy for cancer treatment. However, the biomarkers for senescent cancer cells are still lacking. To identify, we performed comparative proteomic analysis of MCF7 human breast cancer cells undergoing premature senescence in response to ionizing radiation (IR). Cathepsin D (CD) and eukaryotic translation elongation factor 1 beta 2 (eEF1B2) were differentially expressed in response to IR-induced senescence using 2-dimensional electrophoresis. Following the Western blot analysis, CD was up-regulated, and eEF1B2 was down-regulated in IR-induced senescent MCF7 cells. Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 (eEF1A1), other entity of elongation factors, was also decreased during IR-induced premature senescence in MCF7 cells. These expression changes were confirmed in two other cancer cell lines, the HCT116 colon cancer cell line and H460 lung cancer cell line. Finally, the senescence-associated expression patterns of CD and eEF1 which were found in vitro, were also observed in IR-exposed xenografted animal model. These findings indicate that CD and eEF1 could be useful markers for the detection of premature senescence. 세포 노화(cellular senescence)는 telomere dysfunction, 암유발 유전자의 활성화, 유전자 손상제 그리고 세포 손상제 등에 의해 유도되는 세포의 모양의 변화와 성장이 억제되는 현상을 말한다. 최근 이러한 세포 노화의 현상이 종양 치료에 있어 또 하나의 방법으로 주목을 받고 있다. 따라서 방사선에 의해 유도되는 세포의 노화 과정 중 특이적으로 발현하는 marker 단백질을 찾고자 실험을 수행하였다. Human breast cancer cell line인 MCF7 세포에 6Gy의 방사선을 조사하고 4일 후 senescence-associated β-galactosidase (SA-βGal) 반응성과 세포 증식속도의 감소, 편평하게 퍼지는 세포모양의 변화로 노화의 유도를 확인하였다. 그리고 방사선에 의해 노화가 유도된 MCF7 세포와 대조군 세포의 단백질 발현 양상을 proteomics 기법으로 비교하여 발현양상이 특이적으로 변화하는 단백질 군을 발굴하였다. 이중 특히 cathepsin D의 단백질 발현이 증가하고 eEF1A는 단백질 발현이 감소하는 경향을 immunoblot analysis를 통하여 확인했다. 이러한 현상을 다른 종양세포에서도 확인하고자 human colon cancer cell line인 HCT116 세포와 human lung cancer cell line인 H460 세포에도 동일양의 방사선을 조사하여 노화를 유도한 후 cathepsin D와 eEF1A의 발현 양상을 확인한 결과, MCF7 세포에서와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 in vitro 상에서의 현상이 in vivo에서도 나타나는지 확인하기 위해, cancer cell의 xenograft models을 만들어 인위적으로 종양을 형성하게 한 후 방사선을 조사한 결과 cathepsin D와 eEF1A의 발현 양상이 세포실험에서와 같은 결과로 나타났다. 동물조직에 대한 TUNEL assay 결과 방사선을 조사한 조직과 그렇지 않은 조직에 대해 큰 차이가 없었으나 방사선을 조사한 종양조직에서 세포증식을 확인하는 marker인 Ki67의 반응이 감소한 것을 확인할 수 있었고, SA-βGal 반응성은 증가한 것을 확인할 수 있었다. 위와 같은 실험을 통해 cathepsin D와 eEF1A는 방사선에 의해 유도되는 노화의 biomarker로서 사용될 수 있으며, 이들 분자가 실제 방사선을 이용한 암 치료에 있어 저항성과 민감성을 예측할 수 있는 표지인자로서의 가능성을 제시한다.