In vitro and in vivo expression of human coagulation factor IX mediated by nonviral transfection of three plasmid vectors coding a factor IX gene : 혈액응고인자 IX 유전자를 함유한 세 가지 플라즈미드의 비바이러스성 유전자 전달을 통한 체외와 체내에서의 응

한대종 연세대학교 대학원 2003 국내석사

B형 혈우병은 X 염색체에 위치한 혈액응고인자 IX 유전자의 손상에 의해 혈액 응고인자가 생성되지 못하여 생기는 유전병으로 현재는 혈소판 농축액을 주입하여 일시적인 치료를 하고 있다. 그러나 이런 치료방법은 바이러스 감염 등의 부작용을 일으킬 수 있어 상대적으로 안전하고 경제적인 치료방법으로 여겨지는 유전자 치료 방법을 연구하고 있다. B 형 혈우병 유전자 치료는 응고인자 IX의 혈액내 수치를 최소 치료 농도인 5%이상의 발현을 목표로 하고 있다. 우선 세 가지 유전자발현 벡터 pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, pCIneo-hFIX 를 제조하고, 이 세 가지 벡터의 효율을 비교하기 위해 세 가지 양이온지질 DOTAP, DMDK, DMEK와 여러 비율로 섞어서 293 cell에 유전자를 전달하고 최적의 조건을 확립하였다. 또한 같은 유형의 실험을 HepG2 cell과 Chang cell에서도 시행하였다. 그 결과 체외 유전자 전달에서는 DMDK 와 DMEK를 이용한 pAAVCMV-hFIX의 발현이 181 ng/㎖까지 이르러 가장 높게 발현되었으며, 같은 조건에서 HepG2 cell과 Chang cell에서 보다 높게 발현되었다. 이 수치는 DOTAP 을 이용했을 경우보다 1.8배 높게 발현된 수치였다. 같은 실험조건에서 벡터만을 비교했을 경우는 pAAVCMV-hFIX가 pFLAG-hFIX보다 1.37배, pCIneo-hFIX보다 1.17배 높게 발현되었다. 종합적으로 볼 때 pAAVCMV-hFIX을 DMDK나 DMEK 을 이용하여 유전자 전달했을 경우 가장 우수한 체외 유전자 발현이 관찰되었다. 발현된 응고인자 IX의 단백질 기능을 확인키 위해 aPTT 실험을 하였다. pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, pCIneo-hFIX에서 발현된 응고인자를 응고인자 IX 결핍 혈장에 섞었을 때 혈장응고가 각각 68.8초, 65.7초, 64.9초에 일어남에 따라 정상기능의 응고인자 IX이 발현됨을 알 수 있었다. 마우스체내에서의 발현을 확인하기 위해 각 벡터를 Hydrodynamics 방법으로 주사하여 유전자 발현율을 비교하였다. 그 결과 유전자 전달 24시간 후에 pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, pCIneo-hFIX vector는 각각 2250ng/㎖, 750 ng/㎖, 1860 ng/㎖의 응고인자 IX을 발현하였다. 체외유전자 전달에서와 마찬가지로 pAAVCMV-hFIX이 가장 높은 발현을 보였으며 5일째까지도 1170 ng/㎖의 발현을 유지하였다. 체내와 체외에서 발현된 factor IX은 SDS-PAGE와 Western blot analysis로 정성분석 하였고, ELISA로 정량하였다. Hydrodynamic 유전자 전달로 인한 간 손상여부를 분석하기 위해 ALT, AST, Total bilirubin 측정을 하였는데 일시적인 ALT, AST수치 상승만을 보이고 5일 내에 정상으로 돌아와 비교적 안전함을 확인하였다. 세 가지 유전자 vector를 비교한 결과 pAAVCMV-hFIX이 가장 우수한 것으로 확인되었으며 이러한 실험결과들은 혈우병에 대한 유전자 치료의 기초 자료로 이용될 수 있을 것이다. Gene therapy for hemophilia B is an attractive treatment because the current method of repeated infusion of purified factor IX concentrates has a high risk of viral infection and also is very expensive and inconvenient.The goal of the hemophilia B gene therapy is to introduce a continuous supply of factor IX at a therapeutic level. In this thesis, the efficiencies of three plasmid vectors containing human factor IX gene (pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, and pCIneo-hFIX) transferred with three different cationic liposomes (DOTAP 1,2-dioleoyloxyproryl-3-N,N,N-trimethylammonium chloride, DMDK dimyristyl aspartyl lysine, and DMEK dimyristoyl-glutamyl-lysine) were compared to each other. Under the optimized in vitro transfection conditions for 293 cells, transfection of pAAVCMV-hFIX with DMDK liposomes vector was able to produce approximately 181 ng factor IX/106 cells (3.6% of normal factor IX level) at 5 days post transfection. At the same conditions, pFLAG-hFIX and pCIneo-hFIX were expressed 132 ng factor IX/106 cells ,155 ng factor IX/106 cells, respectively. The DMDK and DMEK liposomes exhibited a similar gene transfection efficiency in 293 cells and Chang cells. The expression level of human factor IX transfected with the DMEK or DMDK liposomes was 1.8-fold higher than that with DOTAP-based liposomes. Among the DNA vectors, pAAVCMV-hFIX exhibited the highest expression of human factor IX which was 1.37-fold and 1.17-fold higher than pFLAG-hFIX and pCIneo-hFIX, respectively. The factor IX protein expressed by three different vectors showed clotting activity which was assayed by an aPTT test. When 100 ㎕ culture medias transfected with pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, or pCIneo-hFIX in 293 cells was mixed with 100 ㎕ of factor IX-deficient human plasma, their clotting times were shorten to 68.8, 65.7, and 64.9 seconds. Furthermore, to evaluate in vivo expression efficiencies of the three plasmids containing human factor IX gene, the DNA vectors were administerred to C57BL/6 mice by the hydrodynamics method. The pAAVCMV-hFIX, pFLAG-hFIX, or pCIneo-hFIX administerred by the hydrodynamics method was able to express the human factor IX at the levels of 2250 ng factor IX/㎖, 750 ng factor IX/㎖, and 1860 ng factor IX/㎖24 hours post injection, respectively. The expression levels were equivalent to 15∼45% of the factor IX level in normal blood. However, 5 days later, only the mice transfected with pAAVCMV-hFIX maintained the expresseion level at 1170 ng factor IX/㎖ while the mice transfected with the other vectors showed substantially diminished their gene expression. The expression of factor IX protein was maintained only for a week. This may be due to its degradation by anti-human factor IX antibodies induced by stimulation of the expressed human factor IX. Anti-human factor IX antibodies were detected by an indirect ELISA and its level was 100-200 ng/㎖ in all three vectors at 5 days post transfection and maintained for 28 days. This hydrodynamics gene transfer of hFIX plasmid DNA into liver elicited neither transgene specific cytotoxic effect nor long-term toxicity. In summary, among the tested DNA vectors and cationic liposomes, the combination of pAAVCMV-hFIX and DMDK or DMEK liposomes was a primary choice for further preclinical experiment of hemophilia B gene therapy.

Growth inhibition of pathogenic enteric bacteria and hepatocellular carcinoma Huh7 cells by probiotics

한대종 서강대학교 대학원 2015 국내박사

Lactobacillus casei (L. casei) 와 Pediococcus acidilactici (P. acidilactici) 균주는 유제품에 많이 사용되는 프로바이오틱 유산균으로서 생물치료 요법에 효능이 많이 보고되었고 또한 사람의 장내세균을 억제하여 면역 증강에 많이 사용되고 있다. L. casei 는 많은 종류의 암세포에 항암효과가 있다고 알려져 있으나 L. casei 가 간암세포에 효과가 있다고는 현재 알려져 있지 않다. L. casei 의 Huh7 간암세포의 성장억제는 대조군에 비하여 약 77% 의 성장억제 효과를 보였으며 이러한 이유로는 G2/M 세포주기에 L. casei 를 처리한 Huh7 간암세포가 약 3% 정도 증가하였고 세포사멸도 5% 정도 증가하였기 때문이다. 마찬가지로 TNFR1 과 DR3 mRNA 발현율과 P21, P27 의 단백질의 양도 대조군에 비해 현저하게 증가됨을 볼 수 있었다. 그러나 side population 은 특이하게 변화되는 것이 관찰되지는 않았다. ATP-binding cassette transporter subfamily A (ABCA) mRNA 의 발현율을 비교한 결과 대조군에 비해 현저히 증가되지 않았으며 이는 L. casei 추출물이 Huh7 간암세포의 항암제에 대한 특이적인 세포외부로 배출이 적음을 나타낸다. L. casei 추출물은 Huh7 간암세포 외부로 배출되고 항암효과를 나타내었으며 아울러 Huh7 간암세포의 내재적 면역과 관계된 IL-8 사이토카인의 mRNA 와 단백질 증가를 야기시켰다. nano LC/MS 기술을 이용하여 L. casei 추출물이 처리된 Huh7 간암세포의 전체 단백질을 분석한 결과 Heat shock protein 의 수치가 대조군에 비해 상당히 많이 증가됨을 볼 수 있었다. Pediococcus acidilactici J9 은 청국장과 같은 콩으로 만든 발효 음식에 많이 있으며 영양공급원으로 많이 이용되고 있다. 이러한 발효군들은 장내 미생물 평형을 유지하여 건강에 이로운 효과를 주고 있다. 페디오신이라는 물질은 항생단백으로서 병원성균을 억제하고 자연에서 비교적 안정적으로 존재한다. 그 중 Pseudomonas aeruginosa 와 Salmonella paratyphi A 는 Pediococcus acidilactici J9 에 의해 많은 성장 억제효과를 보였다. 더욱이 Pediococcus acidilactici J9 과 Salmonella paratyphi A 를 같이 배양하였을 경우 병원성 살모넬라균이 대부분 증식억제가 되었다. 간암세포에 대하여 Pediococcus acidilactici J9 의 항암효과를 보기 위하여 간암세포에 처리한 결과 약 60% 성장 억제 효과가 관찰되었다. 또한 유세포분석을 한 결과 간암세포가 14% 정도 세포사멸이 높은 것으로 판명되었다. 이러한 세포사멸 기전을 관찰하고자 death receptor 의 mRNA 발현율을 비교한 결과 TNFR1 의 증가가 확연하게 증명되었다. 세포사멸기전을 보기 위하여 관련 단백질을 비교하였을 때 caspase-3, -9 는 변화하지 않았고, caspase-8 이 증가하였으며Cleaved RARP, JNK, Bcl-2, and Akt 도 감소하였다. Pediococcus acidilactici J9 extract 을 처리한 간암세포는 IL-8 의 증가가 정상군에 비하여 대단히 높았다. 이러한 이유로 Pediococcus acidilactici J9 extract 은 병원성 세균에 대한 항생효과와 간암세포에 대한 항암효과를 가진 치료적인 약물에 대한 후보물질로 제시한다. 프로바이오틱스 균주의 결과를 종합하여 볼 때, L. casei 와 P. acidilactici J9 균주는 병원성세균에 대한 항균효과와 간암세포에 대한 항암효과가 높아 항균제와 항암제로서의 높은 가능성을 가지고 있다는 것을 확인하였으면 이 두 가지 균주는 프로바이오틱스 산업에 효과적인 제품군으로 개발 및 활용이 가능함을 제시한다. Lactobacillus casei (L. casei) and Pediococcucs acidilactici J9 are Probiotics and a lactic acid bacterium (LAB) that is widely used in dairy fermentations, and has many useful effects in protection and enhancement of biotherapeutic activities in our body. L. casei is also known to have anti-proliferation effects on many types of cancer cells. However, the effect of L. casei on the liver cancer has not been reported. In this study, the cellular extract of L. casei was used to know the effects between the Huh7 human hepatoma cell and its viability after treating the extract of L.casei. The growth rate of Huh7 cells treated with the cellular extract of L. casei was decreased by 77%, compared to the control group. The reason why cell viability was decreased in the bacterial extract-treated Huh7 cells group is thought that the rate of arrested Huh7 cells at G2/M phase and apoptosis were increased by 3% and 5% respectively compared to the control group. The expression level of TNFR1 and DR3 mRNA as well as P21 and P27 cell cycle protein were increased compared to the control group. In the case of side population cells, any remarkable changes were not observed. ATP-binding cassette transporter subfamily A (ABCA) mRNA expression levels were not increased that it did not work for pumping out for the L. casei extract to the extracellular space. L. casei extract effects to the Huh7 cells without an outflow. L. casei extract-treated Huh7 cells exhibited significant increases in protein and mRNA expression levels of IL-8. When total proteins were analyzed by nanoscale liquid chromatography & electrospray quadruple–time of flight Mass spectrometer (nano LC/MS), heat shock proein (HSP) level was significanlty incereased comparing with control groups. Pediococcus acidilacticiis is now used widely in nutritional supplements like as bean paste soup prepared with ground fermented soybeans in Korea. In this study, Pediococcus acidilactici J9 extract was loaded on the 6 mm disc to test the pathogenic bacteria growth inhibition. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Salmonella paratyphiA ATCC 9150 had a great antimicrobial susceptibility against 10 μg of Pediococcus acidilactici J9 extract disc. These inhibition zones of each bacterium were as efficient as commercially used antimicrobial agents. Furthermore, when co-culture with Pediococcus acidilactici J9 extract solution and Salmonela paratyphi A ATCC9150, Pediococcus acidilactici J9 extract inhibited the growth of Salmonela paratyphi A ATCC9150 and had a potent bactericidal activity. For the testing about hepatocellular carcinoma inhibition, Huh7 cells were used and the growth rate was compared with 0.1 mg Pediococcus acidilactici J9 extract treated groups and control groups. The growth rate of Pediococcus acidilactici J9 extract treated Huh7 cells was considerably lower (60%) than control groups. Pediococcus acidilactici J9 extract increased the rate of arrested Huh7 cells in the S phase by 3.25% compared with the control group. Especially, Huh7 cells treated with Pediococcus acidilactici J9 extract were found great increment in the late apoptosis. The cell death rate was found to be increased by 14% in the treated group compared with the control groups. In addition, Huh7 cells treated with Pediococcus acidilactici J9 extract significantly increased in mRNA expression levels of TNFR1 death receptor. Caspase-3 and -9 levels were unchanged, while caspase-8 increased after treatment of Huh7 cells with Pediococcus acidilactici J9 extract. Additionally, Cleaved RARP, JNK, Bcl-2, and Akt were also decreased. Consequently, Huh7 cells treated with Pediococcus acidilactici J9 extract were induced cell death by JNK, Bcl-2 decreasing and Caspase-8 increasing manner. Pediococcus acidilactici J9 extract treated Huh7 cells exhibited significant increases in mRNA expression levels of IL-8. For these reasons, Pediococcus acidilactici J9 extract possess a potent anti-microbial effects on the pathogenic enteric bacteria and anti-tumor effects on the viability of liver cancer cells. In conclusion, Probiotics including Lactobacillus casei and Pediococcus acidilactici J9 possess a potent anti bacterial effect to the pathogenic enteric bacteria and anti-tumor effect on the viability of liver cancer cells.