들잔디 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase(EPSPS) 유전자 클로닝 및 특성

이혜정,이긍주,김동섭,김진백,구자형,강시용,Lee, Hye-Jung,Lee, Geung-Joo,Kim, Dong-Sub,Kim, Jin-Beak,Ku, Ja-Hyeong,Kang, Si-Yong Korean Society of Horticultural Science 2010 원예과학기술지 Vol.28 No.4

본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. This study is the first comprehensive report on the molecular cloning, structural characterization, sequence comparison between wild and mutant types, copy number in the genome, expression features and activities of a gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in Korean lawn grass ($Zoysia$ $japonica$). The full length cDNA of the EPSPS from Korean lawn grass ($zj$EPSPS) obtained from a 3' and 5' RACE method was 1540 bp, containing a 1176 bp ORF, a 144 bp leader sequence (5' UTR) and a 220 bp 3' UTR, which was eventually decoded 391 amino acid residues with a molecular mass of 41.74 kDa. The Southern blot detection of the $zj$EPSPS showed that the gene exists as a single copy in the Korean lawn grass genome. Sequence comparison of the $zj$EPSPS gene demonstrated that the glyphosate-tolerant mutant (GT) having a Pro-53 to Ser substitution in the gene seems to have a preferred binding activity of the enzyme to phosphoenol pyruvate(PEP) over glyphosate, which allows the continuous synthesis of aromatic amino acids in the shikimate pathway. From the Northern blotting analysis, the $zj$EPSPS was found to be highly expressed, with continuous increase until 36 hours after 0.5% glyphosate treatment in both wild and mutant samples, but 1.5-fold higher EPSP synthase activity was observed in the tolerant mutant when exposed to the glyphosate treatment. The molecular information of the $zj$EPSPS gene obtained from this study needs to be further dissected to be more effectively applied to the development of gene-specific DNA markers and zoysiagrass cultivars; nevertheless, the glyphosate-tolerant mutant having the featured $zj$EPSPS gene can be provided to turfgrass managers for weed problems with timely adoptable management options.

Cloning and Characterization of a 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) Gene from Korean Lawn Grass (Zoysia japonica)

Hye Jung Lee(이혜정),Geung-Joo Lee(이긍주),Dong Sub Kim(김동섭),Jin-Beak Kim(김진백),Ja Hyeong Ku(구자형),Si-Yong Kang(강시용) 한국원예학회 2010 원예과학기술지 Vol.28 No.4

본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. This study is the first comprehensive report on the molecular cloning, structural characterization, sequence comparison between wild and mutant types, copy number in the genome, expression features and activities of a gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in Korean lawn grass (Zoysia japonica). The full length cDNA of the EPSPS from Korean lawn grass (zjEPSPS) obtained from a 3' and 5' RACE method was 1540 bp, containing a 1176 bp ORF, a 144 bp leader sequence (5' UTR) and a 220 bp 3' UTR, which was eventually decoded 391 amino acid residues with a molecular mass of 41.74 kDa. The Southern blot detection of the zjEPSPS showed that the gene exists as a single copy in the Korean lawn grass genome. Sequence comparison of the zjEPSPS gene demonstrated that the glyphosate-tolerant mutant (GT) having a Pro-53 to Ser substitution in the gene seems to have a preferred binding activity of the enzyme to phosphoenol pyruvate(PEP) over glyphosate, which allows the continuous synthesis of aromatic amino acids in the shikimate pathway. From the Northern blotting analysis, the zjEPSPS was found to be highly expressed, with continuous increase until 36 hours after 0.5% glyphosate treatment in both wild and mutant samples, but 1.5-fold higher EPSP synthase activity was observed in the tolerant mutant when exposed to the glyphosate treatment. The molecular information of the zjEPSPS gene obtained from this study needs to be further dissected to be more effectively applied to the development of gene-specific DNA markers and zoysiagrass cultivars; nevertheless, the glyphosate-tolerant mutant having the featured zjEPSPS gene can be provided to turfgrass managers for weed problems with timely adoptable management options.

Selection and Physiological Characterization of Glyphosate-tolerant Zoysiagrass Mutants Derived from a Gamma Ray Irradiation

Hye Jung Lee(이혜정),Geung-Joo Lee(이긍주),Dong Sub Kim(김동섭),Jin-Beak Kim(김진백),Ja Hyeong Ku(구자형),Si-Yong Kang(강시용) 한국원예학회 2008 원예과학기술지 Vol.26 No.4

본 연구에서는 감마선 조사에 의한 들잔디 돌연변이체를 유기하기 위한 적정 조건을 확립하고 감마선에 의해 유도된 glyphosate 저항성 들잔디의 생리적 반응을 관찰하고자 하였다. 캘러스 돌연변이 유기를 위한 적정 방사선 선량은 50-70Gy 이며, 효율적인 캘러스 유도를 위해서는 2㎎・L<SUP>-1</SUP> 2,4-D와 0.1-0.5㎎・L<SUP>-1</SUP> BA를 혼합하여 사용하는 것이 효과적이었다. 하지만 방사선과 glyphosate를 동시에 처리할 경우 재분화체로의 유기가 불가능하여 방사선이 처리(300Gy)된 들잔디 종자에서 우선 재분화체를 얻고, 종자수확을 통해 얻어진 100 M2 계통에 glyphosate를 처리한 후 돌연변이체를 선발하는 방법이 성공적으로 적용됨을 알 수 있었다. 감수성 계통들은 0.5% glyphosate 농도의 제초제 처리시에 세포 전해질 유출(electrolyte leakage)과 지질막의 과산화에 의한 malondealdehyde(MDA) 함량이 저항성 선발계통에 비해 높게 나타났다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS) 효소활성 저해 작용을 알아본 결과 저항성 계통에서 공통적으로 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과 저항성 선발계통들은 높은 EPSPS 효소활성을 통해 방향족 아미노산의 원할하고 지속적인 합성과, 광합성 색소의 분해 작용에 대한 저항 기작을 통해 오랜 기간 동안(15일 이상) 건강하게 생존할 수 있었던 것으로 여겨진다. 따라서 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 저항성 계통들과 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. This study was conducted to determine the successful in vitro and in vivo conditions for a mutant induction of zoysiagrass (Zoysia japonica), and to observe the physiological responses of the selected mutants resistant to a glyphosate herbicide. A mutation induction under in vitro conditions was found to be achievable when combined with the gamma ray in zoysiagrass (2 ㎎・L<SUP>-1</SUP> 2,4-D and 0.1 to 0.5 ㎎・L<SUP>-1</SUP> BA with 50-70 Gy of a gamma ray). The electrolyte leakage (EL), malondealdehyde (MDA) and proline contents increased, while phyto pigments decreased with increasing glyphosate concentration, especially with 0.5-1.0% glyphosate level from 7 days after treatment. After the leaf blade of 100 M2 plants derived from a gamma ray treatment (300 Gy) was sprayed, three resistant and susceptible plants were selected and used to compare the physiological responses to a 0.5% glyphosate treatment. The EL was increased more in the susceptible plants than in the resistant mutants, while the MDA content was not evident statistically. The chlorophyll and carotenoid contents decreased in all the treated materials, with less reduction in the susceptible lines. The activity of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) was about 1.5-fold higher in the resistant mutants, allowing them resistance to glyphosate blocking the synthesis of aromatic amino acids. In those selected resistant mutants, more extended days of green leaves were observed after the glyphosate treatment, which allows economic and environmental savings and provides with more flexible management options.