재조합효모를 이용한 배양 중 pH 변화에 따른 인간 라이소자임의 대량생산

최선욱(Sun Uk Choi),이승철(Seung Cheol Lee),황용일(Yong II Hwang) 경남대학교 기초과학연구소 1998 慶南大學校 基礎科學硏究所 硏究報告 Vol.12 No.-

재조합 Saccharomyces cerevisiae에서 Permeabilizing Agent를 이용한 HLY의 분비촉진

최선욱(Sun-Uk Choi),하정욱(Jung-Uk Ha),황용일(Yong-Il Hwang) 한국식품영양과학회 1999 한국식품영양과학회지 Vol.28 No.2

배양 말기까지 세포내에 30% 이상 존재하는 유전산물인 HLY를 효과적으로 분비를 유도하기 위해 다섯가지의 permeabilizing agent-CaCl₂, ethanol, Tween 80, Triton X-100, CTAB-를 사용하였다. 그 결과 효모형질전환체에 대한 CaCl₂, Tween 80, ethanol의 처리에서는 HLY의 분비촉진을 확인할 수 있었다. 특히 10% ethanol의 처리에서는 HLY 활성을 38.6% 증가시켰다. 이러한 결과는 ethanol이 직접적으로 세포막과 벽에 변화를 주어 세포내에 존재하는 HLY의 분비를 촉진시켰고, 배지 속에 첨가된 고농도 ethanol은 분비된 HLY의 안정성을 증가시킨 것으로 생각된다. 하지만 기대했던 계면활성제의 효과는 거의 없었는데 이러한 결과는 계면활성제가 유전산물 분비에 미치는 영향이 없다고 단정 내리기보다는 측정방법의 문제인 것으로 보인다. We have intended to accelerate the secretion of human lysozyme(HLY) with permeabilizing agents from the cultivated cells of the recombinant Saccharomyces cerevisiae. The five agents-CaCl₂, Tween 80, ethanol, Triton X-100, and cetyltrimethylammonium bromide(CTAB) were used as permeabilizing agents. Treatments of the yeast cell with CaCl₂, Tween 80, and ethanol were effective to increase the secretion from the yeast cells. Especially, treatment of 10% ethanol increased the extracellular HLY activity by 38.6% at 30℃ for 48 h in culture broth. But Triton X-l00 and CTAB unexpectedly didn′t playa role in increase of HLY secretion. Recovery of a foreign protein by permeabilizing agents is easier than by osmotic shock, and is less expensive than enzymatic digestion.

접합전달을 이용한 Streptomyces natalensis ATCC27448의 형질전환 최적화 및 attB-site의 특성연구

이강무,최선욱,박해룡,황용일,Lee Kang-Mu,Choi Sun-Uk,Park Hae-Ryong,Hwang Yong-Il 한국미생물학회 2005 미생물학회지 Vol.41 No.2

상업적으로 중요한 macrolide계 항진균 학생물질인 natamycin을 생산하는 Streptomyces natalensis ATCC27448의 환자 유전학적인 연구를 위해 대장균으로부터 S. natalensis로 plasmid DNA를 직접 도입하는 형질전환법을 확립하였다. 이러한 S. natalensis의 형질전환은 oriT와 attP 단편을 가지고 있는, ${\Phi}C31$ 유래의 integration 벡터인 pSET152를 이용하여 Escherichia coli ET12567/pUZ28002을 DNA 공여체(donor)로 이용한 접합전달법(conjugal transfer)을 사용하여 확립하였다. 접합전달의 가장 높은 효율은 10 mM의 $MgCl_2$를 포함한 MS 배지에서, $6.25\times10^8$의 E. coli 공여체와 열처리를 하지 않은 S. natalensis의 포자를 사용하여 얻어졌다. 또 얻어진 접합전달체 (exconjugant)에 대하여 southern blot hybridization과 벡터가 삽입된 염색체부분의 염기서열분석을 통해 attB site와 pseudo-attB site를 확인하다. attB site의 경우에는 다른 방선균들처럼 S. natalensis 염색체의 pirin 상동체를 코드하는 ORF내에 존재하였으나 pseudo-attB site는 염색체내 다른 site (GenBank accession no. $YP\_117731$)에 존재하였고 그 염기서열은 attB 염기서열과 차이를 나타내었다. Streptomyces natalensis ATCC27448 produces natamycin, a commercially important macrolide antifungal antibiotic. For molecular genetic study of S. natalensis, we have developed a system for introducing DNA into S. natalensis via conjugal transfer from Escherichia coli. An effective transformation procedure for S. natalensis was established based on transconjugation from E, coli ET12567/pUZ8002 using a ${\Phi}C31$-derived integration vector, pSET152, containing oriT and attP fragments. The high frequency was obtained on MS medium containing 10 mM $MgCl_2$ using $6.25\times10^8$ of E.coli donor cells without heat treatment of spores. In addition, southern blot analysis of exconjugants and the sequence of plasmids containing DNA flanking the insertion sites from the chromosome revealed that S. natalensis contains a single ${\Phi}C31$ attB site and at least a secondary or pseudo attB site. Similar to the case of various Streptomyces species, a single ${\Phi}C31$ attB site of S. natalensis is present within an ORF encoding a pirin-homolog, but a pseudo-attB site is present within a distinct site (GenBank accession no. $YP\_117731$) and also its sequence deviates from the consensus sequences of attB sequence.

In vivo Functional Analysis of γ-butyrolactone Autoregulator Receptor Gene (scaR) in Streptomyces clavuligerus

강수진,이창권,최선욱,김현수,황용일,Kang Su-Jin,Lee Chang-Kwon,Choi Sun-Uk,Kim Hyun-Soo,Hwang Yong-Il Korean Society of Life Science 2006 생명과학회지 Vol.16 No.1

방선균에서 DNA 전사 억제인자로써 작용하여 이차대사산물의 생산뿐만 아니라 형태분화를 조절하는 $\gamma-butyrolactone$ autoregulator receptor를 암호화하는 유전자(scaR)를 clavulanic arid 생산 균주, Streptomyces clavuligerus로부터 클로닝하고 in vitro에서 ScaR의 특징을 연구하여 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서는 ScaR의 in vivo 기능을 분석하기위해 상동재조합방법을 이용하여 scaR이 제거된 변이주를 제작하고 야생균주와 표현형을 비교해 보았다. 그 결과, Streptomyces clavuligerus의 형태분화에서는 큰 차이를 나타내지 않았지만 clavulanic acid의 생산에 있어서는 scaR 파괴 변이주가 야생균주에 비해 생산이 증가된 경향을 보였다. 그러므로 ScaR이 S. clavuligerus의 형태분화에는 영향을 미치지 않지만 clavulanic acid 생합성에는 negative regulator로 작용한다는 것을 본 연구를 통해 명확하게 확인할 수 있었다. A $\gamma-butyrolactone$ autoregulator receptor has a common activity as DNA-binding transcriptional repressors controlling secondary metabolism and/or morphological differentiation in Streptomyces. A gene (scaR) encoding it was cloned from Streptomyces cravuligerus, a clavulanic acid producer, and was in vitro characterized in a previous report. In this study to clarify the in vivo function of ScaR, a $\gamma-butyrolactone$ autoregulator receptor of Streptomyces clavuligerus, we constructed a scaR-deleted strain by means of homologous recombination. No difference in morphology was found between the wild-type strain and the scaR-disruptant, but the scaR-disruptant showed higher clavulanic acid production. This indicates that the ScaR in S. clavuligerus acts as a negative regulator of the biosynthesis of clavulanic acid, but plays no role in morphological differentiation.

당근과 시금치 저장에 있어서 자몽종자추출물의 항균효과

김미경,박미숙,최선욱,박해룡,황용일,Kim Mi-Kyung,Park Mi-Suk,Choi Sun-Uk,Park Hae-Ryong,Hwang Yong-Il 한국생명과학회 2005 생명과학회지 Vol.15 No.1

In order to preserve the freshness of vegetables and to reduce the rate of decay, grapefruit seed extract (GFSE), a natural microorganism growth inhibiting agent, was applied during the preservation process of heat treated carrot and spinach. To investigate synergic effect of heat and GFSE treatment, carrots and spinaches were treated with or without 10 ppm of GFSE at $70^{\circ}C$. Surface color, texture and microbial counts of the samples were measured during storage at $4^{\circ}C$. GFSE showed an effective inhibitory activity against aerobic bacteria and yeast which might be involved in the decay of vegetables. Heat treatment at 2 min at $70^{\circ}C$ could also well preserve the color and texture of the vegetables. From the results, optimal concentrations of GFSE were 10 ppm and 50 ppm with heat treatment of 2 min $70^{\circ}C$ for the growth inhibitory effect to aerobic bacteria and yeast and preservation of color and texture. 본 연구에서는 천연 항균제 CFSE를 이용하여 적절한 온도 하에서 당근과 시금치의 저장성 향상에 대한 효과를 보았다. 먼저, $70^{\circ}C$ 및 $90^{\circ}C$에서의 당근과 시금치의 열처리에 대한 영향과 아울러 GFSE 첨가시의 효과에 대한 예비 실험을 실시한 결과, 당근과 시금치의 경우 CFSE첨가에 관계없이 $70^{\circ}C$에서 2 분간 열처리하였을 때 비교적 정상적인 색상과 texture유지 및 미생물의 생육억제 가능성을 나타내었다. 이들 예비실험으로부터 이후 열처리는 $70^{\circ}C$에서 고정하고 GFSE의 농도별 영향을 실시한 결과, GFSE를 10 ppm 이상 첨가한 경우 당근이나 시금치 모두 $4^{\circ}C$에서 저장 17일까지 호기성세균 및 yeast의 성장을 억제하는 효과를 보였으며 특히 50 ppm 이상에서는 뚜렷한 억제 효과를 보였다. 당근과 시금치의 다양한 농도의 GFSE 첨가와 아울러 $70^{\circ}C$ 2 분간 처리는 이미 1차 실험에서와 같이 색상 및 조직의 연화에는 영향이 없었다. 그러므로 잔류독성 문제가 대두되고 있는 화학 항균제가 아닌 천연 항균제 GFSE를 활용한 과일과 채소류의 저장성을 높인 상품을 개발함으로서 소비자들에게 호응을 얻을 수 있는 식품으로써의 개발이 가능할 것이다.

참곱슬이(Plocamium telfairiae) 추출물의 암세포 성장억제 효과

김주영,황지환,차미란,최병대,최선욱,박해룡,황용일,Kim, Ju-Young,Hwang, Ji-Hwan,Cha, Mi-Ran,Choi, Byeong-Dae,Choi, Sun-Uk,Park, Hae-Ryong,Hwang, Yong-Il 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.4

해조류로부터 항암활성을 가지는 생리활성물질을 탐색하기 위하여 홍조해조류의 하나인 참곱슬이를 용매별 추출한 후, 분획하여 암세포 성장 억제효과를 연구하였다. 참곱슬이를 이용하여 대장암 세포주 HT-29에 대해 methanol, ethanol 및 acetone 추출물을 처리했을 때 모두 농도에 의존적으로 성장저해 효과가 나타났고, 그 중에서도 methanol 추출물에서는 50 mg/ml 농도 처리 시 12% 이하의 생존률을 보이는 가장 강한 암세포 성장 억제효과를 보였다. 또한 HT-29 암세포 성장에 대한 현미경 관찰 결과 methanol 추출물은 대조구에 비하여 암세포 성장 억제 정도와 세포의 수축등 형태변화가 두드러지게 나타났다. 그리고 가장 활성이 좋은 methanol 추출물을 용매 분획하여 얻은 분획물 중 n-hexane과 diethyl ether 분획물에서 암세포 성장 억제효과를 보였으며, n-hexane 분획물이 HT-29 세포주에 대하여 가장 높은 항암활성을 나타내었다. 따라서 n-hexane 분획물에 대한 여러 인체 암세포주에 대해 항암활성을 확인하기 위하여 HT-29와 같은 대장암 유래의 세포주 SW620, 자궁경부암 세포 HeLa 및 유방암세포 MCF-7에 대한 암세포 성장 억제효과를 확인한 결과, 3종의 암세포주에서 모두 농도 의존적으로 높은 항암활성을 보임에 따라 참곱슬이에 여러 인체 암세포 성장 억제효과를 가지는 생리활성 물질이 함유되어 있음을 알 수 있다. The extracts of Plocamium telfairiae using several solvents with different polarities were prepared and their growth inhibitory effects were examined on the human cancer cells. We investigated the cytotoxic effects of P. telfairiae extracts on HT-29 cells by the MTT reduction assay and examining the morphological change under the inverted microscope. Among three extracts, the methanol extract showed the strongest inhibitory effect on the growth of HT-29 cells. The methanol extract was further fractionated sequentially with n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and aqueous for purifying crude methanol extract. The n-hexane layer among the fractioned layers showed remarkable inhibitory activity on the growth of HT-29 cells. Moreover n-hexane layer showed the notable growth inhibition effects with a dose-dependent manner against SW620, HeLa, and MCF-7 cells as well as HT-29 cells. These results indicated that P. telfairiae extracts may be contained bioactive materials with inhibitory effect on the growth of human cancer cells.

노루발풀(Pyrola japonica) 추출물의 Bacillus subtilis에 대한 항균활성

박해건,차미란,황지환,김주영,박미숙,최선욱,박해룡,황용일,Park, Hae-Gun,Cha, Mi-Ran,Hwang, Ji-Hwan,Kim, Ju-Young,Park, Mi-Suk,Choi, Sun-Uk,Park, Hae-Ryong,Hwang, Yong-Il 한국생명과학회 2006 생명과학회지 Vol.16 No.6

우리나라 전국 산지에서 쉽게 구할 수 있는 노루발풀을 건조시켜 80% ethanol 추출물과 여러 가지 용매 분획물의 미생물 증식 억제 효과에 대해서 검색하였다. 노루발풀의 80% ethanol 추출물은 그람 양성균 B. subtilis에서 농도 의존적으로 항균활성을 나타내는 반면 그람 음성균 E. coli에서는 활성이 나타나지 않았다. 노루발풀의 80% ethanol 추출물을 용매 분획하여 얻은 분획물 중 hexane층에서 항균활성이 나타나는 것을 확인하였다. 노루발풀의 항균활성 물질을 검색하기 위한 목적으로 hexane 분획물을 silica gel column chromatography, prep. TLC 및 HPLC를 실시하였으며 그 결과, peak I의 단일 물질이 노루발풀의 B. subtilis에 대한 항균활성을 나타내는 물질임을 확인할 수 있었다. The antimicrobial substance from Pyrola japonica were extracted and isolated. Eighty percent ethanol extract of dried Pyrola japonica was fractionated to hexane, diethyl ether, ethyl acetate and aqueous layer. The hexane-soluble fraction showed the highest inhibitory activity against Bacillus subtilis. Moreover the hexane layer was fractionated into 5 groups by silica gel column chromatography. From the results, group No. 2 ($18{\sim}40$ fractions) showed the highest antimicrobial activity. The group was re-separated to 10 fractions by preparative thin layer chromatography and the peak I as active fraction was isolated by HPLC.

국화차를 포함하는 허브차의 CCl₄로 유도된 간세포손상 보호 및 항유전독성 효과

이현정(Hyun-Jung Lee),황용일(Young-Il Hwang),박은주(Eunju Park),최선욱(Sun-Uk Choi) 한국식품영양과학회 2011 한국식품영양과학회지 Vol.40 No.1

최근 국내의 건강기능성 추출물을 이용한 차·음료 시장이 확대되고 있고, 국화, 산수유 및 오미자는 이들의 높은 생리활성과 기호도로 인하여 그 활용도가 더욱 높을 것으로 기대된다. 현재까지 국화, 산수유 및 오미자의 개별적인 생리활성 연구는 활발히 이루어지고 있는 반면, 이들을 혼합하여 제조한 차류의 효능에 대한 연구는 아직 보고되지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 CCl₄ 처리에 의해 손상된 간세포에 대한 국화차 조성물의 간 기능 보호효과와 인체백혈구에서 H₂O₂로 유도된 산화적 DNA 손상에 대한 국화차 조성물의 항유전독성 효과를 검증하고자 하였다. CCl₄로 유도된 간세포 독성에 대해 국화차 조성물 Ⅰ형, Ⅱ형은 유의적인 간세포 보호효과를 나타내었으며, 국화차 조성물 Ⅲ형은 CCl₄처리군보다 약간 높은 세포생존율을 보였으나 유의적이지는 않았다. CCl₄를 처리에 의해 증가한 간세포 배지 내 AST 및 ALT 활성은 국화차 조성물에 의해 배지 내 효소활성을 감소시킴으로 간세포 보호효과가 있는 것으로 사료되며, 그 효과는 AST 효소활성에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 특히 국화차 조성물 Ⅰ형의 0.01 ㎎/mL 농도에서 가장 높은 AST 및 ALT 유리 억제능을 나타내었다. 이 결과로 국화추출물의 CCl4 유도에 의해 AST>ALT 순으로 유리가 증가되는 것으로 여겨진다. 국화차 조성물 I형의 1~50㎍/mL, 국화차 조성물 Ⅱ의 50 ㎍/mL 및 국화차 조성물 Ⅲ의 1~50 ㎍/mL 농도 범위에서 산화적 스트레스로 유도된 인체 백혈구 DNA 손상에 대한 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통하여 국화차 조성물의 간세포 손상보호효과와 산화적 스트레스에 대한 인체 백혈구 DNA 손상 보호능을 검증할 수 있었다. The flower of Chrysanthemum morifolium Ramat. with antioxidant, anticancer, and anti-inflammatory functions has been a widely used traditional herb as a healthy beverage and medicine. The aim of the present study was to investigate a herb tea consisting of C. morifolium Ramat., Corni fructus and Schizandra chinensis Baillon for its hepatoprotective activity against CCl₄-induced toxicity in freshly isolated rat hepatocytes and antigenotoxic effect against oxidative stress induced DNA damage in human leukocytes. Three different compositions of the herb tea (Mix Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ) were prepared by extracting with water at 90℃. Freshly isolated rat hepatocytes were exposed to CCl₄ along with/without various concentrations of each tea. Protection of rat primary cells against CCl₄-induced damage was determined by the MTT assay. The significant antihepatotoxic effect of the tea was shown in Mix Ⅰ and Ⅱ. The increased transaminase (AST and/or ALT) release in media of CCl₄ treated hepatocytes was significantly lowered by all the teas tested. The effect of the tea on DNA damage in human leukocytes was evaluated by Comet assay. All teas showed a protective effect against H₂O₂-induced DNA damage. From these results, it is assumed that herb tea based on C. morifolium Ramat., Corni fructus and Schizandra chinensis Baillon exerted antihepatotoxic and antigenotoxic effects.

국화분말을 첨가한 빵의 특성과 저장중의 품질 변화

Sang-In Jung(정상인),Eun-Ju Shin(신은주),Sun-Uk Choi(최선욱) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.2

빵에 국화를 첨가할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하기 위해 국화분말을 각각 0%, 3%, 5%, 7% 첨가한 식빵을 제조하여 제빵의 과정뿐만 아니라 저장기간에 따른 품질변화를 관찰하였다. 그 결과, 국화의 첨가에 따라 제빵시간이 총 9~23분 더 길어진 반면 mixing time은 1~2분 더 짧아졌다. 또 국화를 첨가할수록 무첨가 시료에 비해 구운 후 빵의 무게는 증가한 반면 비용적은 감소하였다. 경도는 국화의 첨가량에 따라 증가하였으며 빵의 고형물함량에는 큰 차이가 없었다. 국화분말을 첨가한 빵의 pH는 무첨가 시료에 비해 약 0.33 정도 낮아졌으며 저장중의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 또 색도를 측정한 결과 국화의 첨가량이 증가할수록 명도(L값)는 낮게 나타났으며, 적색도(a값)와 황색도(b값)는 높게 나타났다. 관능평가 결과 향과 경도, 그리고 촉촉한 정도는 모든 실험군에서 큰 차이를 보이지 않았으나 종합적인 기호도의 경우 무첨가 시료가 가장 우수한 값을 나타냈으며 국화분말의 첨가량이 많을수록 낮아지는 경향을 보였다. 또 저장기간에 따라 모든 실험군의 종합적인 기호도는 감소하였는데 특히 국화분말의 첨가량이 적을수록 종합적인 기호도의 감소폭은 크게 나타났다. 따라서 빵에 국화를 첨가하는 것은 빵의 풍미유지에 도움을 주는 것으로 판단된다. 0%, 3%, 5%, and 7% chrysanthemum powder was added to plain bread to investigate its effect on the quality and preservation of bread. The properties of dough, physical changes, and sensory evaluation of plain bread with chrysanthemum powder added were analyzed during storage at room temperature. Volumes of dough and bread were decreased by addition of chrysanthemum powder. Also, the pH and Hunter L (lightness) in bread with chrysanthemum powder were lower than those of the control bread, while its redness, yellowness, and hardness were higher. In sensory evaluation, when more than 5% chrysanthemum was added to bread, aftertaste and overall acceptability were rapidly decreased. In contrast, the addition of chrysanthemum minimized the drop of flavor caused by storage time. In conclusion, chrysanthemum powder added to plain bread improved flavor, which declines with storage time.

자몽종자 추출물처리가 저장 중 당면의 미생물 생육에 미치는 영향

김미경 ( Mi Kyung Kim ),김진우 ( Jin Woo Kim ),최선욱 ( Sun Uk Choi ),박해룡 ( Hae Ryong Park ),황용일 ( Yong Il Hwang ) 경남대학교 기초과학연구소 2004 기초과학지 Vol.20 No.-