새로운 다중 고리 화합물의 합성과 응용

박선길 忠南大學校 新藥專門大學院 2020 국내석사

Part A. Development of Two-Photon Probes for Detection of Intracellular Calcium Ions Calcium ions act as a secondary messenger of our body to control various functions of the cell. Since changes in calcium ion concentration are closely related to many diseases, detection of intracellular calcium ions level can be one of the approaches to prevent and diagnose the disease before it becomes severe. In order to detect Ca2+ in the cell, we designed two-photon probes targeting cell organelles such as cytosol, mitochondria, and lysosome. For this purpose, we have synthesized the probes possessing a fluorene as a fluorophore and polycarboxylic acids as a calcium receptor. These probes are well characterized for two-photon microscopy to detect the level of calcium ions in each organelle. Therefore, we have designed and synthesized the two-photon probes such as, FBCa-1, FBCa-1-Acid-Amide and FBCa-1-AM-Amide. FBCa-1 shows a 3-fold TPEF enhancement in response to Ca2+, dissociation constant (Kd) of 313 nM and has a fluorene fluorophore with λmax of 485 nm. Additionally, FBCa-1-AM-Amide has a fluorene fluorophore with λmax of 544 nm. Unfortunately, FBCa-1-Acid-Amide shows no enhancement in response to Ca2+. Part B. An Efficient One-Pot Synthesis of Dibenzoxepino[4,5-c]pyrrole via Aldol Condensation and Etherification Dibenzoxepino[4,5-c]pyrrole is an important scaffold that shows interesting biological activities. Especially, Asenapine (Saphris®) has been used for the acute treatment of schizophrenia and bipolar disorder. Here, we will present a novel and efficient synthetic method via sequential intramolecular aldol reaction for pyrrole intermediate and SNAr reaction for diaryl ether formation. It is noteworthy that the synthesis of the proposed tetracyclic compound could be achieved by a transition metal-free and one-pot reaction under mild conditions. Therefore, we have designed and synthesized required amide intermediate for one-pot cyclization. Finally, dibenzoxepino[4,5-c]pyrrole derivatives were synthesized successfully through optimized DBU-mediated one-pot cyclization conditions. Further applications of this process are helpful to synthesize various medicinal compounds.

Development of analytical method for CNC1049, a candidate for COVID-19 treatment, and application to pharmacokinetic study in rats

최해인 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

본 연구에서는 흰 쥐의 혈장에서 COVID-19 치료제 후보물질인 CNC1049에 대한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS)을 개발하고 검증하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049를 분석하기 위해 아세토나이트릴을 사용한 단백질 침전법을 통해 시료를 전처리 하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049의 정량을 위하여 이동상은 10 mM Ammonium formate in DW와 아세토나이트릴의 조합으로, 분석용 컬럼은 역상으로서 페닐 컬럼을 이용하여 isocratic 용리방식으로 크로마토그램을 확인하였다. CNC1049 및 ibuprofen의 이온의 검출은 ESI negative MRM 모드로 진행하였고, CNC1049는 m/z 324.92 → 170.90 에서, ibuprofen은 m/z 205.06 → 161.10에서 두 채널을 동시에 정량 하였다. 혈장 중 CNC1049의 정량범위는 1 ~ 3,000 ng/mL 이었고, 양호한 직선성을 나타내었다. (r2>0.99). 해당 분석에서 CNC1049는 0.77분, ibuprofen은 0.71분의 피크유지시간을 나타내었으며 분석물질이 혈장중 내인성물질과의 간섭 없이 일정한 피크유지시간을 나타냄을 확인하였다. 일내, 일간 정밀성(%CV) 및 일내, 일간 정확성(%RE)은 모두 8% 미만으로 확인되었다. 또한 생체시료의 영향, 회수율, 전처리 효율은 77 ~ 96%였다. 시료 취급(3회 냉·해동, 실온에서 6시간, -20℃에서 한 달, 전처리 후 24 시간)에 따른 CNC1049의 안정성을 평가한 결과, 상기의 조건에서 99.9%이상의 높은 안정성을 보였다. 개발된 CNC1049의 분석법은 FDA 분석법 및 EMA 가이던스 기준을 충족 하였고, 재현성 있고 신뢰성 있는 분석결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. CNC1049의 체내 동태 연구는 각각 0.3 ~ 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 정맥, 경구 및 근육투여 후 평가되었다. 정맥 투여 후, 반감기, 클리어런스, 분포용적은 대략 각각 1 h, 1,000 mL/h/kg, 300 mL/kg로 용량에 상관없이 일정한 값을 나타내었다. 경구 투여 후, 생체 이용률은 5.5%로 추정되었고 체내 약물의 노출은 매우 낮았다. 근육 주사 후, 생체 이용률은 65%로 경구 투여군에 비해 비교적 높은 값을 나타내었다. 흰 쥐에서 CNC1049 300 mg/kg로 경구 투여 후 조직분포실험의 경우, 14 개의 조직 (뇌, 간, 신장, 비장, 위장, 소장, 대장, 고환, 지방, 폐, 심장, 부신, 피부 및 근육)에서 CNC1049는 소화관을 제외하면 주로 부신과 신장에 높게 분포하였다. CNC1049의 배설연구는 흰 쥐에 3 mg/kg로 정맥투여하거나 10 mg/kg로 경구투여 함으로써 진행되었으며, 소변과 대변을 통한 CNC1049의 회수율은 6 % 미만이었다. 한편 in vitro 연구에서 CNC1049가 흰 쥐의 간 마이크로솜에서 반감기가 30분 이내로 불안정했으나, 1상대사가 주요 대사경로가 아님이 예측되었다. CYP 효소 주요 5종(1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) 중 CYP2C9을 약하게 저해했으며, 마우스, 흰 쥐, 개, 원숭이, 사람의 혈장에서 99.8% 이상의 높은 혈장단백결합률을 보였고 종 간 차이는 없는 것으로 확인되었다. 결론적으로, HPLC-MS/MS를 이용하여 흰 쥐의 혈장에서 CNC1049를 정량하는 분석법을 개발 및 검증하였고, 이 분석법은 흰 쥐에서의 약물동태 연구에 잘 적용되었다.

A genome-wide scale systematic screening for long-lived mutants using gene deletion library of fission yeast

우지혜 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

과학 기술의 발달로 인해 인간의 기대 수명은 점차 증가하고 있다. 따라서, 새로운 장수 관련 유전자 발굴이나 노화와 관련된 기전 연구 등 많은 장수 관련 연구가 이루어지고 있다. 분열효모는 장수 연구에 이용되는 모델 생명체 중 하나로서, 반수체 유전자 적중 라이브러리가 구축되어 있다. 현재 분열효모에서 장수 연구를 통해 TOR signaling pathway, Insulin/IGF-1 pathway, 그리고 PKA/Sty pathway 등의 수명 조절 기전이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 반수체 유전자 적중 라이브러리를 이용하여 장수 균주를 스크리닝하였고, 장수 균주의 수명 조절 기전에 대해서 분석하고자 하였다. 본 연구에서는 분열효모 반수체 라이브러리리를 마이크로어레이를 통해 스크리닝한 뒤 3,400여 개 균주 각각의 intensity값을 비교하였고, 21개의 장수 후보군을 선정하였다. 정상 대조군과의 수명을 비교하기 위해 장수 후보군은 고체 배지에서 개별적으로 생존 능력을 검증하였고, 정상 대조군보다 오래 생존한 15개의 균주를 최종적인 장수 균주로 선정하였다. 장수 균주의 gene ontology를 분석하여 분자생물학적 특징에 따라 분류하였을 때, 아미노산 또는 탄수화물의 대사와 번역에 관련된 유전자가 다수 확인되었으며, 단백질의 분해 과정에 관련된 gene도 확인되었다. 장수 균주의 생장 곡선을 측정하였을 때, 대부분의 경우 정상 대조군에 비해 성장률이 저하되어 있었다. 정상 대조군 대비 성장률이 저하되지 않은 Δidn1과 Δpca1은 세포의 형태도 정상 대조군과 유사하였으며, 두 균주의 수명 증가 원인을 추가적으로 분석하였다. Δidn1은 정상 대조군에 비해 포도당 농도 감소로 인한 수명 증가가 미미하였으며, NADPH 생성의 감소로 인해 산화 스트레스에 민감하였다. 때문에 Δidn1의 수명 증가는 포도당 소비 감소를 통한 세포 내 에너지 조절과 연관된 것으로 보인다. Δpca1은 apoptosis 유도 물질을 처리하였을 때 정상 대조군에 비해 nuclear fragmentation이 적게 나타났다. 따라서 Δpca1의 수명 증가는 apoptosis의 감소로 인한 것으로 보인다. 장수 균주에 대한 심층적인 연구는 고등 생물의 수명 연구에 중요한 단서로서 활용할 수 있을 것이다. With the advancement of science and technology, the life expectancy of humans is gradually increasing. Therefore, many studies related to longevity, such as discovering new genes related to longevity or studying aging-related mechanisms, are being conducted. Through longevity research in fission yeast, It has been reported that lifespan is regulated by the TOR signal pathway, Insulin/IGF-1 pathway, and PKA/Sty pathway. Fission yeast is one of the model organisms used for study of longevity and this laboratory has constructed a haploid gene deletion mutant library. In this study, long-lived mutants were screened using a fission yeast haploid deletion mutant library, and we tried to find out how they regulate the lifespan of fission yeast. In this study, we have screened a fission yeast haploid deletion mutant library using microarray and analyzed the intensity values of about 3,400 strains, and 21 long-lived candidates were selected. To compare lifespan with normal control, long-lived candidates were individually tested for viability in solid medium, and 15 of mutants that lived longer than normal control were selected as the final long-lived mutants. As a result of analyzing gene ontology of long-lived mutants and classifying them according to molecular biological characteristics, many genes related to amino acid or carbohydrate and translation were identified, and genes related to protein catabolic process were also identified. The morphological characteristics and growth curves of the long-lived mutants were analyzed, and the long-lived mutants were classified according to the characteristics. When measuring the growth curve of the long-lived mutants, in most cases, the growth rate was lowered compared to the normal control. The Δidn1 and Δpca1, whose growth rate did not decrease compared to the normal control, were similar in morphological phenotype to the normal control, and the cause of the increase in lifespan of the two mutants was further analyzed. Δidn1 had less effect of increasing lifespan due to reducing glucose concentration compared to the normal control group, and was sensitive to oxidative stress due to decreased NADPH production. Δidn1 seems to increase lifespan by maintaining cell energy status due to decreased glucose consumption. When Δpca1 was treated with apoptosis-inducing substance, nuclear fragmentation was less than that of the normal control group. Δpca1 appears to have increased lifespan due to a decrease in apoptosis. In-depth study of long-lived mutants could be used as an important clue in the study of lifespan of higher organisms.

QSAR study for the discovery of JAK inhibitor : Machine learning and Deep learning

강애린 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

The target, Janus Kinase (JAK), is known for four types of isozyme: Janus kinase 1(JAK1), Janus kinase 2(JAK2), Janus kinase 3(JAK3), and Tyrosine kinase 2(TYK2), each of which combines variously to control the downstream of cytokines, which play a pivotal role in essential cell functions such as cell proliferation, erosion and survival. In this study, we build a model that finds inhibitors of Janus kinase through quantitative structural activity relationship (QSAR) of compound-based drug design methods with machine learning and deep learning using data on JAK. We used bayesian models in machine learning and artificial neural network (ANN) models in deep learning. 3D descriptors were used to exploit the chiral structure in JAK, indicating that the accuracy was significantly reduced. While thinking about how to supplement this, we referenced to look at a paper that complemented the model using a convolutional neural network (CNN) to examine whether this SMILES code can be used as a kind of expression by converting it to a number. Before converting SMILES code to numbers, we calculated the 2D descriptor, 3D descriptor, and SMILES code for the compounds with different active values at the same target to ensure that the chiral structure can be distinguished. As a result, we find that there was a difference between the 3D representative and SMILES code, and that these two can be used as descriptors. As SMILES codes have been added as descriptor, the accuracy has been increased through training, test sets, and external datasets. Descriptor identified in this paper could be applied as complementary indicators for new drug development to other targets. 타겟으로 잡은 야누스 키나아제(Janus Kinase; JAK)의 구성은 JAK1, JAK2, JAK3 그리고 TYK2까지 총 4가지가 알려져 있으며, 각각의 아이소자임들은 다양하게 결합하여 사이토카인의 downstream을 조절한다. 본 논문에서는 야누스 키나아제에 대한 데이터를 이용하여 머신러닝과 딥러닝으로 화합물 기반 약물 설계 방법의 정량적 구조 활성 관계(quantitative structure activity relationship; QSAR)를 통해 야누스 키나아제의 저해제를 찾는 모델을 구축하였다. 머신러닝에서는 베이시안 모델을 이용하였고 딥러닝에서는 인공 신경망(artificial neural network; ANN) 모델을 이용하였다. 야누스 키나아제 저해제에 있는 카이랄 구조를 활용하기 위하여 3D 표현자를 사용하였고, 이 표현자를 사용할 경우 모델의 정확성이 떨어짐을 알 수 있었다. 이를 보완할 방법을 생각하다가 SMILES 코드를 합성곱 신경망(convolutional neural network; CNN)을 사용하여 모델을 보완한 논문을 보고 이 SMILES 코드를 숫자로 변환하여 일종의 표현자로 사용할 수 있는지 검토하고자 하였다. 숫자로 변환하기 전 카이랄 구조를 SMILES 코드가 구분할 수 있는지를 확인하기 위하여 같은 타겟에 있어 활성값이 다른 카이랄 구조를 가지고 2D 표현자, 3D 표현자, SMILES 코드를 계산하였다. 그 결과 3D 표현자와 SMILES 코드에 차이가 있어 이 둘을 표현자로 사용할 수 있음을 알게 되었다. 3D 표현자를 추가한 모델의 그래프 정확성이 떨어지는 경향을 보였으나, SMILES 코드를 표현자로 추가한 모델에서는 정확성이 올라간 것을 훈련, 테스트 그리고 외부 데이터 세트를 통해 확인하였다. 본 논문에서 확인한 표현자가 다른 타겟에 있어서도 신약개발 모델에 대한 보완지표로 적용될 수 있을 것이다.

Study on SELENBP1 Overexpression in Microgliosis of 5xFAD TG Mice

김병민 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

미세아교세포의 활성화 (microglial activation)는 알츠하이머 질병 (Alzheimer’s disease)을 포함한 다양한 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에서 관찰되었지만, 이에 대한 근본적인 기작은 자세히 보고되어 있지 않다. 뇌에서의 기능이 규명되지 않은 셀레니움-결합 단백질 1 (SELENBP1, Selenium-binding protein 1))의 상향 조절이 알츠하이머 질병 환자의 여러 뇌 영역에서 관찰되었다. 그러나, SELENBP1의 발현 변화와 알츠하이머 질병의 발병 기전 간의 연관성은 지금까지 제시되지 않았다. 우리는, 본 연구를 통하여, 5 개의 가족성 알츠하이머 질병 돌연변이를 발현하는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP, Amyloid precursor protein) / 프레세닐린1 (PS1, presenilins) 이중 형질 전환 생쥐 (5xFAD)의 뇌에서 발생한 SELENBP1의 상향 조절이 알츠하이머 질병 발병 기전에서 나타나는 미세아교세포의 활성화와 관련 있음을 확인하였다. SELENBP1은, 한 배 정상 생쥐 (wild-type mice)와 비교하여, 3 개월 및 6 개월 연령의 5xFAD 형질 전환 생쥐 모델의 dorsal subiculum 및 dentate gyrus와 같은 뇌 해마의 세부 영역들에서 상향 조절되었다. 그러나, 이러한 상향 조절은 1.5개월 연령의 형질 전환 생쥐 해마 부위에서 관찰되지 않았다. 게다가, 형질 전환 생쥐 뇌 조직에서의 SELENBP1 상향 조절은, 별아교세포 (astrocytes)가 아닌, 미세아교세포에서 대부분 관찰되었다. 특히, 형질 전환 생쥐의 경우, SELENBP1이 상향 조절된 세포에서 미세아교세포 활성화와 관련된 형태학적 변화가 관찰되었지만, 이와 같은 SELENBP1이 발현되는 반응성 미세아교세포들은 정상 생쥐 뇌 조직에서 관찰되지 않았다. 따라서, 우리가 관찰한 상기 결과들을 바탕으로, SELENBP1 상향 조절이 알츠하이머 질병 발병 기전에서 관찰되는 마이크로글리아의 활성화와 관련이 있음을 제시한다.

Systematic analysis of inter-species genetic regulation of longevity

이재웅 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내박사

장내미생물은 mammal에게 여러 이로운 역할을 하는 것이 잘 알려져 있으며, 이들에게 문제가 생기면 gastrointestinal disorder, Crohn's disease, cancer, autoimmune disease, neurodegenerative disease, and metabolic syndrome 등 많은 질병을 일으키게 된다. 이들 중 cancer, neurodegenerative disease, and metabolic syndrome은 노화와 관련된 질병이기 때문에 장내미생물은 수명에도 영향을 줄 것으로 생각된다. 그러나 mammal을 이용한 장내미생물이 노화에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험은 높은 비용, 긴 시간, 윤리적 문제로 어려운 것이 사실이다. 따라서, 이 연구에서는 장내미생물이 노화에 미치는 영향을 알아보기 위해 C. elegans와 3792종의 E. coli mutants를 각각 host와 장내미생물로 하여 genome wide screen을 진행하였다. 그 결과, 17개의 E. coli mutant는 C. elegans의 수명을 증가시키고, 27의 mutant는 C. elegans의 수명을 감소시키는 것을 확인하였다. C. elegans의 수명을 증가시킨 17개의 mutant candidate중 methylglyoxal을 적게 만드는 hns E. coli mutant에서 DAF-16/FOXO를 통해 C. elegans의 수명을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, C. elegans의 수명을 감소시킨 27개의 mutant candidates 중 MG를 분해하는 gloA와 ydjG가 overexpress되었을 때 C. elegans의 수명을 증가시키는 것을 확인하였으며, 이들 또한 C. elegans의 DAF-16/FOXO를 통해 C. elegans의 수명을 늘리는 것으로 확인하였다. 이 data들은 bacteria-derived MG가 host의 수명 조절 pathway를 modulation하여 host의 수명을 조절하는 것을 가리킨다. 종합적으로, 이 연구는 장내미생물의 bacteria-derived MG가 새로운 노화, 그리고 노화 관련 질환들의 치료 타겟임을 보여준다. It is well known that gut microbes play a number of beneficial roles in mammals, and when problems occur in them, they cause many diseases such as gastrointestinal disorder, Crohn's disease, cancer, autoimmune disease, neurodegenerative disease, and metabolic syndrome. Among aging are difficult due to high cost, long time, and ethical issues. Therefore, in this study, genome wide screens were performed using Caenorhabditis elegans and 3792 Escherichia coli mutants as hosts and gut microbes, respectively, to investigate the effect of gut microbes on aging. As a result, it was confirmed that 17 E. coli mutants increased the lifespan of C. elegans, and 27 E. coli mutants decreased the lifespan of C. elegans. Among the 17 mutant candidates that increased the lifespan of C. elegans, it was confirmed that the hns E. coli mutant, which produce less methylglyoxal, increased the lifespan of C. elegans through DAF-16/FOXO. In addition, it was confirmed that the lifespan of C. elegans increased when gloA and ydjG, which degrade Methylglyoxal (MG), were overexpressed among 27 mutant candidates that reduced the lifespan of C. elegans, and these were also confirmed to increase the lifespan of C. elegans via DAF-16/FOXO of C. elegans. These data indicate that bacteria-derived MG modulate the lifespan of a host through the lifespan regulate pathway of host. Taken together, this study shows that bacteria-derived MG of gut microbes is a therapeutic target for novel aging and age-related diseases.

마스터세포은행 제조를 위한 HSV1-TK와 yeast CD 레트로바이러스 생산 세포주 구축

권지은 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

Retroviral replicating vectors (RRVs) have shown efficient tumor transduction and enhanced therapeutic benefits in a variety of cancer models. In the previous study, we developed the spRRV system (sRRVgp-yCD & spRRVe-TK) encoding HSV1-TK and human codon-optimized yeast CD genes as for cancer therapeutic agents, respectively. In the present study, to achieve a successful clinical trial using RRVs, we were willing to establish the virus producer cells (VPCs) that produce high-titer spRRVs. First, each of the spRRVs (sRRVgp-yCD8 & spRRVe-TK) transduced separately into retrovirus packaging cell line PG13. And then, PG13/env-HSV1-TK and PG13/gagpol-yCD8 VPCs were selected clonally and amplified for the screening of VPCs producing high-titer retroviral vector particles. The characteristics of established VPCs were accomplished by validation of genome stability, infectivity, cytotoxicity, productivity, and mycoplasma test. Finally, the validated PG13/env-HSV1-TK and PG13/gagpol-yCD8 VPCs were manufactured in the GMP facility. Also, the MCBs can be used for mass production and purification of retroviral vectors in GLP or GMP facilities for non-clinical and clinical trials.

New protein- and ligand-based approaches using topological water network and chemical fingerprint

최광은 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내박사

컴퓨터를 활용한 신약 설계 연구분야는 크게 구조기반 약물설계, 리간드기반 약물설계 방법으로 나뉘어져 있다. 이러한 연구기법을 활용해 약물활성 예측을 잘 하기 위한 분자들의 수학적, 논리적 데이터형으로 나타낸 특성들을 descriptor(표현자)라고 한다. 단백질기반의 표현자들은 아미노산서열, 리간드와의 결합에너지, 용매화 자유에너지 등이 있으며, 리간드 기반의 표현자들은 분자량, 분배계수, 수소결합 공여체 및 수용체 수, 방향족 고리 수, 극성표면영역, substructure와 작용기를 논리값으로 나타내는 화학 핑거프린트 등이 있다. 오늘날 유용한 표현자들을 계속해서 식별, 개발, 개선하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에선 기존에 좀처럼 활용하지 않았던 신규 표현자들을 적용하였다. 단백질 기반의 표현자로서 원자 수준에서의 위상학적 물분자 네트워크를 이용하고, 리간드 기반의 표현자로서 정수형 화학 핑거프린트를 이용하였다. 단백질 기반의 표현자로는 이전에 단백질과 리간드만 고려한 연구방법에서 물분자를 도입한 연구방법으로 확장되고 있다. 그러나 물분자를 이용한 연구방법은 대부분 자유에너지 계산을 이용하며, 이러한 자유에너지 계산은 많은 시간을 요구하고 개개의 물분자만을 고려한다. 본 연구에선 자유에너지 계산 없이 다른 물분자들과의 물리화학적 성질을 나타낼 수 있는 위상학적 물분자 네트워크를 도입하였으며, 고리(ring)형 구조를 나타내는 3-, 4-, 5-, 6-ring 을 추출하여 이용하였다. 원자 수준에서의 위상학적 물분자 네트워크 분석은 각각 20개의 아미노산 구조를 생성해서 분자동역학 시뮬레이션 결과에 적용했으며, 고분자 중합체인 단백질은 X-선 결정 구조로 규명된 12만개의 모든 실험적 단백질 3차구조 파일을 다운로드하여 분석하였다. 친수성 아미노산은 극성 원자인 산소, 질소 주변에 물 네트워크를 형성하였고, 소수성 아미노산은 비극성 원자인 탄소 주변에 물 네트워크를 형성하였다. 리간드 기반의 표현자로는 대부분 이진수형 핑거프린트를 이용하여 연구가 진행되고 있다. 그러나 이진수형 핑거프린트는 일정한 수 (보통 1024개)로 고정되어 있어 분자들의 수많은 substructure, 작용기들을 모두 표현하는 것이 제한된다. 따라서 정수형 핑거프린트를 새로 도입하여 hERG 저해제 예측에 적용하였다. 정수형 핑거프린트는 대부분의 머신러닝 모델에서 잘 예측하며 이진수형 핑커프린트는 딥러닝 모델에서 잘 예측하고 변수들의 수가 1024개로 고정되어 있어서 계산시간이 단축되었다. 생성한 모델들의 성능 비교 결과 데이터 수가 적은 조건 (최근 2019년 개제된 hERG 실험결과 문헌들)에서의 예측력은 머신러닝, 딥러닝 모두 정수형 핑거프린트에서 잘 예측하였다. 상기 신규 표현자들의 활용은 컴퓨터 기반 신약 설계분야에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

난발현성 단백질 Cathepsin K 발현 및 정제

박슬기 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

Cathepsin K is an enzyme Protein expressed in osteoclasts, and causes osteoporosis by decomposing elements that make up the bone matrix such as elastin, collagen, and gelatin. Therefore, the development of Cathepsin K inhibitors could suggest a therapeutic approach to osteoporosis. In this study, Cathepsin K gene cloning was performed in several formats to obtain Cathepsin K antigen. Thereafter, transfection was performed on HEK293Ecell, a mammallian cell, and the expression level was confirmed through western blot. Since it was estimated that the expression level of Cathepsin K, a Cysteine protease was toxic to the cell, and the expression level was low, three amino acids (Cysteine, Histidine, Asparagine), which play an important role in activating the hydrolysis of Cathepsin K, were point mutations to Alanine. Of these three amino acids, only point mutation of Cysteine to Alanine increased the expression level. In order to further increase the expression level, Signal Peptide Screening from No.1 to No.200 for this format performed. As a result, the expression level was the best in Signal Peptide No.135, and N-NTA affinity chromatography was performed to obtain Cathepsin K antigen for this type. However, a fine amount of protein was expressed and was not neatly separated or purified. As a conjecture, a G4S linker, which makes the protein flexible, was constructed between the target gene and the His-tag, considering whether the protein does not bind to His-tag. In the same manner as above, after cloning Signal Peptides 1 to 200, Ni-NTA affinity chromatography was performed to obtain antigens. As a result, it was confirmed that the expression level was improved compared to before attaching the G4S linker. In order to efficiently obtain Cathepsin K antigen from the economic point of view, a test was conducted using BL21-DE3 as a cell line in E.coli, not a mammallian cell. After growing in E.coli in large quantities, cell sonication was performed to confirm which of the supernatant and pellets was highly expressed. As a result, it was identified as an inclusion body expressed in pellets. After purification to separate the inclusion body by adding urea, refolding to remove urea was performed again. In these process, the column was not eluted to see if the protein was denaturated. As a result, it was difficult to obtain an antigen from E.coli, and Cathepsin K antigen was obtained by culturing mammallian cells. Cathepsin K는 파골세포(Osteoclast)에서 발현되는 enzyme protein으로서 elastin, collagen, gelatin과 같은 뼈의 기질을 이루는 요소들을 분해시켜 골다공증(Osteoporosis)를 유발한다. 따라서 Cathepsin K 억제제 개발은 골다공증의 치료적 접근법을 제시 할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 항체 개발을 위한 전 단계로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 여러 형식 Cathepsin K gene 클로닝을 진행하였다. 경제적인 면에서 효율적으로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 mammallian cell이 아닌 E.coli에서 BL21-DE3를 cell line으로 하여 test를 진행하였다. E.coli에서 대량으로 키운 후 cell sonication을 진행하여 Supernatant와 Pellet중 어느곳에서 발현이 많이 되는지 확인하였다. 그 결과 Pellet에서 발현이 되는 Inclusion body로 확인되었다. Urea를 첨가하여 Inclusion body 를 분리하기 위하여 정제를 진행한 후 다시 urea를 제거해주는 Refolding을 진행하였는데 이 과정에서 단백질이 denaturation된 것인지 컬럼에 Elution 하지 않았다. 이후 mammallian cell인 HEK 293Ecell에 transfection을 진행하였고 western blot을 통하여 발현량을 확인한 결과, 원하는 발현량을 얻을 수 없었다. Cysteine protease인 cathepsin K가 cell에 toxic하여 발현량이 낮은 것은 아닌지 추측하였기 때문에cathepsin K의 가수분해를 활성화 나타내는데 중요한 역할을 하는 아미노산 3개(Cysteine, Histidine, Asparagine)를 Alanine으로 point mutation을 진행하였다. 이 3가지 아미노산 중 cysteine을 alanine으로 point mutation 시킨 것만 발현량이 증가한 것으로 보아 추측이 옳았음을 알 수 있었다. 발현된 단백질을 세포 바깥으로 분비하도록 하는 체계를 만들고자 1번부터 200번까지의 Signal Peptide Screening을 진행하였다. 그 결과 Signal Peptide 135번에서 발현량이 가장 우수하였고 이에 대한 catehpsin K 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그러나 미세한 양의 단백질이 발현되었고 깔끔하게 분리, 정제 되지 않았다. 이에 대한 추측으로 단백질이 His-tag에 binding 하지 않는 것인지 생각하여 단백질을 Flexible하게 만들어주는 G4S Linker를 target gene과 His-tag 사이에 제작하였다. 위와 동일하게 Signal Peptide 1번부터 200까지에 대한 클로닝을 진행한 뒤 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그 결과 G4S Linker를 부착하기 전에 비하여 발현량이 개선된 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 E.coli에서 항원을 얻기는 힘들었고 mammallian cell을 배양하여 Cathepsin K 항원을 얻을 수 있었다.

울만 커플링과 락탐 형성 반응을 통한 Dibenzoxazocin-5-one의 합성

배혜란 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

중간 고리의 heterocycle (8 ~ 11 각 고리고리)는 희귀한 구조적 특징과 생물학적 활성 떄문에 많은 주목을 받고 있다있다. 하지만 선호되지 않는 엔탈피와 엔트로픽 현상으로 인해 합성하기 어렵다. 그러므로 울만 커플링과 락탐 형성 반응을 통해 8-membered heterocycle을 지닌 dibenzoxazocine을 합성하였다. Medium-sized heterocycles (with 8 to 11 atoms) have received a lot of attention due to their unique structural features and interesting biological activities. However, it is difficult to synthesize them owing to unfavorable enthalpic and entropic factors. Herein, we present the synthesis of dibenzoxazocine possessing the 8-membered heterocycle via ullmann coupling and lactam formation reaction.