마우스 Hepa-1c1c7 세포주에서 B형 간염 바이러스에 의한 tumor necrosis factor-a의 발현 유도

예성수,장원희,양영일,이연재,김미성,석대현,박영홍,백계형,Yea Sung Su,Jang Won Hee,Yang Young-Il,Lee Youn Jae,Kim Mi Seong,Seog Dae-Hyun,Park Yeong-Hong,Paik Kye-Hyung 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.1

B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염은 인류의 보건에 대단히 중요한 문제이며, 따라서 HBV에 대한 많은 연구가 수행되어져 왔다. 그러나 HBV 연구에 있어서의 주된 장애요인은 그 감염이 사람과 일부 영장류에 국한된다는 점이다. 본 연구에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-1c1c7 세포를 이용하여 HBV의 감염성 및 그에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-a의 발현의 변화를 측정하였다. HBV의 표면항원(HBsAg)분비는 microparticle enzyme immunoassay를 사용하여 측정하였고, TNF-a mRNA 발현 측정에는 quantitative competitive RT-PCR 방법을 사용하였다. HBV 발현 벡터를 Hepa-1clc7 세포에 도입시켰을 경우뿐만 아니라 HBV 비리온을 갖고 있는 혈청을 사용하여 Hepa-lc1c7 세포를 감염시켰을 때에도 HBV mRNA 발현 및 HBsAg 분비가 측정되었다. 또한 두 상황 모두에서 TNF-a mRNA발현이 증가됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 사람과 영장류에 특이적인 HBV가 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포도 감염시킬 수 있다는 가능성을 제시한다. 또한 마우스 기원의 Hepa-lclc7 세포에서도 HBV의 유전자 발현에 필요한 여러 인자들이 존재하며, TNF-a와 같은 사이토카인 유전자 발현을 조절하는 세포 내 기전에 HBV가 영향을 미친다고 할 수 있다. 따라서 마우스 간암 세포주인 Hepa-lclc7 세포는 HBV 연구를 위한 시험 관내 모델로서 사용되어질 수 있을 것으로 보인다. Infection with hepatitis B virus (HBV) is a major health problem worldwide. Although a tremendous amount has been known about HBV, there have been obstacles in the study of HBV due to the narrow host range of HBV limited to humans and primates. In the present study, we investigated the susceptibility to HBV infection of mouse hepatoma cell line, Hepa-1c1c7. In addition, based on that human hepatocytes infected by HBV increase the expression of the pro-inflammatory cytokine TNF-a, the inducibility of TNF-a expression by HBV in the cells was determined. HBV surface antigen (HBsAg) secretion was measured by the microparticle enzyme immunoassay and steady state mRNA expression was analyzed by quantitative competitive RT-PCR. Transient transfection of Hepa-1c1c7 cells with HBV expression vector resulted in a dose-dependent induction of TNF-a expression. Infection of Hepa-1c1c7 cells with the serum of HBV carrier also increased TNF-a mRNA expression. Both in the transfected and infected cells, HBV mRNA was expressed and significant HBsAg secretion was detected. There was no significant variation in $\beta-actin$ mRNA expression by HBV. These results demonstrate that HBV is infectious to Hepa-lc1c7 in vitro and the viral infection induces TNF-a expression, which suggests that Hepa-lc1c7, a mouse hepatoma cell line, may be a possible model system for analysis of various molecular aspects of HBV infection.

Kinesin Superfamily KIF1Bα Protein Binds to the PDZ Domain of MALS-3

김상진(Sang-Jin Kim),이철희(Chul-Hee Lee),박혜영(Hye-Young Park),예성수(Sung Su Yea),장원희(Won Hee Jang),이상경(Sang Kyeong Lee),박영홍(Yeong-Hong Park),정용욱(Yongwook Jung),석대현(Dae-Hyun Seog) 대한해부학회 2006 Anatomy & Cell Biology Vol.39 No.5

분자 motor로서 큰 superfamily를 형성하는 Kinesin 단백질은 분비소포, 단백질 복합체, 세포 내 각 소기관을 운반한다. KIF1Bα는 단량체의 motor 단백질로서 세포 내에서 미토콘드리아를 세포 말단으로 이동시키는 역할이 밝혀졌다. 본 연구에서 효모 two-hybrid system을 사용하여 KIF1Bα와 결합하는 세포 내의 단백질을 분리하였다. 결과 KIF1Bα와 특이적으로 결합하는 mammalian LIN-7 (MALS)-3/vertebrate homology of LIN-7(Veri)와 synaptic scaffolding molecule (S-SCAM)을 분리하였다. MALS-3는 KIF1Bα의 C-말단 영역과 결합에 관여하며 KIF1Bα의 C-말단에 존재하는 “T-X-V”아미노산 배열이 MALS-3와의 결합에 중요하게 관여하였다. 또한 효모 two-hybrid assay에서 MALS-3는 KIF1Bα와 결합하지만 다른 종류의 KIFs와는 결합하지 않았다. 단백질간의 결합을 pull-down assay로 확인한 결과 MALS-3는 glutathione S-transferase (GST)와는 결합하지 않으나 GST결합 KIF1Bα와는 결합하였다. 또한 생쥐의 뇌 파쇄 액에 MALS-3 항체로 면역침강을 행하여 KIF1Bα를 확인한 결과 MALS-3와 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KIF1Bα는 MALS-3와 결합하며, MALS-3는 KIF1Bα의 수용체로 세포 내 KIF1Bα의 수송의 매개 단백질로 작용함을 시사한다. The Kinesin superfamily proteins (KIFs) make up a large superfamily of molecular motors that transport cargo such as vesicles, protein complexes, and organelles. KIF1Bα is a monomeric motor that conveys mitochondria and plays an important role in cellular function. Here, we used the yeast two-hybrid system to identify the proteins that interacts with KIF1Bα and found a specific interaction with the mammalian LIN-7 (MALS)- 3/vertebrate homology of LIN-7 (Veri) and synaptic scaffolding molecule (S-SCAM). MALS-3 protein bound to the tail region of KIF1Bα but not to other kinesin family members in the yeast two-hybrid assay. The “T-X-V” motif at the C-terminal end of KIF1Bα is essential for interaction with MALS-3. In addition, this protein showed specific interactions in the Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay. An antibody to MALS-3 specifically coimmunoprecipitated KIF1Bα associated with MALS-3 from mouse brain extracts. These results suggest that MALS-3, as KIF1Bα receptor, is involved in the KIF1Bα-mediated transport.

JSAP1 Interacts with Kinesin Light Chain 1 through Conserved Binding Segments

김진상,이철희,박혜영,예성수,장원희,이상경,박영홍,차옥수,문일수,석대현,Kim, Sang-Jin,Lee, Chul-Hee,Park, Hye-Young,Yea, Sung-Su,Jang, Won-Hee,Lee, Sang-Kyeong,Park, Yeong-Hong,Cha, Ok-Soo,Moon, Il-Soo,Seog, Dae-Hyun Korean Society of Life Science 2007 생명과학회지 Vol.17 No.7

KIF5는 2분자의 kinesin heavy chain (KHC)과 2분자의 kinesin light cham (KLC)으로 구성되며 미세소관과 직접 결합한다. KIF5는 여러가지 세포 내 소기관을 이동시키나 KIF5가 이동시키는 운반체가 어떻게 특이적으로 결합하는지는 아직 밝혀지지 못하였다. 본 연구에서 효모 two-hybrid system을 사용하여 KLC1의 tetratricopeptide repeats (TRP) 부위와 결합하는 세포 내의 단백질을 분리하였다. 결과 KLC1와 특이적으로 결합하는JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1/JIP3)을 분리하였다. 이러한 결합은 KLC1의 TRP1, 2 영역과 JSAP1의 leucine zipper 영역이 결합에 관여하며, 또한 효모 two-hybrid assay에서 JSAP1은 KLC2와 결합하지만 신경세포에서 발현하는 KIF5A, KIF5C 그리고 모든 세포에서 발현하는 KIF5B와는 결합하지 않았다. 단백질간의 결합을 pull-down assay로 확인한 결과 KLC1은 glutathione S-transferase (GST)와는 결합하지 않으나 GST결한 JSAP1과는 결합하였다. 또한 생쥐의 뇌 파쇄 액으로부터 JSAP1 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC1은 JSAP1과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KLC1은 JSAP1과 결합하며, JSAP1은 KLC1의 수용체로세포 내 KIF5의 수송의 매개 단백질로 작용함을 시사한다. A conventional kinesin, KIF5/kinesin-I, is composed of two kinesin heavy chains (KHCs) and two kinesin light chains (KLCs) and binds directly to microtubules. KIF5 motor mediates the transport of various membranous organelles, but the mechanism how they recognize and bind to a specific cargo has not yet been completely elucidated. Here, we used the yeast two-hybrid system to identify the neuronal protein(s) that interacts with the tetratricopeptide repeats (TRP) of KLCI and found a specific interaction with JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1/JIPP3). The yeast two-hybrid assay demonstrated that the TRP 1,2 domain-containing region of KLCI mediated binding to the leucine zipper domain of JSAP1. JSAP1 also bound to the TRP region of lac2 but not to neuronal KIF5A, KIF5C and ubiquitous KIF5B in the yeast two-hybrid assay. In addition, these proteins showed specific interactions in the GST pull-down assay and by co-immunoprecipitation. KLCI and KIF5B interacted with GST-ISAP1 fusion proteins, but not with GST alone. An antibody to JSAPI specifically co-immunoprecipitated KIF5s associated with JSAP1 from mouse brain extracts. These results suggest that JSAP1, as KLC1 receptor, is involved in the KIF5 mediated transport.

Interaction of GAT1 with Ubiquitin-Specific Protease Usp14 in Synaptic Terminal

Dae-Hyun Seog(석대현),Sang-Jin Kim(김상진),Young-Ju Joung(정영주),Sung Su Yea(예성수),Yeong-Hong Park(박영홍),Moo Seong Kim(김무성),Il Soo Moon(문일수),Won Hee Jang(장원희) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.7

γ-aminobutyric acid (GABA)는 중추신경계에서 억제성으로 작용하는 주요한 신경전달물질이다. GABA 수송체(GAT)는 연접간격에 존재하는 GABA를 세포 내로 재 흡수하여 GABA의 농도를 조절한다. 그런데 GABA 수송체가 어떻게 조절되는지는 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 효모 two-hybrid system을 사용하여 뇌의 주요 GABA 수송체인 GAT1의 C-말단과 특이적으로 결합하는 ubiquitin-specific protease 14 (Usp14)를 분리하였다. Usp14는 GABA 수송체 GAT1및 GAT2와는 결합하지만, 다른 GAT isoform과는 결합하지 않았다. GAT1과의 결합에는 Usp14의 C-말단부위가 필수적으로 관여함을 확인하였다. 또한 이 단백질간의 결합을 GST pull-down assay로 확인하였으며, 생쥐 뇌 균질액의 co-immunoprecipitation을 통하여 in vivo에서도 GAT1과 Usp14가 결합함을 확인하였다. 이러한 결과들은 Usp14가 GAT1과 결합하여 세포막에 존재하는 GAT1의 수를 조절하는 역할을 할 가능성을 시사한다. γ-aminobutyric acid (GABA) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. GABA transporters (GATs) control extracellular GABA levels by reuptake of released GABA from the synaptic cleft. However, how GATs are regulated has not yet been elucidated. Here, we used the yeast two-hybrid system to identify the specific binding protein(s) that interacts with the carboxyl (C)-terminal region of GAT1, the major isoform in the brain and find a specific interaction with the ubiquitin-specific protease 14 (Usp14), a deubiquitinating enzyme. Usp14 protein bound to the tail region of GAT1 and GAT2 but not to other GAT members in the yeast two-hybrid assay. The C-terminal region of Usp14 is essential for interaction with GAT1. In addition, these proteins showed specific interactions in the glutathione S-transferase (GST) pull-down assay. An antibody to GAT1 specifically co-immunoprecipitated Usp14 from mouse brain extracts. These results suggest that Usp14 may regulate the number of GAT1 at the cell surface.

염생식물 갯방풍의 화학적 성분연구

엄영란,이정임,이진혁,김해진,예성수,서영완,Um, Young-Ran,Lee, Jung-Im,Lee, Jin-Hyeok,Kim, Hae-Jin,Yea, Sung-Su,Seo, Young-Wan 대한화학회 2010 대한화학회지 Vol.54 No.6

우리나라 동해안에 서식하는 염생식물인 갯방풍으로부터 2개의 polyacetylene 화합물인 falcarindiol(1)과 falcarinol(2), 4개의 coumarin 화합물인 bergapten(3), xanthotoxin(4), umbelliferone(5), scopoletin(6) 및 1개의 sesquiterpene 화합물인 $(5\beta,10\alpha)$-lasidiol angelate(7)가 분리되었다. 이들 화합물 중 scopoletin(6)과 $(5\beta,10\alpha)$-Lasidiol angelate(7)는 갯방풍으로부터 처음 분리되어진 것이다. 분리된 화합물의 구조결정은 $^1H$ COSY, HMQC 그리고 HMBC와 같은 2D NMR 분광학적 실험과 문헌에 보고 된 값을 비교하여 이루어졌다. Two polyacetylenes (1 and 2), four coumarins (3-6), and one sesquiterpene (7) were isolated from the halophyte Glehnia littoralis. Particularly, compound 6 and 7 were isolated for the first time from Glehnia littoralis. Their chemical structures have been determined by extensive 2-D NMR experiments such as $^1H$, COSY, HMQC and HMBC and by comparison with the reported data in the literature.

Wdpcp, a Protein that Regulates Planar Cell Polarity, Interacts with Multi‐PDZ Domain Protein 1 (MUPP1) through a PDZ Interaction

Won Hee Jang(장원희),Young Joo Jeong(정영주),Sun Hee Choi(최선희),Sung Su Yea(예성수),Won Hee Lee(이원희),Mooseong Kim(김무성),Sang-Jin Kim(김상진),Sang-Hwa Urm(엄상화),Il Soo Moon(문일수),Dae-Hyun Seog(석대현) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.3

단백질-단백질 결합은 수용체 단백질, 효소, 세포 골격 단백질의 세포내 위치 결정 및 기능 조절에 중요한 역할을 한다. Postsynaptic density-95/disks large/zonula occludens-1 (PDZ) 도메인을 가진 단백질들은 시냅스 가소성, 신경세포 성장과 분화뿐만 아니라 많은 질병의 병태생리에 중요하게 관여하는 scaffold 단백질로 작용한다. Multi-PDZ domain protein 1 (MUPP1)은 13개 PDZ 도메인을 가지는 단백질로서 세포막 수용체 군집화, 신호전달 복합체 구성, 세포 골격 조정에 대한 매개 역할을 하는 것으로 알려지고 있지만 MUPP1의 세포 내 기능은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 MUPP1의 아미노 말단 PDZ 도메인과 결합하는 새로운 단백질을 규명하기 위하여 효모 two-hybrid 방법을 이용하였고 Wdpcp (전에 Fritz로 알려짐)이 MUPP1과 결합하는 것을 확인하였다. Wdpcp는 planar cell polarity (PCP) effector로서 세포 이동과 섬모형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. Wdpcp는 MUPP1의 첫 번째 PDZ 도메인과 결합하지만, 다른 PDZ 도메인과는 결합하지 않았다. 또한 MUPP1와 Wdpcp의 결합에서 Wdpcp의 C-말단부위가 결합에 필수적임을 효모 two-hybrid 방법으로 확인하였다. 이러한 단백질간 결합은 glutathione S-transferase (GST) pull-down assay, 공동면역침강, HEK-293T 세포에서의 발현위치를 통하여 추가적으로 확인하였다. 이러한 결과들은, MUPP1과 Wdpcp 결합은 세포내 액틴 다이내믹스(dynamics)와 세포이동 조절에 역할을 할 가능성을 시사한다. Protein-protein interactions regulate the subcellular localization and function of receptors, enzymes, and cytoskeletal proteins. Proteins containing the postsynaptic density-95/disks large/zonula occludens-1 (PDZ) domain have potential to act as scaffolding proteins and play a pivotal role in various processes, such as synaptic plasticity, neural guidance, and development, as well as in the pathophysiology of many diseases. Multi-PDZ domain protein 1 (MUPP1), which has 13 PDZ domains, has a scaffolding function in the clustering of surface receptors, organization of signaling complexes, and coordination of cytoskeletal dynamics. However, the cellular function of MUPP1 has not been fully elucidated. In the present study, a yeast two-hybrid system was used to identify proteins that interacted with the N-terminal PDZ domain of MUPP1. The results revealed an interaction between MUPP1 and Wdpcp (formerly known as Fritz). Wdpcp was identified as a planar cell polarity (PCP) effector, which is known to have a role in collective cell migration and cilia formation. Wdpcp bound to the PDZ1 domain but not to other PDZ domains of MUPP1. The C-terminal end of Wdpcp was essential for the interaction with MUPP1 in the yeast two-hybrid assay. This interaction was further confirmed in a glutathione S-transferase (GST) pull-down assay. When coexpressed in HEK-293T cells, Wdpcp was coimmunoprecipitated with MUPP1. In addition, MUPP1 colocalized with Wdpcp at the same subcellular region in cells. Collectively, these results suggest that the MUPP1-Wdpcp interaction could modulate actin cytoskeleton dynamics and polarized cell migration.

염주괴불주머니 (Corydalis heterocarpa) 추출물의 암세포 성장 억제 효과

김유아(You Ah Kim),이정임(Jung Im Lee),공창숙(Chang-Suk Kong),예성수(Sung Su Yea),서영완(Youngwan Seo) 한국생물공학회 2009 KSBB Journal Vol.24 No.2

본 연구에서는 염생식물의 한 종인 염주괴불주머니의 조추출물 및 용매별 분획물을 이용하여 생리활성물질에 의한 항발암성 물질의 생성 및 생체방어물질로서의 유용성을 토하고자 5종의 인체암세포 (AGS, HT1080, U-937, MCF-7 및 HT-29)에 대한 증식 억제효과를 검토하였다. 조추출물에 대한 암세포 증식 억제능 측정 결과, 10, 50 및 100 ㎍/㎖의 시료 처리 농도에서 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 경향을 확인하였으며, 모든 세포주에 대하여 methanol 조추출물 보다 methylene chloride 조추출물이 뛰어난 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, 물질의 극성에 따른 암세포 성장 억제능을 관찰하고자 조추출물을 순차적으로 용매 분획하여 H₂O, n-BuOH, 85% aq. MeOH 및 n-hexane의 네 가지 분획층을 얻었으며, 조추출물과 동일한 조건하에서 암세포 증식 억제능을 재검토하였다. 그 결과, n-BuOH 분획층보다 85% aq. MeOH 분획층에서 우수한 암세포 성장 억제능이 확인되어, 이는 비교적 비극성인 methylene chloride 조추출물로부터 활성성분들이 85% aq. MeOH 분획층으로 이동된 것으로 여겨졌다. 특히 100 ㎍/㎖의 85% aq. MeOH 분획층의 시료를 처리한 AGS 인체 위암세포는 93.4%라는 강력한 효력을 기록하였으며, 그 외에도 HT1080 인체 섬유육종 세포가 85.0%, U-937 인체 구성 림프종 세포 71.5%, MCF-7 인체 유방암세포와 HT-29 인체 결장암세포가 각각 51.7% 및 36.8%의 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 이상의 결과로부터 해양생물 중 염생식물의 한 종류인 염주괴불 주머니의 높은 항암활성효과와 함께 암예방 기능성 소재로써의 개발 가능성을 확인할 수 있었으며, 특히 염주괴불 주머니의 85% aq. MeOH 분획층에 대한 집중적인 연구를 통해 새로운 생리활성물질의 개발이 기대된다. Whole plants of Corydalis heterocarpa were extracted twice with CH₂Cl₂ and MeOH in turn. The combined crude extracts were concentrated in vacuo and then partitioned between CH₂Cl₂ and H₂O. The organic layer was fractionated with n-hexane and 85% aq. MeOH, and the aqueous fraction was also further fractionated with n-BuOH and H2O, successively. Growth inhibition effects of crude extracts and their solvent fractions were evaluated in AGS, HT1080, U-937, MCF-7 and HT-29 human cancer cells using MTT assay. The inhibitory effects of solvent fractions were increased in a dose-dependent manner. Among these tested samples, 85% aq. MeOH fraction showed the most potent inhibitory effect on the growth of human cancer cells. These results suggest that active compounds having much stronger anticancer effect can be isolated from Corydalis heterocarpa.

Lack of Association between Tumor Necrosis Factor-α-308 and -238 Promoter Polymorphisms and Chronic Hepatitis B Virus Infection

Won Hee Jang(장원희),Young-Il Yang(양영일),Youn Jae Lee(이연재),Jin Ho Chun(전진호),Sung Su Yea(예성수),Dae-Hyun Seog(석대현),Hyeong-In Kim(김형인) 한국생명과학회 2008 생명과학회지 Vol.18 No.9

Pro-inflammatory cytokine인 종양괴사인자-α (TNF-α)는 B형 간염바이러스(HBV) 감염에 대한 면역반응의 중요한 매개인자이다. TNF-α의 생산은 전사수준에서 주로 조절되며, TNF-α promoter 다형성은 TNF-α 유전자 발현을 변화시키기 때문에, TNF-α promoter 다형성이 만성 HBV 감염의 병태생리에 영향을 미칠 가능성이 높다. 그러므로I 본 연구에서는 TNF-α promoter 다형성과 만성 HBV 감염의 연관성을 조사하였다. 본 연구는 만성 HBV 감염환자 181명, HBV 감염이 자연적으로 치유된 201명, 그리고 건강한 대조군 170명을 대상으로 하였다. TNF-α promoter의 -308G/A와 -238G/A 다형성은 PCR-RFLP법을 통하여 분석하였다. 분석결과, 환자군에서 -308과 -238 유전자형의 분포는 자연치유군 및 건강대조군에서의 분포와 통계적인 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 또한, 그룹 간에 allele frequency도 통계적 차이가 없었다(p>0.05). 따라서, 본 연구의 결과는 한국인에서 TNF-α -308과 -238 promoter 다형성은 만성 B형 간염 바이러스 감염의 발생과 연관성이 없음을 시사한다. The pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor-α (TNF-α) is an important mediator of the immune response in hepatitis B virus (HBV) infection. Since the production of TNF-α is mostly regulated at the transcriptional level and polymorphisms in the TNF-α promoter alter its expression, TNF-α promoter polymorphisms could affect the pathogenesis of chronic HBV infection. In this study, we investigated the potential association of TNF-α promoter polymorphisms with chronic HBV infection. The study included 181 patients with chronic HBV infection, 201 persons who had been spontaneously recovered from hepatitis B, and 170 unrelated healthy controls. The -308G/A and -238G/A polymorphisms in the TNF-α promoter were analyzed by PCR-restriction fragment length polymorphism. The distribution of both the -308 and -238 genotypes in the patient group was not statistically different from that in the spontaneous recovery and control groups (p>0.05). There was also no significant difference in the allele frequency between the groups (p>0.05). The results suggest that the TNF-α -308 and -238 promoter polymorphisms are not associated with the development of chronic HBV infection in the Korean population.

마우스 간세포암 기원의 Hepa-1c1c7 세포주에서의 B형 간염 바이러스에 의한 TNF-α발현의 유도

예성수,장원희,양영일,이연재,김미성,백계형 인제대학교 2000 仁濟醫學 Vol.21 No.2

Infection with hepatitis B virus (HBV) is a major health problem worldwide. Although a tremendous amount has been known about HBV. there have been obstacles in the study of HBV due to the narrow host range of HBV limited to humans and primates. In the present study, we investigated the susceptibility to HBV infection of mouse hepatoma cell line, Hepa-Iclc7. In addition, based on that human hepatocytes infected by HBV increase the expression of the pro-inflammatory cytokine TNF-α, the inducibility of TNF-α expression by HBV in the cells was determined. HBV surface antigen (HBsAg) secretion was measured by the microparticle enzyme immunoassay and steady state mRNA expression was analyzed by quantitative competitive RT-PCR. Transient transfection of Hepa-1c1c7 cells with HBV expression vector resulted in a dose-dependent induction of TNF-α expression. Infection of Hepa-lclc7 cells with the serum of HBV carrier also increased TNF-α mRNA expression. Both in the transfected and infected cells, HBV mRNA was expressed and significant HBsAg secretion was detected. There was no significant variation in β-actin mRNA expression by HBV. These results demonstrate that HBV is infectious to Hepa-1c1c7 in nitro and the viral infection induces TNF-α expression, which suggests that Hepa- 1c1c7. a mouse hepatoma cell line, may be a possible model system for analysis of various molecular aspects of HBV infection.

RT-PCR 기법을 이용한 mRNA의 정량

예성수 인제대학교 백병원 2002 仁濟醫學 Vol.23 No.2

Although steady state levels of individual RNA transcripts have traditionally been measured by northern blotting, in situ hybridization and nuclease protection assays, these techniques are limited by their sensitivity. For analysis of mRNA expression, RT-PCR is very sensitive technique. It is capable of detecting moderately expressed transcripts from a single cell. Though mainly used for qualitative studies, several modifications of this method have been developed that allow quantitative analyses to be performed. Quantification of transcription via RT-PCR can be approached using either relative RT-PCR or competitive RT-PCR strategy. Quantification by relative RT-PCR involves normalization to a housekeeping gene that is amplified within the same reaction as the target gene. Competitive RT-PCR, as the name implies, utilizes synthetic competitor RNA within the same reaction as the sample RNA. Recently the introduction of the new procedure based on fluorescence-kinetic RT-PCR enables quantification of the PCR product in real-time. The newest form of quantitative RT-PCR is termed real-time RT-PCR, as measurements are taken throughout the reaction due to oligonucleotide cleavage by DNA polymerase that release a fluorescent dye. The purpose of this review is to summarize the RT-PCR-based quantification methods of mRNA expression for useful clinical applications.