HPLC-QTOF을 활용한 농약 라이브러리 데이터베이스 구축 및 시험 작물에의 적용

정문주 ( Mun-ju Jeong ),김수민 ( Su-min Kim ),김소희 ( So-hee Kim ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),이예진 ( Ye-jin Lee ),이윤희 ( Yoon-hee Lee ),문준관 ( Joon-kwan Moon ),신용호 ( Yongho Shin ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

잔류분석에 주로 활용하고 있는 저분해능 질량분석기(LRMS)는 표준물질이 확보되어 있지 않은 상태에서 Multiple Reaction Monitoring (MRM) profile이 확립되어 있지 않을 경우 정성 분석을 수행하는데 어려움이 있을 수 있다. 반면 고분해능 질량분석기(HRMS)를 활용할 경우 소수점 3~4번째 자리의 정확한 질량 분석을 통해 잔류물질에 대한 신속 정확한 식별이 가능하며, 표준물질의 미확보 시에도 라이브러리 및 open source database를 통해 미지 물질의 추정분석이 가능하다. 본 연구에서는 고분해능 질량분석기 중 하나인 HPLC-QTOF을 활용하여 농약 다성분 및 그 대사산물의 HRMS 정보로 구성된 라이브러리를 구축한 후 시험 작물 내 농약 다성분의 라이브러리 검색률 및 회수율 시험을 적용하여 HRMS의 정성/정량 분석 능력을 평가하였다. HPLC-QTOF로 Shimadzu LCMS-9030을 사용하였으며, 농약 표준물질 541성분을 사용하여 MS1 및 MS2 스펙트럼 확보 후 개별 농약 라이브러리를 구축하였다. MS1 라이브러리는 full scan 분석을 수행하여 동위원소 화학종에 대한 존재 비율을 검증하였으며, MS2 라이브러리에서는 다양한 충돌 에너지(Collision energy; CE) 범위에서의 조각화패턴을 확인하였다. 10 V 간격으로 10-100 V (10개)의 개별 분석과 CE spread 활용한 5-55, 55-105 V 범위의 통합 분석을 수행하였으며, 질량 오차 범위는 ±5 ppm 이내로 설정하여 질량정확도를 높였다. Data Dependent Acquisition (DDA)을 사용하여 full scan 분석을 통한 분석대상 이온의 질량 대 전하비(m/z) 값을 일차적으로 얻고, 통계적으로 의미가 있는 precursor ion 만을 개열시켜 농약 혼합표준용액을 처리한 대표 작물(시금치 및 배추) 추출물로부터의 농약 라이브러리 일치율을 비교하였다. 대표 농약 51성분에 대한 분석 결과, 시금치 추출물의 MS1 및 MS2 라이브러리 검색률은 모두 90%, 배추 추출물은 각 96%, 94%로 높은 유사도 점수를 획득하였으며, 회수율 및 RSD 또한 71.5-101.5% (RSD ≤8.3%)로 유효범위 70-120% (RSD ≤20%)를 만족하였다. 농약 데이터베이스를 활용하여 표준물질 미확보 상황에서도 분석 대상물질의 추정분석이 가능하며, 더 나아가 농산물 및 식품 내 미지물질의 분석에도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

당귀잎의 재배기간 중 Penthiopyrad 잔류소실 경향 및 생물학적 반감기 비교

김소희 ( So-hee Kim ),이윤희 ( Yoon-hee Lee ),정문주 ( Mun-ju Jeong ),김수민 ( Su-min Kim ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),이예진 ( Ye-jin Lee ),최훈 ( Hoon Choi ),신용호 ( Yongho Shin ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

Penthiopyrad는 살균제로 점무늬병 및 균핵병 등의 방제에 사용된다. 연구 작물인 당귀(Angelica acutiloba Kitagawa)는 주로 뿌리를 약용작물로써 한약 등의 조제에 사용하나, 최근에는 잎에 대한 섭취량이 증가하고 있다. 본 연구는 재배지역에 따른 당귀잎 중 Penthiopyrad의 잔류소실 경향 및 생물학적 반감기(biological half-life)를 비교하기 위하여 수행되었다. 시험포장은 위도가 다른(직선거리 20 km 이상) 지역으로 경남 산청군(포장1), 충북 제천군(포장2)의 시설재배지를 선정하였다. 등록된 안전 사용 기준에 따라 penthiopyrad 20% 유제(EC)를 7일 간격 3회 경엽처리하였다. 농약 최종 살포 후 0 (2시간 이내), 1, 2, 3, 5, 7 및 10일에 시료를 각각 1 kg 이상 수확하여 유효성분을 분석하였다. 농약분석은 LC-MS/MS를 활용한 식품의약품안전처 식품공전 다종농약 다성분 분석법 제2법(QuEChERS법)을 사용하였다. 시료 전처리를 위해 균질화된 당귀잎 10 g에 acetonitrile 10 mL를 가하여 추출하고, EN15662 염(citrate-buffer 포함)으로 분배한 후 PSA (Primary-Secondary Amine)가 함유된 dispersive SPE (d-SPE)로 정제하였고 최종 추출물 중 2 μL를 LC-MS/MS로 분석하였다. 분석법상 정량한계(method limit of quantitation; MLOQ)는 0.01 mg/kg이었으며, 검량범위 0.005~0.5 mg/kg에서 상관계수(r²)는 0.999 이상으로 양호하였다. 분석법의 정확도 및 정밀도 확인을 위한 회수율 및 저장안정성 연구는 0.01, 0.1, 15 mg/kg의 농도에서 실시되었으며, 회수율 94.5~104.1% (CV≤9.1%)로 허용범위(70~120%, CV≤20%) 이내임을 확인하여 분석법의 신뢰성을 확보하였다. 검증된 분석법을 활용하여 각 지역에서 농약 최종 살포 0~10일 후에 수확한 시료를 분석한 결과, 포장1에서는 1.78~9.77 mg/kg, 포장2에서는 1.02~11.02 mg/kg의 잔류량을 보였다. 두 지역 모두 시간이 경과함에 따라 경시적으로 잔류량이 감소하는 경향을 관찰하였다. 이를 바탕으로 1차 반응속도모델(first-order kinetics model)을 이용하여 당귀 중 Penthiopyrad의 소실 곡선을 작성하였으며, 감소상수(k)는 0.1751 (포장1), 0.2425 (포장2)였다. 이에 따라 반감기를 산출한 결과, 포장1에서 4.0일, 포장2에서 2.9일로 평균 3.5일이었다. 본 결과를 바탕으로 생산단계 농약 잔류허용기준(PHRL; Pre-Harvest Residue Limit)을 설정할 수 있을 것으로 사료된다.

당귀잎의 재배기간 중 Tebufenpyrad 잔류소실 경향 및 생물학적 반감기 비교

김소희 ( So-hee Kim ),이윤희 ( Yoon-hee Lee ),정문주 ( Mun-ju Jeong ),김수민 ( Su-min Kim ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),이예진 ( Ye-jin Lee ),최훈 ( Hoon Choi ),신용호 ( Yongho Shin ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

Tebufenpyrad는 살충제로 점박이응애 등의 방제에 사용된다. 본 연구는 재배지역에 따른 당귀잎 중 Tebufenpyrad의 잔류소실 경향 및 생물학적 반감기(biological half-life)를 비교하기 위하여 수행되었다. 시험포장은 위도가 다른(직선거리 20 km 이상) 지역으로 경남 산청군(포장1), 전북 전주시(포장2), 충북 제천군(포장3)의 시설재배지를 선정하였다. 등록된 안전 사용 기준에 따라 Tebufenpyrad 10% 유제(EC)를 1회 경엽처리하였다. 농약 살포 후 0 (2시간 이내), 1, 2, 3, 5, 7, 10 및 14일에 시료를 각각 1 kg 이상 수확하여 유효성분을 분석하였다. 농약분석은 LC-MS/MS를 활용한 식품의약품안전처 식품공전 다종농약 다성분 분석법 제2법(QuEChERS법)을 사용하였다. 시료 전처리를 위해 균질화된 당귀잎 10 g에 acetonitrile 10 mL를 가하여 추출하고, EN15662 염(citrate-buffer 포함)으로 분배한 후 PSA (Primary-Secondary Amine)가 함유된 dispersive SPE (d-SPE)로 정제하였고 최종 추출물 중 2 μL를 LC-MS/MS로 분석하였다. 분석법상 정량한계(method limit of quantitation; MLOQ)는 0.01 mg/kg이었으며, 검량범위 0.005~0.5 mg/kg에서 상관계수(r²)는 0.999 이상으로 양호하였다. 분석법의 정확도 및 정밀도 확인을 위한 회수율 및 저장안정성 연구는 0.01, 0.1, 1 mg/kg의 농도에서 실시되었으며, 회수율 104.1~108.1% (CV≤3.2%)로 허용범위(70~120%, CV≤20%) 이내임을 확인하여 분석법의 신뢰성을 확보하였다. 검증된 분석법을 활용하여 각 지역에서 농약 최종 살포 0~14일 후에 수확한 시료를 분석한 결과, 포장1에서는 1.34~15.82 mg/kg, 포장2에서는 1.17~1 mg/kg, 포장3에서는 1.10~17.60 mg/kg의 잔류량을 보였다. 세 지역 모두 시간이 경과함에 따라 경시적으로 잔류량이 감소하는 경향을 관찰하였다. 이를 바탕으로 1차 반응속도모델(first-order kinetics model)을 이용하여 당귀 중 Tebufenpyrad의 소실 곡선을 작성하였으며, 감소상 수(k)는 0.1646 (포장1), 0.1810 (포장2), 0.2274 (포장3)였다. 이에 따라 반감기를 산출한 결과, 포장1에서 4.2일, 포장2에서 3.8일, 포장3에서 3.0일로 로 평균 3.7일이었다. 본 결과를 바탕으로 생산단계 농약 잔류허용기준(PHRL; Pre-Harvest Residue Limit)을 설정할 수 있을 것으로 사료된다.

당귀잎 중 Spirotetramat의 생산단계 잔류 특성 및 생물학적 반감기 산출

이윤희 ( Yoon-hee Lee ),김소희 ( So-hee Kim ),정문주 ( Mun-ju Jeong ),김수민 ( Su-min Kim ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),이예진 ( Ye-jin Lee ),최훈 ( Hoon Choi ),신용호 ( Yongho Shin ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

본 연구는 당귀잎(Angelica acutiloba Kitagawa) 중 spirotetramat의 경시적 잔류특성을 파악하고 반감기를 산출하고자 수행하였다. 지리적 차이에 따른 잔류특성을 비교하기 위하여, 위도상의 거리가 20 km 떨어진 지역인 전라북도 전주시(포장1)와 경상남도 산청군(포장2)의 시설재배지를 시험 포장으로 각각 선정하였다. Spirotetramat 22% 액상수화제(SC)를 농약 안전사용기준에 근거하여 2회 살포하였으며, 최종 살포 후 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14일(8회)에 시료를 수확하였다. 시료의 전처리를 위해 드라이아이스와 함께 마쇄한 시료를 10 g 칭량하고, 10 mL acetonitrile로 추출하여 진탕하였다. 이후 QuEChERS EN salt를 첨가하여 액액분배한 후, acetonitrile 상등액을 d-SPE에 1 mL 첨가하여 정제과정을 거친 다음 최종 추출물을 LC-MS/MS로 분석하였다. 분석법상 정량한계는 0.01 mg/kg이었으며, 검량범위 0.005~0.5 mg/L에서 검량선의 직선성은 상관계수(r²)로 판단하였으며 0.999 이상으로 우수하였다. 당귀잎 중 spirotetramat의 잔류량은 포장1에서 0.51~24.05 mg/kg, 포장2에서는 1.67~34.41 mg/kg 범위였다. 두 지역에서 모두 경시적인 잔류량 감소 경향을 확인하였다. 이를 바탕으로 1차 반응속도모델(first-order kinetics model)을 이용하여 소실 곡선을 작성하였으며, 각각의 소실 곡선을 바탕으로 감소상수(k)와 반감기를 산출하였다. 포장1의 k는 0.2744, 반감기는 2.5일이었고, 포장2의 k는 0.1887, 반감기는 3.7일로 두 지역의 평균 반감기는 3.1일이었다. 본 연구 결과는 재배기간 중 생산단계 농약 잔류허용기준(PHRLs; Pre-Harvest Residue Limits) 설정에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

HPLC-QTOF을 활용한 아욱 중 살충제 Sulfoxaflor의 생산단계 농약잔류소실특성 연구

김수민 ( Su-min Kim ),정문주 ( Mun-ju Jeong ),김소희 ( So-hee Kim ),이윤희 ( Yoon-hee Lee ),이예진 ( Ye-jin Lee ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),최훈 ( Hoon Choi ),신용호 ( Yongho Shin ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

본 연구는 출하 전 생산단계에서 아욱(Malva verticillata L.; Curled mallow) 중 농약의 경시적 잔류량 감소 경향을 파악하고 반감기를 산출하는데 목적이 있다. 시험포장은 경상남도 산청(포장 1), 전라북도 전주(포장 2), 충청북도 괴산(포장 3)의 시설재배지로 위도상 직선거리의 차이가 20 km 이상인 지역으로 선정하였다. 약제 살포는 농약 안전사용기준에 의거하여 Sulfoxaflor 7% 액상수화제를 2,000배 희석하여 시설재배 중인 아욱에 2회 살포하였다. 시료 수확은 최종 약제 살포일 기준 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10일에 걸쳐 총 7회 실시한 후 분석 전까지 -20℃에서 냉동보관 하였다. 시료 전처리를 위해 균질화한 시료 10 g을 칭량 후 10 mL의 acetonitrile을 가하여 진탕 추출한 뒤 4 g magensium sulfate, 1 g sodium chloride, 1 g sodium citrate dihydrate, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate를 첨가하여 진탕하고 3500 rpm에서 원심분리하였다. 이후 상등액 1 mL를 150 mg magensium sulfate, 25 mg primary secondary amine에 분취하고 혼합하여 정제한 뒤 13000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 acetonitrile로 희석 후 이 중 2 μL를 HPLC-QTOF에 주입하여 full scan 분석을 통해 정성/정량 평가를 수행하였다. 분석법의 정량한계는 0.01 mg/kg이었으며, 검량선 상관 계수(r²)는 0.999 이상으로 양호한 직선성을 보였다. 분석법의 신뢰성 확립을 위해 아욱 무처리구 시료에 회수율 실험을 진행하였으며 0.01, 0.1, 10 mg/kg의 3 수준에서 회수율 실험 결과 평균 93.2~97.2%이었고 상대표준편차(RSD)는 5% 이하였다. 저장안정성 연구의 회수율 결과로는 0.1 mg/kg 수준에서 97.2~100.4%로 유효성분은 저장기간 동안 화학적으로 안정하였다. 포장별 잔류량은 포장 1에서 3.46~0.02 mg/kg이었고 포장 2에서 1.19~0.18 mg/kg이었으며 포장 3에서 3.05~0.01 mg/kg으로 최종 약제 살포일로부터 시간이 경과할수록 잔류량이 감소함을 확인하였다. 아욱 중 sulfoxaflor의 생물학적 반감기는 포장 1~3에서 1.2일, 3.0일, 1.1일로 나타났다. 이를 토대로 아욱의 출하전 생산단계 잔류허용기준(안)을 제안할 수 있을 것으로 사료된다.

액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석기(LC-QTOF)을 활용한 농약 라이브러리 구축 연구

신용호 ( Yongho Shin ),정문주 ( Mun-ju Jeong ),안우석 ( Woo-seok Ahn ),김소희 ( So-hee Kim ),이윤희 ( Yoon-hee Lee ),이예진 ( Ye-jin Lee ),은혜란 ( Hye-ran Eun ),김수민 ( Su-min Kim ),조형욱 ( Hyeong-wook Jo ),문준관 ( Joon-kwan M 한국환경농학회 2022 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2022 No.-

신규 화학물질의 등록 및 사용이 매년 증가함에 따라 이들의 모화합물, 대사산물 및 분해산물이 토양 및 하천수 등으로 유입되어 농·축·수산물 및 환경 중 잔류될 경우, 인축 및 생태계에 영향을 미칠 수 있다. 기존의 잔류실태조사는 농약 등 잔류물질을 HPLC, GC 또는 quadrupole을 활용한 nominal (tandem) mass spectrometry를 사용하고 있다. 특히 nominal mass spectrometry는 표적분석에는 유리하지만, 추정분석 및 비표적분석이 어려워 잔류물질의 오염사고 시 사전정보가 전혀 없는 미규제물질 검출에는 활용성이 떨어진다. 그러므로 TOF (time-of-flight)와 같은 고분해능 질량분석기의 활용으로 미규제물질의 분석이 요구된다. 본 연구에서는 추정분석 및 비표적분석을 위해 표준물질이 확보된 항목에 대한 개별 농약 라이브러리를 구축하였다. 분석기기로는 Shimadzu LCMS-9030을 사용하여 농약 표준품을 분석하였으며, MS1 및 MS2 수준에서 각각 라이브러리를 작성하였다. 분석하고자 하는 농약성분을 적절한 농도로 희석하여 MS1 수준에서 동위원소(isotope) 분석을 실시하였으며 exact mass, 동위원소 존재 비율 등을 확인하였다. 이후 MS2 수준에서의 분석 시에는 CE (collision energy) 값을 각 10 V부터 100 V까지 10 V 단위로 세분화하여 개별 분석함과 동시에 CE spread 기능을 이용해 CE 5-55 V 및 55-105 V 범위에서의 통합 스펙트럼을 각각 확보하였다. MS1과 MS2 스펙트럼 패턴 및 추가 화학물질 정보인 cas number, chemical formula, structure, exact mass 등을 라이브러리에 기입하였다. 매 분석 시 m/z 보정용 tunning solution을 이용하여 스펙트럼 질량정확도를 허용 기준인 ±5 ppm 이내인 것을 확인하여 정확성을 확보하였다. 향후 구축된 농약 라이브러리를 이용하여 표준물질이 확보되지 못한 상황에서도 이를 바탕으로 미규제물질을 추정하고 비표적분석을 통해 농·축·수산물 중 농약 잔류실태조사에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.