Bacillus subtilis WL-8의 Mannanase 유전자 클로닝과 특성분석

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2010 미생물학회지 Vol.46 No.2

전통 발효식품인 된장으로부터 mannanase의 생산균으로 분리된 WL-8 균주는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA의 염기서열에 근거하여 Bacillus subtilis로 동정되었다. B. subtilis WL-8은 locust bean gum 보다는 밀기울이 첨가된 LB 배지에서 mannanase 생산성이 높았으며, 24시간 배양하였을 때 약 20 U/ml에 이르렀다. 분리균 WL-8의 mannanase 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 WL-8의 mannanase는 GH family 26에 속하며 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. B. subtilis WL-8의 mannanase 유전자를 함유한 재조합 대장균의 배양상등액과 균체파쇄상등액을 사용하여 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였으며, $60^{\circ}C$보다 높은 온도에서 배양상등액보다는 균체파쇄상등액에 존재하는 mannanase가 더 높은 활성을 보였다. A bacterium producing the extracellular mannanase was isolated from Korean soybean paste. The isolate WL-8 has been identified as Bacillus subtilis on the basis on its 16S rRNA sequence, morphology and biochemical properties. The mannanase productivity of strain WL-8 was increased in LB broth by addition of wheat bran. The maximum mannanase productivity was reached to approximately 20 U/ml in LB medium supplemented with 6% wheat bran. A gene encoding the mannanase of WL-8 was cloned into Escherichia coli and its nucleotide sequence was subsequently determined. The mannanase gene consisted of 1,086 nucleotides encoding a polypeptide of 362 amino acid residues. The deduced amino acid sequence was highly homologous with those of several mannanases from B. subtilis belonging to GH family 26. Reaction temperature and pH profiles were investigated using the culture filtrate and cell-free extract of the recombinant E. coli carrying a WL-8 mannanase gene, respectively. Optimal conditions for the two fractions occurred at pH 5.5 and $60^{\circ}C$. The cell-free extract showed higher mannanase activity than the culture filtrate at above $60^{\circ}C$.

Microbacterium sp. 분리균의 Hemicellulases 생산성과 효소특성

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2011 미생물학회지 Vol.47 No.3

유일 탄소원으로 palm kernel meal (PKM)과 밀기울을 함유한 최소배지에서 농후배양하여 작물 재배 토양으로부터 xylan과 locust bean gum (LBG)에 대한 분해활성이 있는 균을 분리하였다. 분리균 YB-1106의 16S rRNA 유전자 염기서열을 조사한 결과 Microbacterium arabinogalactanolyticum와 98% 유사도를 보였다. 분리균의 xylanase는 밀기울, oat spelt xylan, 미강 및 xylose와 같은 부가탄소원에 의해 생산성이 증가된 반면에 mannanase는 LBG와 PKM에 의해 생산성이 증가되었다. 특히 Xylanase는 밀기울 2%를 첨가한 배지, mannanase는 1% LBG를 첨가한 배지에서 각각 생산성이 가장 높았으며 모두 정지기에서 생산이 되었다. 분리균의 배양 상등액은 $50^{\circ}C$와 pH 6.0에서 mannanase의 최대활성을 보였으며, $50^{\circ}C$와 pH 6.5에서 xylanase의 최적반응 활성을 나타냈다. Mannanase에 의해 분해된 LBG와 xylanase에 의해 분해된 xylan으로부터 각각 분해산물로 올리고당이 관찰되었다. A bacterium producing the extracellular mannanase and xylanase was isolated from Korean farm soil by successive subcultures in a minimal medium supplemented with palm kernel meal (PKM) and rice bran. The isolate YB-1106 showed 98% similarity with Microbacterium arabinogalactanolyticum on the basis of 16S rRNA gene sequences. The additional carbohydrates including locust bean gum (LBG) and PKM increased the mannanase productivity of the YB-1106, while the xylanase productivity of the isolate was increased by wheat bran, oat spelt xylan, rice bran and xylose. Particularly, maximum mannanase and xylanase activities were obtained in the culture filtrate of tryptic soy broth supplemented with 1% LBG or 2% wheat bran, respectively. Both enzyme activities were produced at stationary growth phase. The mannanase of culture supernatant was the most active at $50^{\circ}C$ and pH 6.0, while xylanase of culture supernatant was the most active at $55^{\circ}C$ and pH 6.5. The predominant products resulting from the mannanase or xylanase hydrolysis were oligosaccharides for LBG or xylan, respectively.

Paenibacillus woosongensis의 Xylanase 유전자 클로닝과 특성분석

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2012 미생물학회지 Vol.48 No.2

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 대장균에 클로닝하였다. Xylanase 유전자는 211 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 633 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85-89% 상동성을 보였다. Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내 외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다. A gene encoding the xylanase (XynA) predicted from partial genomic sequence of Paenibacillus woosongensis was cloned into Escherichia coli by PCR. This xynA gene consisted of 633 nucleotides, encoding a polypeptide of 211 amino acid residues. The deduced amino acid sequence exhibited 85-89% identity with those of several Paenibacillus xylanases, belonging to the glycosyl hydrolase family 11. As a results of expression of the structural gene by T7 promoter of a pET23a(+) expression vector, xylanase activity was higher in cell-free extract than culture filtrate of a recombinant Escherichia coli BL21(DE3) CodonPlus. However, the expression level of xylanase was not sufficient be detected by SDS-PAGE. The cell-free extract showed maximal xylanase activity at $60^{\circ}C$ and pH 5.5. The predominant products resulting from xylan and xylooligosaccharide hydrolysis were xylose and xylotriose. The enzyme could hydrolyze xylooligosaccharides larger than xylbiose.

Paenibacillus woosongensis의 만난분해 효소활성

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2010 미생물학회지 Vol.46 No.4

만난의 분해활성을 갖는 Paenibacillus woosongensis의 배양 상등액으로부터 mannanase, ${\beta}$-mannosidase와 ${\alpha}$-galactosidase 활성이 관찰되었다. 배양상등액 내의 locust bean gum를 분해하는 mannanase는 pH 5.5와 $60^{\circ}C$, para-nitrophenyl-${\beta}$-D-mannopyranoside를 분해하는 ${\beta}$-mannosidase는 pH 6.5, $50^{\circ}C$, para-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside를 분해하는 ${\alpha}$-galactosidase는 pH 6.0-6.5와 $50^{\circ}C$에서 각각 최대활성을 보였다. 배양상등액의 만난 분해효소는 mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당을 분해할 뿐 아니라 mannobiose도 분해하였다. 또한 melibiose, raffinose, stachyose 등의 ${\alpha}$-1,6 결합형 galacto-oligosaccharides를 분해하여 galactose를 생성하였다. 이러한 결과로 보아 P.woosongensis는 galactomannan을 완전히 분해하는데 필요한 3종류 효소를 모두 생산하는 것으로 판단된다. The activities of mannanase, ${\beta}$-mannosidase, and ${\alpha}$-galactosidase were detected in culture filtrate of Paenibacillus woosongensis showing mannanolytic activity for locust bean gum. Optimal conditions occurred at pH 5.5 and $60^{\circ}C$ for mannanase toward locust bean gum, pH 6.5 and $50^{\circ}C$ for ${\beta}$-mannosidase toward para-nitrophenyl-${\beta}$-D-mannopyranoside, and pH 6.0-6.5 and $50^{\circ}C$ for ${\alpha}$-galactosidase toward para-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside in the culture filtrate, respectively. The mannanolytic enzyme of culture filtrate hydrolyzed mannobiose as well as manno-oligosaccharides including mannotriose, mannotetraose, mannopentaose and mannohexaose. It could also hydrolyze ${\alpha}$-1,6 linked galacto-oligosaccharides such as melibiose, raffinose and stachyose to liberate galactose residue. From these results, it is assumed that P. woosongensis produces three enzymes required for the complete decomposition of galactomannan.

Corynebacterium lactofermentum에서 Bacillus subtilis의 Mannanase 유전자 발현

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물·생명공학회 2009 한국미생물·생명공학회지 Vol.25 No.4

A Bacillus subtilis mannanase gene was subcloned into an Escherichia coli- Corynebacterium lactofermentum shuttle vector pHE83, and the resultant plasmid pHE83M was transferred into an endogenous plasmid-free strain of C. lactofermentum. Mannanase produced by the recombinant C. lactofermentum (pHE83M) was secreted extracellulary at the level of 86%, and the remaining activity of mannanase was detected in the cell-free extract. The maximum mannanase productivity of the recombinant strain reached 8.1 unit/mL in the culture filtrate of LB medium. According to the zymogram of mannanase on SDS-PAGE, it was found that the mannanase produced by the recombinant C. lactofermentum could be maintained stably with a migration identical to the mannanase produced by the parental strain, B. subtilis WL-3.

Bacillus amyloliquefaciens 분리균의 Mannanase 생산성과 효소특성

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2014 미생물학회지 Vol.50 No.2

In the acidic LB plate, a bacterial strain was isolated from homemade soybean paste as a producer of the extracellular mannanase. The isolate YB-1402, which was a Gram-positive rod-shaped bacterium with spore, has been identified as Bacillus amyloliquefaciens on the basis of its 16S rDNA sequence and biochemical properties. Maximum mannanase productivity of the isolate YB-1402 was reached approximately 150 U/ml in LB broth supplemented with konjac (3.0%). The molecular mass of YB-1402 mannanase was estimated to approximately 38.0 kDa by zymogram of the culture filtrate on SDS-PAGE. The mannanase of culture filtrate was the most active at $55^{\circ}C$ and pH 5.5. The mannanase activity was completely maintained after pre-incubation at pH 3.0 to 10.0 for 1 h. The predominant products resulting from the mannanase hydrolysis were mannose, mannobiose and mannotriose for LBG or mannooligosaccharides. The enzyme could hydrolyze mannooligosaccharides larger than mannobiose. 된장으로부터 mannanase 생산균으로 산성 배지에서 분리된 YB-1402는 그람양성 간균으로 포자를 형성하며, 16S rDNA 염기서열과 생화학적 성질이 Bacillus amyloliquefaciens와 가장 높은 유사도를 보였다. 분리균 YB-1402는 konjac을 3% 첨가한 LB 액체배지에서 약 150 U/ml의 최대 mannanase 생산성을 보였다. 분리균의 배양상등액을 사용하여 SDS-PAGE 활성염색을 실시한 결과 분자량이 약 38 kDa로 추정되는 한 종류의 mannanase만이 관찰되었으며, $55^{\circ}C$와 pH 5.5 반응조건에서 mannanase의 최대활성을 보였다. 특히 mannanase는 pH 3.0-10의 범위에서 1시간 방치하였을 때 실활되지 않은 특성을 지니고 있었다. Locust bean gum과 mannooligosaccharides를 mannanase로 분해하였을 때 mannose, mannobiose와 mannotriose가 최종 분해산물로 관찰되었으며 mannotriose 이상의 중합도를 갖는 mannooligosaccharides를 분해하는 것으로 확인되었다.

미생물 일반 , 생리 및 대사 Cellulase 를 생산하는 Bacillus sp . 79 - 23 분리와 효소 생산성

윤기홍,정경화,박승환 ( Ki Hong Yoon,Kyong Hwa Jung,Seung Hwan Park ) 한국미생물생명공학회 1997 한국미생물·생명공학회지 Vol.25 No.6

Fabry-Perot 레이저의 자기궤환 레이저 발진을 이용한 광섬유 길이 측정법

윤기홍,송재원,김현덕,Yoon Ki-Hong,Song Jae-Won,Kim Hyun Deok 대한전자공학회 2004 電子工學會論文誌-SD (Semiconductor and devices) Vol.41 No.12

본 논문에서는 폐경로를 통한 Fabry-Perot 레이저의 자기궤환 레이저 발진 현상을 이용하여 새로운 광섬유 길이 측정 방법을 제안하였다. Fabry-Perot 레이저에 변조전류를 인가하여 생성된 광펄스를 피측정 광섬유를 포함하는 폐경로를 통과한 후 다시 레이저로 입사시키면 특정 변조주파수에서 자기궤환 레이저 발진이 유도될 수 있다. 제안된 측정법에서는 특정 모드에서 자기궤환 레이저 발진을 유도하기 위한 변조주파수들을 측정하고, 이 변조주파수들 사이의 차를 이용하여 광섬유의 길이를 계산하도록 한다. 제안된 측정법을 이용하여 0.1 ∼ 75 km 범위의 피측정 광섬유의 길이 측정을 수행하였고, 측정결과는 기존의 상용 계측기를 사용한 측정 결과와 잘 일치함을 실험적으로 검증하였다. 상용 계측기와의 상대 오차는 0.24 % 이하였고, 반복측정오차(repeatability)는 0.1 % 보다 작았다. A simple fiber length measurement technique has been demonstrated by using a self-seeding laser oscillation of a Fabry-Perot laser diode. We induced a self-seeding laser oscillation through a closed-loop by adjusting the modulation frequency of a Fabry-Peort laser diode when the output optical pulse of the laser reinjected into the laser after passing through the closed-loop. The length of a fiber-under-test was calculated from the difference between my two modulation frequencies at which self-seeding laser oscillation occurs at a specific mode. We have experimentally confirmed the technique for various fiber lengths from 0.1 km to 75 km. The relative error between the measurement result of the proposed technique and that of a commercial instrument was less than 0.24 %. The repeatability of the proposed technique was better than 0.1 %.

Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase C 유전자의 클로닝과 효소 특성

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물학회 2018 미생물학회지 Vol.54 No.2

여러 종류의 mannanase를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase B를 암호하는 manB 유전자와 효소의 특성이 보고된 바 있다. Mannanase C (ManC)로 명명한 효소의 유전자가 manB 유전자의 하류에 위치한 것으로 예상되어 이를 중합효소 연쇄반응으로 클로닝하여 manC 유전자의 염기서열을 결정하였다. ManC는 448 아미노산 잔기로 구성된 것으로 확인되었으며 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역(CBM2)이 존재하였다. ManC의 활성영역은 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) 및 S. thermoluteus (57.6%; BAM62868)의 mannanase와 아미노산 배열의 상동성이 55% 이상으로 가장 높았다. Signal peptide 영역이 제거되고 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged ManC (HtManC)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtManC를 정제하였다. HtManC은 $65^{\circ}C$와 pH 7.5에서 최대 활성을 보였으며 pH 7.5~10범위에서 활성에 큰 변화가 없었다. HtManC는 locust bean gum (LBG)과 konjac에 대한 분해 활성이 guar gum과 ivory nut mannan (ivory nut)에 비해 높았다. 최적 반응조건에서 LBG를 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 Vmax와 Km이 68 U/mg과 0.45 mg/ml로 나타났다. HtManC에 의한 만노올리고당(MOS)과 mannan의 분해산물을 TLC로 관찰한 결과 mannobiose 보다 중합도가 큰MOS로부터 mannobiose와 mannotriose가 주된 분해산물로 생성되었다. 또한 LBG, konjac과 ivory nut의 분해산물로 mannobiose와 소량이 mannose가 공통적으로 관찰되었다. The characteristics of enzyme and gene for mannanase B had been reported from Cellulosimicrobium sp. YB-43 producing some kind of mannanase. A gene coding for the enzyme, named mannanase C (ManC), was expected to be located downstream of the manB gene. The manC gene was cloned by polymerase chain reaction and sequenced completely. From this nucleotide sequence, ManC was identified to consist of 448 amino residues and contain a carbohydrate binding domain CBM2 besides a catalytic domain, which was homologous to mannanase belonging to the glycosyl hydrolase family 5. The catalytic domain of ManC showed the highest amino acid sequence similarity of 55% with the mannanases from Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) and S. thermoluteus (57.6%; BAM62868). The His-tagged ManC (HtManC) lacking N-terminal signal peptide with hexahistidine at C-terminus was produced and purified from cell extract of recombinant Escherichia coli. The purified HtManC showed maximal activity at $65^{\circ}C$ and pH 7.5, with no significant change in its activity at pH range from 7.5 to 10. HtManC showed more active on konjac and locust bean gum (LBG) than guar gum and ivory nut mannan (ivory nut). Vmax and Km values of the HtManC for LBG were 68 U/mg and 0.45 mg/ml on the optimal condition, respectively. Mannobiose and mannotriose were observed on TLC as major products resulting from the HtManC hydrolysis of mannooligosacharides. In addition, mannobiose and mannose were commonly detected as the hydrolyzed products of LBG, konjac and ivory nut.

Xylanase를 생산하는 Streptomyces sp. YB914의 특성과 효소 생산성

윤기홍,Yoon, Ki-Hong 한국미생물·생명공학회 2009 한국미생물·생명공학회지 Vol.25 No.4

토양으로부터 세포외로 xylanase를 분비 생산하는 방선균 YB-914가 분리되었으며, 형태, 배양, 생화학적 특성을 조사한 결과 Streptomyces 속 균주로 확인되었다. 분리균의 배양상등액에 존재하는 xylanase는 pH 5.5과 $55^{\circ}C$의 반응조건에서 반응성이 가장 높았으며, pH 4.5~7.0 범위에서 최대활성의 80% 이상을 나타냈다. Xylanase의 생산을 위한 배지를 최적화하기 위해서 G.S.S 배지성분을 여러 종류의 탄수화물로 대체하였다. Oat spelt xylan, corn cob xylan, 밀기울 및 유당과 같은 탄수화물은 Streptomyces sp. YB914의 xylanase 생산성을 증가시키는 것으로 확인되었으며, galactose와 arabinose는 효소 생산을 크게 억제하였다. Oat spelt xylan(1%)와 유당(1.5%)을 함유한 변형배지에서 xylanase의 최대생산성이 48 U/mL로 확인되었다. A strain YB914 was isolated from soil as a producer of the extracellular xylanase, which catalyzes the hydrolysis of oat spelt xylan. The strain YB914 was identified as Streptomyces sp. on the basis of its morphological, cultural and biochemical properties. The xylanase of culture filtrate was the most active at $55^{\circ}C$ and pH 5.5, and retained 80% of its maximum activity at the range of pH 4.5~7.0. In order to optimize the culture medium for xylanase production, ingredients of G.S.S medium were replaced by several carbohydrates. The carbohydrates such as oat spelt xylan, corn cob xylan, wheat bran and lactose increased the xylanase productivity of Streptomyces sp. YB914. However, xylanase production was greatly repressed by galactose or arabinose. The maximum xylanase productivity was reached to 48 U/mL in the modified medium containing 1% oat spelt xylan and 1.5% lactose.