Substance P inhibits TNCB-induced atopic dermatitis in NC/Nga mice by restoring normal skin architecture

최형원 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내박사

The efficacy of substance P (SP) in atopic dermatitis (AD) using 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB)-induced NC/Nga mice were examined. The topical application of SP significantly alleviated clinical symptoms of AD in a TNCB-induced NC/Nga mice model, which was nullified by pre-treatment with NK-1R antagonist CP99994. SP treatment reduced the levels of inflammatory cytokines such as TNF-α, TSLP, and TARC, the infiltration of mast cells and their degranulation, CD3 T cells in atopic skin, and immune cell activity in axillary lymph nodes (aLNs), mesenteric lymph nodes (mLNs), and the spleen. Moreover, SP restored normal skin architecture by decreasing and confining Ki-67-positive proliferating cells to the basal cell layer, decreasing abnormal-type keratins as well as the expression of K6/16 and K17, increasing proteins associated with normal differentiation such as involucrin, filaggrin, and claudin-1, and reconstituting the basement membrane and collagen deposition. Furthermore, SP markedly reduced the expression of NGF and PGP9.5-positive itch-evoking nerve fibers in the epidermis and elevated the level of Sema3A. SP’s effect on keratinocyte differentiation and Sema3a expression was also confirmed in cultured human and mouse keratinocytes. Therefore, these results suggest that topically administered SP may be proposed as a potential medication for AD.

Bee Venom Alleviates Atopic Dermatitis through the Upregulation of Decay-Accelerating Factor (DAF/CD55)

김예니 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

Complement system is a part of the innate immune system. The final result of complement activation is to clear invading pathogens by forming membrane attack complex (MAC) on their surface. However over-activated complement system contributes to the inflammatory process of Atopic Dermatitis (AD). mRNA and protein levels of Decay Accelerating Factor (CD55) were upregulated by BV. Further studies revealed that the phosphorylation of ERK was associated with upregulation of CD55. Complement dependent cytotoxicity (CDC) assay and bacteria killing assay have shown that BV inactivated complement system. We observed thatatopic mice model induced by DNCB increased the serum level of MAC and C3convertase (C3C). When mice were treated with BVusing bilateral subcutaneous injection, the level of MAC and C3C was decreased in atopic mouse. These results strongly suggested that BV alleviate AD symptom by inhibiting the formation of MAC. 보체계는 선천성 면역 반응 중 하나로 막공격 복합체를 형성하여 외부에서 침입한 세균을 제거하는 기능을 한다. 아토피 환자의 경우 보체계는 과활성화되어 있고, 이는 아토피의 증상을 악화시킬 수 있다. 본 연구에서는 꿀벌에서 분리한 봉독이 보체계 조절 단백질을 조절하여 과활성화 된 면역반응 억제 연구를 보여주고 있다.부식 촉발인자의 운반 RNA와 단백질은 봉독을 처리하였을 때 큰 증가를 보였다. 그리고 ERK의 인산화 억제제 처리를 통해 증가하는 부식 촉발인자에 관련된 것을 알 수 있었다. 보체 의존성 세포 상해작용 실험 결과와 혈청 살균 실험은 봉독의 처리에 의해 보체계의 활성이 억제된 것을 보여주었고 쥐 실험에서 정상그룹과 아토피유발 그룹에서 봉독을 처리한 쥐의 혈청에서 막공격 복합체와 보체 C3 전환효소의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 연구의 결과들을 종합해 볼 때, 과도하게 발현된 막공격 복합체는 아토피와 직접적인 영향이 있고 봉독은 이를 조절하여 아토피 환자의 치료제로서 사용 가능성을 보여주고 있다.

Caffeine triggers calcium signaling and confers resistance against a broad-spectrum of biotic/abiotic stresses in rice

박종찬 경희대학교 생명공학원 2018 국내박사

작물은 수확량을 심각하게 감소시키는 생물학적/비 생물학적 스트레스를 비롯한 환경 요인에 지속적으로 노출된다. 이러한 스트레스에 대처하기 위해 화학 농약이 일반적으로 사용되었지만, 과도한 적용으로 인하여 종종 환경 문제가 발생한다. 따라서 기존의 방법보다 안전하고 효과적인대체 방법을 찾는 것이 시급하다. 여기에서 나는 카페인의 형질 전환접근법을 통하여 벼의 기본 면역을 높인다는 것을 보고한다. 카페인 (1,3,7-trimethylxabthine)은 퓨린 알카로이드 계열의 전형적인 2 차 대사산물중의 하나이며 커피, 카카오, 차와 같은 몇 가지 식물에서 합성된다. 카페인은 병원균과 초식동물에 독성을 일으켜 숙주 식물을 보호하는 것으로 알려져 있다. 카페인은 purine catabolism pathway에서 xanthosine 을 전구체로 사용하여 합성된다. Coffea arabica 에서 동정 된3 개의 N-메틸 전이 효소 유전자를 도입하여 카페인 생성벼(CPR)을만들었다. CPR 은 표현형 적으로 원형벼와 동일했다. CPR 종자의 크기와 무게, 또한 생산량은 원형 벼와 비교하여 거의 차이가 없었다. 카페인의합성은 벼에서 생산되는 전구체, xanthosine의 양에 민감하게 좌우되었다.CPR 의 xanthosine과 카페인의 합성양은 8 배엽 단계에서 상관적으로 크게 증가하였으며 Xoo 와 M. oryzae에 대한 완전한 저항력을 갖추었다. 또한 CPR 은 벼 멸구 뿐만 아니라 가뭄 및 염스트레스에 대한 저항성이 강화되었다. 나는 카페인이 궁극적으로 살리실산의 합성을 활성화시키는 일련의 신호 전달 작용을 시작하는 분자 경로를 확인하였다. 이 결과는 방어 프라이밍 (defence priming)이라 불리는 병에 대한 대처법의 새로운 형태를 통하여 생물학적 및 비 생물학적 스트레스에 높은 수준의 내성을부여/제공하는 효과적인 수단임을 시사한다. 이는 벼뿐만 아니라 다른 작물 품종에 대한 장래의 분자육종에 잠재적으로 가치 있는 방어프라이밍을 위한 새로운 전략이 될 수 있다. Crop plants are constantly exposed to environmental factors, including biotic / abiotic stresses, which severely reduce yields. To cope with such stresses, chemical pesticides have commonly been used, but their excessive application has often caused environmental problems. It is thus urgent to find an alternative ways that are safer and more effective than conventional procedures. Here I report that caffeine elevates the basic immunity in rice through transgenic approach. Caffeine (1, 3, 7-trimethylxanthine) is a typical secondary metabolite of purine alkaloids and is synthesized in a few plant species such as coffee, cacao, and tea. Caffeine is thought to protect host plants by its toxicity against pathogens and herbivores. Caffeine is synthesized using a precursor, as the xanthosine in purine catabolism pathway. A caffeine-producing rice (CPR) was then generated by introduction of three N-methyltransferase genes identified from Coffea arabica. CPR plants were phenotypically equal to a wild type. The size and weight of the CPRs seed, also yields almost no difference as compared to the wild type. Caffeine synthesis sensitively depends on amount of precursor, xanthosine produced in rice. Xanthosine and caffeine amounts in CPR are correlatively increased at eight-leaf stages and the CPR has full resistance to Xoo and M. oryzae, at eight stages. In addition, CPR plants showed enhanced resistance not only to white backed plant hoppers but also to drought and salt stresses. The molecular pathway was identified through which caffeine initiates a series of signal cascade that ultimately activates synthesis of salicylic acid. These results suggest that caffeine is an effective means of conferring / provide a high level of resistance to biotic and abiotic stresses through a new form of disease coping method called defense priming. This can be a novel strategy for defense priming, being potentially valuable for future molecular breeding of not only rice but also other crop varieties.

substance P enhances mesenchymal stem cells-mediated immune modulation

김은희) 경희대학교 생명공학원 2015 국내석사

Since clinical application of MSCs requires long-term ex vivo culture inducing senescence in MSCs and reducing the therapeutic activity of transplanted MSCs, numerous efforts have been attempted to sustain the active state of MSCs. Substance P (SP) is a neuropeptide that functions to activate the cellular physiological responses of MSCs, including proliferation, migration, and secretion of specific cytokines. In this study, we explored the potential of SP to restore the weakened immune modulating activity of MSCs resulting from long-term culture by measuring T cell activity and interleukin-2 (IL-2) secretion of CD4+ Jurkat leukemic T cells. As the number of cell passages increased, the immunosuppressive function of MSCs based on T cell activity decreased. This weakened activity of MSCs could be restored by SP treatment and nullified by co-treatment of an NK1 receptor blocker. Higher levels of transforming growth factor beta 1 (TGF-1) secretion were noted in the medium of SP-treated late passage MSC cultures, but IL-10 levels did not change. SP-treated MSC-conditioned medium decreased T cell activity and IL-2/IFN-g secretion even in the presence of lipopolysaccharide (LPS) or CD3/CD28 antibodies, both of which were successfully blocked by inhibiting the TGF beta signaling pathway. This stimulatory effect of SP on late passage MSCs was also confirmed in direct cell-cell contact by co-culture of MSCs and T cells. Collectively, our study suggests that SP pretreatment to MSCs may recover the immunosuppressive function of late passage MSCs by potentiating their ability to secrete TGF-1, which can enhance the therapeutic activity of ex vivo expanded MSCs in long-term culture.

탄수화물 가수분해효소 처리를 이용한 쌀 가공 부산물의 이화학적 특성 파악

박진우 경희대학교 생명공학원 2011 국내석사

쌀에는 탄수화물, 단백질, 비타민 B, 비타민 E, 피틴산, 이노시톨과 같은 영양소가 포함되어 있다. 쌀이 부작용 없는 고급 영양소임에도 불구하고 현재 쌀 가공 부산물은 동물의 사료로 사용되고 있다. 따라서 이번 연구에서는 상용화된 탄수화물 가수분해효소를 이용하여 쌀 가공 부산물을 가수분해 함으로써 효소 처리 후 남은 침전물의 불용성 단백질, 식이섬유 분획을 증가시키는데 그 목적이 있다. 탄수화물 가수분해 효소로는 Termamyl, Fungamyl, Liquozyme, Promozyme, Celluclast 그리고 Viscozyme. 이상의 여섯가지 효소가 사용되었다. 주박과 탈지미강, 시럽박의 시료를 최적 pH와 최전 온도에서 각 효소와 반응시켰다. 그 결과 아밀로스 분해효소 (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme) 반응 후 단백질 함량이 주박에서 272.8 ~ 368.4 mg/g, 탈지미강에서 193.6 ~ 238.1 mg/g 으로 높게 나타났다. 셀룰로스 분해효소 (Celluclast, Viscozyme) 에서는단백질 함량이 낮게 나타났다. pullulanse인 Promozyme 은 가장 낮은 단백질 함량을 보였다. 가장 효과가 컸던 효소는 Liquozyme으로, 효소 처리로 인해 주박의 불용성 단백질 함량이 187.1 mg/g에서 368.4 mg/g 으로 증가하였다. 이번 연구로 인해 쌀 가공 부산물의 탄수화물 분해효소 처리로 인한 가수분해 특성에 대한 자료의 토대를 마련할 수 있었다. Rice contains lots of nutrients such as carbohydrates, proteins, vitamin B, vitamin E, phytic acid and inositol et al. While the rice protein and carbohydrate are regarded as a good source of food in nutrition with its non-allergic characteristics, rice by-product (RBP)’s application in food industry has been limited to animal feed. Therefore, the objective of this study was to increase the amounts of insoluble rice protein and rice dietary fiber in RBP by hydrolyzing remaining carbohydrates in RBP using various commercial carbohydrases. Six commercial carbohydrases (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme, Promozyme, Celluclast, and Viscozyme) were used to hydrolyze carbohydrate in RBP. The rice wine meal (RWM), defatted rice bran (DRB) and rice syrup meal(RSM) were hydrolyzed with carbohydrases at each optimum pH and temperature. Amylolytic enzymes (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme) showed the highest protein concentration in RWM (272.8 ~ 368.4 mg/g) and DRB (193.6 ~ 238.1 mg/g). Cellulolytic enzymes (Celluclast, and Viscozyme) showed relatively low protein concentration and Promozyme, which has pullulanase activity, showed the lowest protein concentration. Overall, insoluble protein content of RWM increased from 187.1 mg/g to 368.4 mg/g after hydrolyzation with Liquozyme. This study provides the basic information of RBP and its hydrolyzation behavior with various commercial carbohydrases.

Spinasterol-Glucose and its synthetic derivatives attenuate inflammatory response in HaCaT keratinocytes and in DNCB-induced mouse model

정미라 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내박사

Atopic dermatitis (AD) is a chronic and complex inflammatory skin disease that caused by environmental effects, abnormal immunologic responses or dilapidation skin-barrier function. Keratinocytes are predominant cell type in the skin and play a pivotal role in producing various proinflammatory cytokines and chemokines, leading to development of AD. Since AD is kind of allergic inflammatory disease, production of Th2-type chemokines is closely related to the severity of disease. Chemokines, a family of small cytokines are crucial for recruitment of various immune cells like dendritic cells, lymphocytes and macrophage cells to inflammatory lesions. In AD patients, the expression of TARC and MDC was significantly higher in the lesional skin than healthy skin. Previously, we have shown that a phytosterol derivative, 3-O-β-D-glucopyanosylspinasterol (spinasterol-Glc) isolated from leaves of Stewartia koreana was reported to inhibit LPS-induced cytokine production in Raw 264.7 macrophage cells. In the present study, we investigated the effect of spinasterol-Glc on TNF-α/IFN-γ-induced expression of TARC and MDC in human HaCaT keratinocytes. Spinasterol-Glc inhibited both the mRNA and protein expressions of TARC and MDC induced by TNF-α/IFN-γ in a dose-dependent manner by blocking NF-kB and STAT signaling pathway. However since it is difficult to be available in large quantities of spinasterol-Glc from natural plants, we evaluated that spinasterol-Glc is uneconomical despite of its remarkable anti-inflammatory effects. Accordingly, we developed the analogue of spinastrol-Glc, DHE-Glc which is structurally similar to spinaterol, carrying same backbone and different side chain with spnasterol. Then, we determined whether this analogue show inhibitory effects on TNF-α/IFN-γ induced AD-like skin lesions similar with spinasterol-Glc. Pretreatment of DHE-Glc inhibited expression of TARC and MDC in TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT keratinocytes. Additionally, topical administration of DHE-Glc suppressed serum IgE and histamine levels as well as epidermal thickening and mast cell populations in 1-chloro-2,4-dinitrobenzene induced atopic dermatitis-like mouse skin. In summary, spinasterol-Glc and the synthetic derivative, DHE-Glc suppressed TNF-α/IFN-γ stimulated production of TARC and MDC in HaCaT cells and additionally, DHE-Glc reduced DNCB-induced AD-like symtoms of skin inflammation. These results suggest spinasterol-Glc and DHE-Glc may be used as a potential anti-inflammatory agent for the prevention and treatment of skin inflammatory diseases 아토피염은 대표적인 피부염증으로 환경적 변화 및 잘못된 면역반응, 피부장벽의 이상 등의 복합적인 이유로 유도되는 대표적인 피부질환입니다. 각질형성세포는 피부층의 대부분을 차지하고 있는 주성분으로서 아토피염 발병에 관여하는 다양한 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생성해낸다. 케모카인은 작은분자량을 갖는 사이토카인의 일종으로 주화성을 담당해 염증반응을 유도하는 신호를 전달하는 물질들이며, 수지상세포, 백혈구를 비롯한 다양한 면역세포를 병변부위를 불러모으는데 중요한 역할을 한다. 특히나 아토피염이 유도가 되면 Th2성 케모카인들은 과발현되는데 대표적인 Th2 케모카인으로는 TARC, MDC가 있다. 실제 피부염 환자 혈청 내에는 TARC, MDC의 농도가 일반 건강한 피부에서보다 훨씬 높다. 앞선연구에서 우리는 노각나무 추출물의 주 구성분인 3-O-β-D-glucopyanosylspinasterol이 LPS로 염증이 유도된 대식세포 내에 방출되는 염증성 사이토카인의 생성량을 감소시켜주는 실험결과를 통해 이들물질이 항염증활성이 뛰어남을 밝혔다. 이번연구를 통해 spinasterol-Glc이 피부염증에는 어떠한 효과를 가지는지를 알아보고자 하였다. Spinasterol-Glc는 각질형성세포 내 TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가되는 TARC, MDC 발현량에 현저한 감소효과를 보였다. 그 다음, 이러한 항염증 활성은 중요 전사조절인자인 NF-kB와 STAT의 활성을 저해함으로써 이루어짐을 알아냈다. 그러나, Spinasterol-Glc는 대량생산이 어려워 경제성이 없음을 확인한 바, 대체물질로써 쉽게 얻을 수 있는 물질을 이용해 이들과 유사구조를 갖는 물질을 합성을 하였다. 우리는 Spinaterol의 합성 파생물질인 DHE-Glc이 피부염증에 있어 Spinasterol-Glc와 비슷한 효능을 보이는지 알아보고자 하였다. 그 결과, DHE-Glc 역시 TNF-α와 IFN-γ에 염증이 유도된 각질형성세포 내 증가되는 TARC, MDC의 생성량을 농도의존적으로 줄여주었다. 이후, in vitro상의 결과가 in vivo상에서도 적용가능한지를 알아보고자 동물실험을 수행하였다. DHE-Glc의 국소적 도포는 DNCB로 접촉성 피부염이 유발된 동물모델에서 피부염증 시 발생하는 임상적 특징 및 면역반응을 상당히 많이 감소시킴을 확인하였다. 혈청 내 igE 및 histamine의 생성량을 물론 피부층의 두께와 염증세포의 침윤 모두 DHE-Glc의 도포에 의해 상당히 감소되며 4mg/kg의 DHE-Glc가 포함된 크림 도포시엔 거의 정상군과 비슷한 정도로 염증이 완화됨을 확인할 수 있다. 지금까지의 연구결과를 통해 Spinasterol 과 그의 합성 파생물질인 DHE-Glc는 피부염증 치료제로도 잠재적인 효과가 있음을 짐작할 수 있다. 본 바대로 실험이 계획대로 잘 진행된 바, 좋은 결과를 이끌어 냈다고 생각한다. 또한 본 연구 결과는 아직 밝혀지지 않은 새로운 물질의 피부염증에 있어서의 약리효과 및 약물의 작용기전을 밝힐 수 있는 주요 연구 성과로 여겨진다.

A Salmonella Virulence Protein Regulates mRNA Expression of Hexose Phosphates Transporter

이진섭 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

When salmonella infect host cell, it is phagocytized by host macrophage. Intracellular pathogens, including Salmonella enterica and Mycrobacterium tuberculosis, can survive from macrophage by forming phagosome. In this condition, well-known salmonella virulence protein that called MgtC is expressed. It can bind with salmonella’s own F1Fo ATP synthase, which result in inhibition of ATP synthesis. This control is very important for salmonella, because thereby suppress ATP synthesis, salmonella can maintain its membrane potential from external low pH condition. In this very unfavorable environment, salmonella need something else to overcome. One of the proteins regulated by MgtC is UhpT involved in uptake glucose-6-phosphates. The glucose-6-phosphates is benefit to salmonella because it can be used in glycolysis as an intermediate or support phosphorus to salmonella that is important for them. For this reason, in this study tried to find out how MgtC was involved in the regulation of uhpT. Consequently, I found that uhpT451 isoleucine residue is critical to binding with MgtC. and this 451th residue’s length can have an effect on this binding. Because when MgtC present uhpT expression is upregulated, I expected that it will play a role of positive regulator, but when UhpT can’t bind with MgtC, uhpT mRNA expression is upregulated. This result indicated that MgtC is negative regulator of uhpT and suggested that another protein may be involved in this regulation. By bacterial two hybrid assay, I unveil that the another protein is UhpC and it can bind with UhpT and UhpB also. To confirm that how interact these three proteins each other, I carry out immunoprecipitation, which indicated that the MgtC intervene between UhpT and UhpC. So, in this study I suggested uhpT regulation model at two condition. This control of uhpT expression may propose answer of that how salmonella can survive in macrophage and maintain their virulence. Salmonella enterica serovar Typhimurium이 숙주의 식균작용에 의하여 대식세포 안으로 들어가게 되면, 병원성 단백질로 잘 알려져 있는 MgtC를 발현하게 된다. 이 MgtC는 살모넬라 자신의 ATP 합성효소와 결합하여 ATP합성을 억제하게 되는데, 이는 대식세포의 낮은 산 농도로 인한 과량의 수소 분자의 이동을 억제하여 salmonella 가 낮은 산 농도에서도 견딜 수 있게 해준다. ATP를 합성할 수 없는 이와 같은 상황에서 salmonella가 견디기 위해서는 에너지원을 생성할 수있는 또 다른 방법을 필요로 할 것이다. Salmonella의 MgtC에 의하여 조절 받는 단백질 중 하나는 UhpT인데, 이 단백질은 포도당-6-인산을 수송하는 역할을 한다. 이 포도당-6-인산은 해당과정의 중간산물로써 ATP를 합성하는데 사용될 수 있을뿐더러, salmonella에게 필요한 인산을 제공하는 역할을 수행할 수 있다. 따라서 위와 같이 ATP 합성 효소를 통한 에너지 생성이 억제되어 있는 상태의 salmonella 에게 포도당-6-인산을 수송하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 본 연구에서는 UhpT의 451번 residue가 salmonella의 MgtC와 결합하는데 중요한 역할을 한다는 것과 이 residue의 길이가 중요한 역할을 한다는 사실, 그 리고 UhpT와 MgtC의 결합 여부에 따라, uhpT 유전자의 발현이 조절 받는다는 사실을 알 수 있었다. 흥미로운 점은, MgtC가 UhpT와 결합하지 못할 때, uhpT유전자의 발현이 크게 증가한다는 점인데, 이는 MgtC가 UhpT의 음성 조절자(Negative regulator)로 작용한다는 것을 나타낸다. 이것은 또 다른 단백질이 uhpT 유전자 발현 기작에 참여한다는 것을 의미하게 되는데, 본 연구를 통하여 이 단백질이 UhpC라는 사실을 알게 되었다. 이후 면역 침강 실험을 통하여, UhpT와 MgtC 그리고 UhpC가 서로 밀접하게 결합하고 떨어지면서, uhpT 유전자 조절 기작에 참여한다는 사실을 밝혀냈고, 결론적으로 위 기작의 모델을 구성하고 제안하였다.

A Salmonella Protein regulates Virulence to infect Host Cells

백종현 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

이 연구들은 살모넬라균이 숙주 환경에 효과적으로 반응하고 살아남아 숙주의 감염을 일으키기 위하여 어떻게 자신의 병원성 인자를 조절하는가에 대해 보고하기 위해 디자인되었다. 살모넬라균, 페스트균, 그리고 결핵균을 포함한 병원균들이 다양한 방법으로 병원성 유전자를 발현하고 조절함으로서 숙주세포 내에서 살아남기 위해 노력한다. 하지만 어떻게 병원균들이 자신의 병원성을 조절하고 또 어떻게 숙주의 면역시스템을 파괴하는지는 분자적 관점에서 볼 때 많은 것이 밝혀져 있지 않다. 이러한 병원균-숙주의 상호작용을 연구하는 것은 미생물을 더 잘 이해하고 감염성 질병들을 정복하기 위해 필수적인 것처럼 생각된다. 이 논문에서 나는 병원균과 숙주세포가 어떻게 상호작용하는지에 대한 예시들을 소개한다. 예를 들면 무기질 인의 대사, 병원성 인자인 MgtC의 단백분해 조절, 그리고 데옥시리보 핵산의 메틸화와 핵단백질의 상호작용이 그것이다. These studies were designed to report the how Salmonella regulates own virulence factors to effectively respond to host environments, survives within host cells, leads to host infection in molecular view. Albeit pathogens including Salmonella Typhimurium, Yersinia pestis, and Mycobacterium tuberculosis struggles to survive within host cells by expressing and regulating a variety of virulence genes, how pathogens control own pathogenicity and disrupt host immune system are still uncovered in molecular view. Researching pathogen-host cell interaction is essential for understanding microbes in detail and governing infectious diseases. In these reports, I introduce several examples how pathogen and host interact and how pathogen survive in harsh phagosome environments, for example, activating inorganic phosphate metabolism, proteolytic regulation of MgtC, and interplaying DNA methylation and nucleoproteins.

Effect of molecular size on infusion efficiency of fluorescein derivatives into native starches

김계선 경희대학교 생명공학원 2014 국내석사

To elucidate the capability of commercial starches as wall materials for drug delivery system (DDS) and nutrient delivery system (NDS), infusion of different molar mass of fluorescein isothiocyanate-dextrans (FDs) into commercial native starches at various pressures were investigated using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and fluorescent detector. FD4, FD10, FD20 and FD40 (MW 4000, 10000, 20000 and 40000, respectively) were used as infusion materials. Corn, waxy rice, tapioca and potato starches were used for wall materials. Each starch suspension with fluorescein derivative was reacted in water bath at 40˚C for 15 min at atmospheric pressure. The CLSM image showed that all FDs infused into corn, waxy rice and tapioca starches except FD40. On the other hand, all FDs did not infuse into potato starch. As molar mass increased from FD4 to FD20, infused FD amount decreased in all starches. Corn starch showed the highest infusion in all FDs at atmospheric pressure. Corn starch suspension with fluorescein derivative was pressurized high hydrostatic pressure equipment at room temperature for 15min in the pressure range 100 to 400MPa. The highest amount of FD4, FD10, and FD20 were infused into corn starch at 300MPa and these amounts were similar to infused amount at 40˚C under atmospheric pressure. It is expected that high pressure can be utilized to infuse material into starches instead of heating if the infusion material is thermal-unstable. This result clearly confirmed that commercial starch can be used as wall materials for DDS/NDS and high molecular weight material (over MW 40,000) cannot be used as infusion material for commercial starches. 산업에서 많이 이용되는 전분을 약물•영양성분 전달 시스템의 벽물질(wall material)로서 사용하기 위해 각 전분 내로 혼입 가능한 물질의 분자량에 대해 알아보는 연구를 진행하였다. 다양한 분자량의 fluorescein isothiocyanate-dextran(FD)을 전분 내로 침투시켜 봄으로써 혼입 가능한 한계분자량을 알아보고, 혼입 시 초고압 기술을 적용해봄으로써 그 효과를 평가하였다. 옥수수, 찹쌀, 타피오카, 감자 전분이 벽물질로 사용되었고, 혼입 물질로는 FD4, FD10, FD20, FD40(MW4000, 10000, 20000, 40000)이 이용되었다. 상압 하의 40℃에서 15분동안 FD를 혼입시킨 전분을 confocal laser scanning microscopy(CLSM)으로 관찰한 결과 옥수수, 찹쌀, 타피오카 전분 내로 FD4, FD10, FD20이 모두 혼입 가능하지만 감자 전분에는 모든 FD가 혼입되기 어렵다는 결과를 얻을 수 있었다. FD40은 모든 전분에 혼입이 불가능 하다는 사실 또한 관찰 할 수 있었다. Fluorescent detector를 통해 전분 내로의 FD의 혼입량을 측정해 본 결과, 옥수수 전분에서 가장 좋은 효율로 혼입이 일어난 것을 알 수 있었다. 혼입 단계에서 초고압을 적용해 봄으로서 그 효과를 관찰하였다. 상압 실험시 가장 효율이 좋았던 옥수수 전분을 벽물질로 이용하고, 100-400MPa의 조건에서 15분동안 혼입을 시켜 보았다. 그 결과 200-300MPa에서 상압 조건과 유사한 혼입량을 보이는 것을 알 수 있었다. FD40은 초고압 조건 하에서도 여전히 혼입이 불가능 하다는 사실 또한 알 수 있었다. 이에 따라 전분을 벽물질로 사용할 때 분자량 40000 이상의 물질은 혼입물질로 사용하기 어렵다는 결론을 내릴 수 있다. 온도에 의존적인 혼입이 일어나는 상압 조건과는 달리 초고압 조건은 영하의 온도에서도 적용 가능한 기술이다. 이를 고려해 볼 때 thermal-unstable한 물질을 혼입 시킬 때 초고압을 적용하면 좋은 효율을 기대 할 수 있다고 예상할 수 있다. 본 결과는 전분을 DDS나 NDS에서 벽물질로 사용할 시 좋은 참고 자료가 되어줄 것으로 예상한다.

PtrTALE12, a member of TALE transcription factor family in Populus trichocarpa, is involved in axillary shoot development by regulating WUSCHEL expression

배소영 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

In response to endogenous and/or exogenous stimuli, transcription factor (TF) regulates plant growth and development by modulating the rate of transcription initiation of target genes. Among them, a particular class of TF, the Three-Amino-acid-Loop-Extension (TALE) homeoproteins has been shown to control meristem formation and organ morphogenesis in plants. Poplar, a model woody plant, has a total of 35 TALE transcription factors, which is larger than that of Arabidopsis (22 members). As a first step towards understanding functional role of TALE family in woody perennials, the entire TALE family members of Populus trichocarpa were cloned in overexpression (PtrTALE-OX) and suppression (PtrTALE-SRDX) constructs. To characterize the molecular function of the poplar TALE TF family, we performed a phenotype-based screening of transgenic Arabidopsis populations, which were created by transformation of either overexpression or suppression of the TF gene constructs. As expected, many transgenic Arabidopsis plants showed altered plant architecture, leaf shaping and apical dominance. Among them, the overexpression of PtrTALE12, which seems like ortholog of Arabidopsis BLH11, showed significantly unique phenotype, enhanced axillary shooting. Interestingly, the expression level WUSCHEL(WUS) that is core factor to regulate stem cell population in SAM was significantly increased. Some persuadable proof has been appeared showing its interacting partner is SHOOT MERISTEMLESS(STM), which plays really significant roles in shoot apical meristem. RNA-seq has also provided corresponding result and additional keys to explain the phenotype such as significantly down-regulated circadian rhythm and Jasmonic acid(JA) related genes, which are all related to initiating axillary shoots. We hypothesized that these three factors, which are WUS, circadian rhythm, and JA were regulated by cytokinin level increase, and this resulted in PtrTALE12-OX phenotype. Conclusively, all of these were involved in functional mechanism of PtrTALE12 in plant 포플러의 전체 TALE 전사 인자 (TF) 계열을 연구하기 위해, 33개의 포플러 TALE TF의 발현을 증가시키거나(OX) 기능을 억제하는(SRDX) 벡터를 제작하여 애기장대 형질전환체를 생산하였다. 형질전환 된 애기장대 집단에서 표현형에 기초하여 흥미로운 표현형을 가진 라인들을 선별하였다. 본 연구에서는 axillary shoot이 과도하게 발달하여 덤불 같은 모양을 가지며 키가 작은 표현형이 나타난 PtrTALE12의 과발현체를 통해, 그 기능을 규명하기 위한 목표로 연구를 진행하였다. 먼저, WUS(WUSCHEL)이 유도되면axillary shoot이 발달한다고 보고된 바에 따라, PtrTALE12의 과발현체의 rosette 잎 겨드랑이 부분을 샘플링하여 quantitative RT-PCR 및 RNA-seq을 통해WUS의 발현을 확인한 결과, 표현형의 세기와 일치하게 뚜렷이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 Transient activation assay를 통해 in vivo에서, proWUS::GUS X 35S::PtrTALE12를 통해 in planta에서 또한 검증 되었다. 그리고 TALE TF는 BELL 그룹과 KNOX 그룹에 속하는 멤버들이 서로 단백질 interaction을 한다는 것이 알려져 있기 때문에, BELL 그룹에 속하는 PtrTALE12는 KNOX 그룹의 어떤 멤버와interaction을 하는지 검증한 결과, STM(SHOOT MERISTEMLESS)과 interaction함을 알 수 있었다. 또한, PtrTALE12의 과발현체는 추대가 wild type에 비해 열흘 정도 빠르게 일어나는데, 그것은 CCA1과 LHY라는 circadian gene의 발현이 현저하게 감소했기 때문임을 알게 되었다. 그리고 RNA-seq 결과, JA(jasmonic acid)관련 유전자들이 매우 현저하게 감소해 있음을 알게 되었고, 이 또한 axillary shoot을 발달시키는 것과 관련이 있었다. 또한, PtrTALE12의 과발현체의 표현형을 보면 정단 우세 또한 망가져 있는 것을 알 수 있는데, 이는 auxin의 부족과 관련이 있다고 생각했고 auxin과 그 inhibitor를 추대 직후의 애기장대에 처리함으로써 증명하였다. 따라서, PtrTALE12가 과발현 되면, auxin이 부족해지면서 cytokinin가 늘어나고, 그 결과 WUS의 발현이 증가함과 동시에 JA이 감소하였으며 CCA1과 LHY가 감소하는 요소들이 복합적으로 작용해 axillary shooting을 촉진하였다고 결론을 내리게 되었다. 애기장대의 TALE TF 중 포플러의 PtrTALE12와 계통적으로 가장 유사한 BLH11의 과발현체도 같은 벡터를 이용해 제작하여 그 표현형을 관찰한 결과 유사한 표현형이 나타났다. 또한, 포플러의 PtrTALE12 과발현체를 제작하여 표현형을 분석한 결과, axillary branch수가 뚜렷하게 증가하였고 표현형이 강한 라인의 경우 키가 작아진 것도 관찰하였다. 이로써 PtrTALE12는 잎 겨드랑이에서 하위 유전자들의 발현을 조절함으로써 axillary shoot의 발달을 조절한다는 것을 밝히게 되었다.