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리보솜 DNA의 ITS 영역을 이용한 제주도 재래감귤 ‘병귤’의 유전적 근연관계
진성범(Seong Beom Jin),박재호(Jae Ho Park),박석만(Suk Man Park),이동훈(Dong Hoon Lee),윤수현(Su Hyun Yun) 한국육종학회 2016 한국육종학회지 Vol.48 No.3
The 12 cultivars of the Jeju native Citrus are considered to have originated from China. However, the origin of the cultivar ‘Byungkyool’ (Citrus platymamma Hort. ex Tanaka) is not clearly known. We performed PCR analysis by using three primer sets designed from the internal transcribed spacer (ITS) region of nuclear ribosomal DNA (nrDNA) to analyze the phylogenetic relationship between the traditional citrus cultivars and the Byungkyool cultivar. Sequence length of the nrDNA ITS1 region of JNCPCRI (Jeju Native Citrus platymamma Citrus Research Institute) cultivar was 247 bp, 8the ITS2 region was 228 bp and the total ITS region (ITS1-5.8S-ITS2) was 638 bp. Analysis of the genetic relationship based on the sequence analysis at the ITS region of the JNCPCRI cultivar revealed that the ITS1 region of the cultivar was genetically the same as that of the Byungkyool (JQ990189) cultivar, and the ITS2 region was genetically similar to the Binkyool (JQ990180), Hongkyool (JQ990178), Dangyooja (JQ990179), and Pyunkyool (JQ990181) cultivars. Moreover, the total ITS region in the 5.8S rDNA region was genetically similar to the Hongkyool (JQ990178) cultivar. In addition, the total ITS region of the JNCPCRI cultivar was the most closely related to the Cheongkyool (JQ990183) cultivar and has been reported to originate from the Binkyool (JQ990180) and Pyunkyool (JQ990181) cultivars. Although the JNCPCRI cultivar was morphologically the same as the Byungkyool (JQ990189) cultivar, the ITS region showed genetic heterogeneity. Taken together, we conclude that the genetic variation in the ITS region of JNCPCRI cultivar suggests that it was propagated through fertilization with the surrounding citrus cultivars.
화분 특이적 마커를 이용한 감귤 교잡종 실생묘의 조기 동정
진성범(Seong Beom Jin),윤수현(Su Hyun Yun),박재호(Jae Ho Park),박석만(Suk Man Park),고상욱(Sang Wook Koh),이동훈(Dong Hoon Lee) 한국원예학회 2015 원예과학기술지 Vol.33 No.4
본 연구는 종자친과 화분친을 구별할 수 있는 분자마커를 개발하고 이를 이용하여 교잡종 실생묘를 조기 선발하는 프로토콜을 확립하고자 본 연구를 진행하였다. 종자친으로 3종의 온주밀감(‘성전온주’, ‘남감20호’, ‘궁천조생’)과 화분친으로 7종의 만다린 감귤(‘병감’, ‘Lee’, ‘기주밀감’, ‘신예감’, ‘부지화’, ‘탐나는봉’, ‘Sunburst’) 품종을 사용하여 RAPD 분석방법을 이용하여 교잡종 실생묘를 선발 할 수 있는 화분친 특이적 프라이머 37개를 선발하였다. PCR 분석결과 이중 2개의 프라이머는 모든 교배조합에서 교잡종 실생묘를 선발할 수 있었다. 또한 “남감20호 × 기주밀감”, “남감20호 × 병감” 그리고 “궁천조생 × Sunburst”의 교잡종 실생묘는 UBC 27프라이머를 사용하여 각각 40개체 중 29개체(73%), 47개체 중 9개체(19%) 그리고 45개체 중 13개체(29%)의 교잡종 실생묘를 선발할 수 있었다. 위 결과는 화분친 특이적인 마커를 사용하여 감귤에서 효과적으로 교잡종 실생묘를 동정 할 수 있음을 보여준다. This study was carried out to develop molecular techniques to allow the selection of zygotic seedlings in the early stage of the plant development. We identified 37 pollen-specific molecular markers from RAPD analysis and successfully used them for identification of the zygotic seedlings from various hybrid crosses. Three Satsuma mandarin cultivars (‘Morita unshiu’, ‘Nangan 20’ and ‘Miyagawawase’) were used as mother parents and seven cultivars (‘Ponkan’, ‘Lee’, ‘Kinokuni’, ‘Shiranuhi’, ‘Tamnaneunbong’, ‘Shinyegam’, and ‘Sunburst’ mandarins) served as pollen parents. PCR analysis showed that 2 primers could identify zygotic hybrid seedlings. Among them, an UBC-27 primer was used to identify the zygotic seedlings from hybrid crosses of “‘Nangan 20’ × ‘Kinokuni’” mandarin, “‘Nangan 20 × Ponkan’” mandarin and “‘Miyagawawase × Sunburst’” tangerine. In total 29 out of 40 seedlings (73%), 9 out of 47 seedlings (19%), and 13 out of 45 (29%) were identified as zygotic seedlings, respectively. These results can show that the pollen-specific markers selected in this study can be used effectively for early identification of zygotic seedlings from Citrus hybrid crosses.
배주배양 세포로부터 감귤 식물체의 획득 및 감귤 트리스테자 바이러스 무병주 검증
진성범(Seong Beom Jin),박재호(Jae Ho Park),박석만(Suk Man Park),이동훈(Dong Hoon Lee),윤수현(Su Hyun Yun) 한국원예학회 2017 원예과학기술지 Vol.35 No.1
본 실험은 우량 감귤품종 육성을 위한 바이러스 프리인 배주배양 세포의 재료 공급을 목적으로 실시하였다. 감귤 트리스테자 바이러스(CTV)에 감염된 것으로 추정되는 제주도 재래감귤 3품종(동정귤, 청귤, 지각) 그리고 온주밀감 2품종(궁천조생, 하례조생)의 미숙과실 내 수정되지 않은 배주를 malt extract 500㎎·L<SUP>-1</SUP>, sucrose 50g·L<SUP>-1</SUP>, kinetin 1.0㎎·L<SUP>-1</SUP> 그리고 agar 8g·L<SUP>-1</SUP>가 첨가된 MS2 배지에 치상하여 4주 후 각각 10, 21, 13, 5, 7개의 체세포 배를 얻었고, 체세포배 주변에서 white 캘러스 세포의 유도는 각각 2, 4, 2, 4, 5개를 얻었다. 얻어진 캘러스 세포로부터 체세포배의 유도는 MT 기본배지에 malt extract 500㎎·L<SUP>-1</SUP>, lactose70g·L<SUP>-1</SUP> 그리고 agar 16g·L<SUP>-1</SUP>가 첨가된 배지로 옮겨 6주 후 재분화능 체세포배를 얻었다. 재래감귤의 재분화능 체세포배는 MS 기본배지에 malt extract 500㎎·L<SUP>-1</SUP>, sucrose 50g·L<SUP>-1</SUP>그리고 agar 8g·L<SUP>-1</SUP>이 첨가된 배지로 옮겨 약 10주 후 약 60% 이상의 정상적인 유식물체를 얻었다. 반면 온주밀감 2품종은 MT 기본배지에 sorbitol 1.0M, galactose 1.0M, GA3 1.0㎎·L<SUP>-1</SUP> 그리고 gelrite 3g·L<SUP>-1</SUP>가 첨가된 배지에서 정상적인 유식물체를 얻었다. 배주배양 세포로부터 유도된 식물체들의 무병주 여부는 RT PCR과 혈청학적 진단법을 이용하여 무병주임을 확인하였다. 본 연구결과는 생명공학기법에 바이러스 프리인 감귤 세포를 이용함으로써 우량 감귤 품종을 육성할 수 있을 것으로 기대된다. This study was carried out to investigate a method for producing cultured virus - free ovules for breeding high - quality Citrus cultivars. Ovules from the immature fruits of three citrus cultivars native to Jeju (Dongjeongkyool, Cheongkyool, and Jikak) and two cultivars of Citrus unshiu Marc. (Miyagawa wase and Haryejosaeng) that were thought to be infected with Citrus tristeza virus (CTV) were cultured on MS2 medium (Murashige - Skoog [MS] basal medium containing 500 ㎎·L<SUP>-1</SUP> malt extract, 50 g·L<SUP>-1</SUP> sucrose, 1.0 ㎎·L<SUP>-1</SUP> kinetin, and 8 g·L<SUP>-1</SUP> agar). After four weeks of culture, 10, 21, 13, 5, and 7 somatic embryos and 2, 4, 2, 4, and 5 white callus cells (surrounding green somatic embryos) were obtained from Dongjeongkyool, Cheongkyool, Jikak, Miyagawa wase, and Haryejosaeng, respectively. After six weeks of culture, somatic embryos were obtained from cultured cells grown on MT basal medium supplemented with malt extract (500 ㎎·L<SUP>-1</SUP>), lactose (70 g·L<SUP>-</SUP>1), and agar (16 g·L<SUP>-1</SUP>). Over 60% of the somatic embryos from citrus cultivars native to Jeju developed into normal plants on MS basal medium supplemented with malt extract (500 ㎎·L<SUP>-1</SUP>), sucrose (50 g·L<SUP>-1</SUP>), and agar (8 g·L<SUP>-1</SUP>) after 10 weeks of culture. Normal plants were regenerated from two Citrus unshiu Marc. cultivars on MT basal medium supplemented with sorbitol (1.0 M), galactose (1.0 M), GA₃ (1.0 ㎎·L<SUP>-1</SUP>), and Gelrite (3 g·L<SUP>-1</SUP>). The absence of virus in plants generated from cultured ovules was confirmed by RT - PCR and antigen - antibody reactions. Therefore, virus - free Citrus cells can be obtained for breeding high - quality citrus cultivars using the biotechnological technique evaluated in this study.
엽록체 DNA trnL-trnF와 ITS 영역의 염기서열을 이용한 제주도 재래감귤 품종들의 계통학적 유연관계 분석
진성범(Seong Beom Jin),박재호(Jae Ho Park),박석만(Suk Man Park),이동훈(Dong Hoon Lee),윤수현(Su Hyun Yun) 한국원예학회 2018 원예과학기술지 Vol.36 No.4
이 연구는 엽록체 DNA 내 trnL-F와 핵 리보솜 DNA내 ITS 영역의 염기서열을 근거로 제주도 재래감귤 11품종들을 포함한 전체 28종의 감귤에 대한 계통분류학적 연구를 수행하였다. 엽록체 DNA내 trnL-F 영역의 염기의 평균적 총 길이는 361.1bp이며, 염기의 변이가 없이 보존되는 site는 354개, 변이를 보이는 site는 7개였고, 이 중 2개의 염기가 유효한 것으로 나타났다. ITS 전체(ITS1-5.8S-ITS2) 영역 내 염기의 평균적 총 길이는 637.68bp이며, 염기의 변이가 없이 보존되는 site는 570개, 염기의 변이를 보이는 site는 68개였고, 이 중 25개의 염기가 유효한 것으로 나타났다. 엽록체 DNA 내 trnL-F 영역과 전체 ITS 영역의 염기서열을 이용하여 분기값과 계통관계를 분석한 결과, 대다수의 재래감귤 품종들은 유전적으로 근연관계에 있었으며 문단과 만다린과의 잡종에 의하여 얻어진 품종이라고 추정할 수 있다. 특히, 유전적, 형태학적으로 제주도 내 유일 품종이라고 추측되고 있는 ‘병귤’은 문단(‘당유자’ 등)과 만다린(‘홍귤’ 등) 품종들과의 오랜 기간 동안 교잡에 의하여 얻어진 품종이라는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 재래감귤은 재배된 시기와 주변 품종이 다르기 때문에 품종들 간의 계통분류학적 관계를 분석하는 것은 쉽지가 않다. 따라서, 이 연구 결과는 제주도 내 재래감귤 품종들의 계통관계 분석함에 있어서 기초자료로 사용 가능하리라 생각된다. This study was carried out to determine the phylogenetic relationships among 28 Citrus species, including 11 cultivars native to Jeju, Korea, based on the sequences of the trnL-trnF region in chloroplast DNA and the internal transcribed spacer (ITS) region in nuclear ribosomal DNA. The average total length of the trnL-F region in chloroplast DNA was 361.1 bp, and that of the conserved sequence site was 354 bp, that of the variable site was 7 bp, and that of the parsimonious informative site was 2 bp. The average total length of the ITS region, which contains the 5.8S rDNA region, was 637.68 bp, and that of the conserved sequence site was 570 bp, that of the variable site was 68 bp, and that of the parsimonious informative site was 25 bp. Analysis of sequence divergence and phylogenetic relationships among the citrus species revealed that most native citrus cultivars were closely related, and these cultivars were presumed to be obtained by cross-breeding with pomelo (Citrus maxima) and mandarin (C. reticulata). In particular, the ‘Byungkyool’ cultivars, presumed to be a unique cultivar genetically and morphologically selected on Jeju island, was confirmed to have been obtained by long-term hybridization with cultivars of pomelo (‘Dangyooja’, etc.) and mandarin (‘Hongkyool’, etc.). However, analysis of the phylogenetic relationships among citrus cultivars native to Jeju was difficult due to the propagation through seedling from unknown cross combinations long time ago. These results suggest that phylogenetic analysis could be used to generate basic data about native citrus cultivars on Jeju island.