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          형질전환된 고추( Capsicum annum L.) 식물체의 Mouse Adenosine Deaminas 유전자 발현

          양덕춘,이계연,유영숙,최경화,임학태 한국식물생명공학회 1997 식물생명공학회지 Vol.24 No.1

          고추의 형질전환율을 높이기 위하여 우선적으로 효율적인 재분화조건을 구명하였다. 고추의 하배축과 자엽 모두 2mg/L zeatin과 0.1 mg/L NAA ( I )에서 51%, 1.0 mg/L BAP와 10.0 mg/L IBA ( II)는 45.1%의 재분화율을 보였으며, 두 배지에 5 $\mu$M AgNO$_3$을 첨가하였을 때 I의 배지에서 보다 건강한 식물체를, II의 배지에서는 재분화율이 약 8%로 증가함을 보였다. 따라서 II의 배지 조건은 가격이 비싼 zeatin의 효과를 대치할 수 있었다. 이렇게 얻어진 효율적인 재분화배지에 고추의 하배축과 자엽을 ADA와 NPT II 유전자를 함유한 Agrobacterium tumefaciens pDY183을 이용하여 형질전환을 유도하여, kanamycin 100 mg/L에서 선발하여 성공적으로 형질전환체를 얻었다. 식물체내로의 ADA와 NPT II 유전자의 도입은 PCR을 이용하여 확인하였으며, Northern blot에 의하여 ADA 유전자의 전사여부를 확인하였다. ADA 효소의 활성도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하여 본 결과 고추세포내에서 정상적으로 발현하였으므로 동물유전자인 ADA가 식물체 형질전환시 표시 유전자로서의 사용가능성이 확인되었다. The in vitro regeneration and genetic transformation systems in hot pepper(Capsicum annuum L.) have not been routinely available, which has been a major limiting factor in the application of new genetic manipulations. An efficient procedure to regenerate whole pepper plants and to generate transgenic plants expressing a foreign gene was established. A relatively high frequency of plant regeneration was observed when hypocotyl and cotyledon explants were cultured on MS medium supplemented with NAA 0.1 mg/L plus zeatin 2.0 mg/L or IBA 10.0 mg/L plus BAP 1.0 mg/L. Addition of AgNO$_3$5 $\mu$M to these media improved the regeneration frequency up to 8%. For plant transformation, hypocotyl and cotyledon explants of hot pepper were precultured on shoot induction media without kanamycin added for 2 days, and then cocultured with Agrobacterium tumefaciens pDY183 for 2 days. Putative transformants were obtained from selection media containing 100 mg/L kanamycin sulfate and 500 mg/L carbenicillin. Putatively selected transformants were confirmed by amplification of selectable marker genes (ADA and NPT II) by polymerase chain reacion. Successful transcripts of ADA gene were detected by Northern blot analysis. Enzyme activity of ADA was also examined by spectrophotometric analysis, and expression of ADA gene in hot pepper suggests the potential application of ADA gene as a selectable marker in plants.

        • KCI등재

          형질전환 연초(Nicotiana tabacum L.)의 Mouse Adenosine Deaminase 유전자 발현

          양덕춘,박지창,최광태,이정명 한국식물생명공학회 1995 식물생명공학회지 Vol.22 No.4

          The mammalian adenosine deaminase(ADA) gene was stably expressed in transgenic tobacco plane. The chimeric ADA gene 35S/35S/AMV/ADA/Tnos, has been constructed. This chimeric gene was introduced into the binary vector pRD400, which was thereafter mobilized into Agrobacterium tumefaiens strain MP90 harboring disarmed Ti-plasmid. The resulting strains were used to transform Nicofiana tabacum L. using the leaf disc. Incorporation of the chimeric gene into plant were confirmed by PCR and Northern blot analyses. Immunoblot analysis showed that ADA protein was successfully synthesized in the transgenic tobacco plants. 동물유전자인 mouse adenosine deaminase (ADA)유전자가 안정적으로 연초 형질전환체에서 발현되었다. ADA cDNA 을 연초에서 강력히 발현시키기 위해서 35S/35S/AMV promoter을 부착시켰으며 식물세포에 도입을 위해서 binary vector인 pRD400을 이용하였다. 연초의 형질전환은 Tri- parental mating에 의해서 도입된 ADA 유전자 함유 binary vector와 disarmed Ti-plasmid을 함유하고 있는 Agrobacterium tmefacience MP9O을 사용하였다. 동시배양은 연초의 잎 disc을 이용해서 kanamycin이 첨가된 배지로부터 직접 shoots을 선발하여 형질전환체로 유도하였다. 형질전환 체에 ADA 유전자의 삽입여부는 PCR을 이용하였으며, 실험결과 ADA 유전자를 확인할 수 있었다. 또한 도입된 mouse ADA 유전자로부터 mRNA 및 단백질 합성여부를 각각 northern blot 및 immunoblot 분석한 결과 형질전환체 에서는 공히 확인되었다.

        • KCI등재

          연초의 형질전환을 위한 새로운 표지유전자로서 Mouse Adenosine Deaminase 유전자의 이용가능성

          양덕춘,한성수,윤의수 한국식물생명공학회 1995 식물생명공학회지 Vol.22 No.4

          The development of selectable markers for transformation has been a major factor in the successful genetic manipulation of plant. We established a new selectable marker system for tobacco transformation using chimeric adenosine deaminase (ADA) gene, which confers resistance to cytotoxic adenosine analogues, 9-$\beta$-D-arabinofuranosyl adenine(Ara-A) and cordycepin. The transformants with the chimeric ADA gene in tobacco grew in the presence of normally lethal level of cytotoxic adenosine analogues, 100 $\mu$M Ara-A and 50 $\mu$M cordycepin. We successfully distinguished transformed shoot from non-transformed shoot on the same selectable media with cytotoxic adenosine analogues. In this selectable media, we were able to select seeds with/ without ADA gene from transgenic tobacco seeds. Theses results show that the mammalian ADA gene may serve as a new selectable marker for tobacco transformation. 식물세포의 형질전환을 위한 새로운 표지유전자의 개발은 식물유전공학의 중요한 관건이 되고 있다. 본 실험은 독성 adenosine 유도체인 9-$\beta$-D-arabinofuranosyl adenine (Ara-A)과 cordycepin등에 저항을 나타내는 adenosine deaminase (ADA) 유전자를 새로운 식물세포의 형질전환용 표지유전자로 사용코자 수행하였다. 정상식물체에서는 치사하는 농도인 Ara-A 100 $\mu$M과 cordycepin 50 $\mu$M이 함유된 선발배지에서 ADA 유전자에 의하여 형질전환된 연초식물체는 생존이 가능하였으며 성공적으로 형질전환체를 선발할 수 있었다. 또한 형질전환된 연초식물체에서 획득한 종자도 동일한 선발배지에서 ADA 유전자가 유전된 종자와 유전되지 않은 종자를 쉽게 구별할 수 있었다. 이런 결과는 동물유전자인ADA 유전자를 연초조직의 새로운 형질전환용 표지유전자로 사용할 수 있음을 시사한다.

        • KCI등재

          연초종간 상호교잡에 의한 Genetic Tumor의 유도 및 Teratoma Shoot의 특성

          양덕춘,윤의수,최광태,이정명 한국식물생명공학회 1998 식물생명공학회지 Vol.25 No.2

          연초 N. glauoa(2n=24)와 N. langsdorffii(2n=18)의 종간상 호교잡에 의하여 종간잡종을 획득하였다. N. glauca $\times$ N. langsdorffii 교잡에서는 100%의 F$_1$ 종자를 획득할 수 있었으나, N. langsdorffii $\times$ N. glauca교잡에서는 종자결실이 극히 불량하였다. 그러나 종자 발아율은 모두 양호하였으며, 정상 식물체로 생장하였다. F$_1$식물체의 chromosome수를 조사한 결과 모두 2n=21개로 종간잡종임이 확인되었으며, 엽병의 존재여부 및 형태, 잎의 형태, 꽃잎의 형태와 색깔 및 크기, 화분의 색깔 등의 형태적 특성을 조사한 결과 모두 종간잡 종임을 재차 확인 할 수 있었다. F$_1$잡종식물체에서는 spontaneous tumor인 genetic tumor가 형성되었으며, N. glauca을 모본으로 한 교잡체에서는 생식생장기부터 형성되었고, N. langsdorffii을 모본으로 한 잡종체에서는 생식생장기 이후에만 형성되었다. 특히 genetic tumor 조직을 기내에서 식물호르몬 무첨가 배지에서 배양할 경우 생장이 매우 왕성하였으며 많은 teratoma shoot를 형성하였다. 또한 genetic tumor 조직이 아닌 일반 F$_1$식물체의 잎과 줄기절편도 식물호르몬 무첨가 배지에 접종되었을 때에도 15일경부터 callus가 왕성히 형성되었으며, 30일경부터는 수많은 teratoma shoot가 형성되었다. 식물호르몬 무첨가배지에서 잡종체의 teratoma shoot 형성은 N. langsdorffii $\times$ N. glauca 보다 N. glauca $\times$ N. langsdorffii가 더 양호한 경향을 보였다. Teratoma shoot 중에서는 뿌리는 가지고 있지 않지만 지상부가 정상적으로 자란 shoot를 절취하여 다시 조직배양 할 경우에는 영양생장기에 배양잡종식물체에서 많은 genetic tumor가 형성되었다. Reciprocal interspecific hybrids between N. glauca(2n=24) and N. langsdorffii(2n=18) were obtained by intercrossing. One hundred percent of F$_1$ seeds was produced from intercrossing of N. glauca $\times$ N. langsdorffii, whereas the frequency of F$_1$ hybrid seed formation from N. langsdorffii $\times$ N. glauca was very low. However, all the hybrid seeds were germinated well and then grown to normal plantlets. All the plants of F$_1$ hybrids have chromosome number of interspecific hybrids (2n=21). From observation of morphological characteristic, the structure of petrol, leaf, flower, and the morphology of pollen have characteristics of F1 hybrid. Spontaneous tumors (genetic tumor) were formed from each F$_1$ hybrid; the genetic tumor arose at the reproductive phase when the maternal type of F$_1$ hybrid came from N. glauca, while the genetic tumor arose only after reproductive phase when the maternal type of F$_1$ hybrid came from N. langsdorffii. The genetic tumor actively proliferated on hormone-free medium and produced numerous teratoma shoots. In addition, normal leaf or stem explants of F$_1$ hybrid produced calli on hormone-free medium after 15 days of culture, the calli produced new numerous teratoma shoots after 30 days. The frequency of teratoma shoot formation from rnterspecific hybrid was higher in the N. glauca $\times$ N. langsdorffii than in the N. langsdorffii $\times$ N. glauca. Root development from the teratoma shoots was hardly obtained. Teratoma shoots without roots in vitro can form genetic tumor at the vegetative growth phase after tissue culture.

        • KCI등재

          연초(Nicotiana tabacum cv Xanthi) 세포배양에 의한 Ubiquinone 10의 생산

          양덕춘,박지창,최광태 한국식물생명공학회 1994 식물생명공학회지 Vol.21 No.6

          식물세포의 기내배양에 의한 ubiquinone 10의 생산연구의 일환으로 Nicotiana tabacum cv Xanthi 품종으로부터 ubiquinone 10의 생성여부을 확인하고, 식물호르몬의 종류와 농도의 조건에 따른 ubiquinone 10의 생산증대를 조사하고자 본 실험을 수행하였다. Xanthi 캘러스 생장은 NAA 및 2,4-D와 혼합처리시 생장이 양호하였으며 NAA 단독처리구에서도 생장량이 증가되었고 암배양보다는 광배양상태에서 더 양호하였다. 또한 HPLC에 의해서 ubiquinone 10의 생성 여부를 조사한 결과 어느 조건에서도 모두 ubiquinone 10이 검출되었다. 식물호르몬에 의한 ubiquinone 10의 함량은 2,4-D와 NAA 혼합처리구에서보다 NAA 0.5 mg/L 단독처리구에서 ubiquinone 10의 함량이 증가되었으며, 특히 IBA 1mg/L와 NAA 0.5 mg/L 혼합처리구에서 더 양호한 경향을 보였고 단위 플라스크당 ubiquinone 10의 생산량도 더 높았다. 그러나 2,4-D 0.5 mg/L와 kinetin 0.5 mg/L 혼합한 처리구에서는 캘러스의 생장량은 비록 적었지만 ubiquinone 10의 함량이 가장 높아 단위 플라스크당 생산량은 제일 높은 경향을 보였다. The effect of phytohormones on in vitro production of ubiquinone 10 from the callus cultures of Nicotiana tabacum cv Xanthi was investigated. The growth of callus cultures of Xanthi was in proved by addition of NAA and 2,4-D, especially NAA 0.5 mg/L alone, at the light condition. Ubiquinone 10 was detected by HPLC, and confirmed from Xanthi callus cultured on the all of uppermedia. The ubiquinone 10 content in Xanthi tobacco callus cultured on the medium with NAA 0.5 mg/L only was higher than that of other mixed medium with NAA and 2,4-D. However addition of IBA 1 mg/L and NAA 0.5 mg/L to the medium was more effective in promoting ubiquinone 10 formation than that of NAA 0.5 mg/L only As the callus growth of Xanthi was considerabley restrained at concentration of kinetin, Content and production of ubiquinone low as the highest at kinetin 0.5mg/L and 2,4-D 0.5mg/L in the light.

        • KCI등재

          연초 Crown Gall Tumor 와 Genetic Tumor의 식물호르몬에 대한 분화반응

          양덕춘,정재훈,민병훈,최광태,이정명 한국식물생명공학회 1999 식물생명공학회지 Vol.26 No.1

          연초 crown gall tumor와 genetic tumor의 형성시 형태적 특성과 조직배양시 식물호르몬에 대한 반응을 조사하였다. Crown gall tumor는 A. tumefaciens C58을 감염시켜 형질전환된 tumor조직으로부터 획득하였으며, genetic tumor는 N. glauca (2n=24)와 N. langsdorffii (2n=18)의 종간교배에 의하여 유기된 잡종식물체에서 자발적으로 발생한 tumor조직으로부터 획득하였다. 형성된 crown gall tumor, genetic tumor및 teratoma shoot의 형태적 특성은 매우 비슷하였으며, 식물조직배양시 식물호르몬이 전혀 첨가되지 않은 기본배지에서 생장이 왕성하였다. Crown gall tumor는 식물호르몬 무첨가배지에서 전형적인 tumor callus가 형성되었으며 teratoma shoot도 형성되었다. 반면에 genetic tumor는 2,4-D 0.5mg/L 첨가된 배지에서 tumor callus가 형성되었으며, 식물호르몬 무첨가배지에서는 많은 teratoma shoot가 형성되어 식물호르몬의 조절에 의해서 phenotype을 거의 비슷하게 할 수 있었다. Genetic tumor는 재분화시 정상적인 식물체보다는 뿌리를 갖지 못하는 teratoma shoots가 형성되는데 외부에서 인위적으로 식물호르몬인 IAA와 GA, 그리고 active carbon을 첨가하여 완전한 식물체를 생산하는 데는 실패하였다. 그러나 간혹 식물호르몬 무첨가배지에서 뿌리를 갖는 정상식물체로 생장하는 shoot가 형성되었는데 이런 식물체에서도 생장하면서 줄기부분에서 다시 genetic tumor가 형성되었으며, 잎절편을 다시 식물호르몬 무첨가배지에 접종할 경우에도 teratoma shoots를 형성하였다. Morphological characteristic during formation of tobacco crown gall tumor and genetic tumor, and their differential response to growth regulator were investigated in in vitro culture. Crown gall tumor was induced from tumor tissue transformed by infecting Agrobacterium tumefaciens C58. Genetic tumor was induced from tumor tissue which was induced spontaneously from reciprocal interspecific hybrids between Nicotiana glauca (2n=24) and Nicotiana langsdorffii (2n=18). Morphological characteristic of crown gall tumor, genetic tumor, and teratoma shoot was very similar, and they were actively proliferated on hormone-free medium. Typical tumor callus and teratoma shoot formed from crown gall tumor on the hormone-free medium. On the contrary, tumor callus derived from genetic tumor formed as a crown gall tumor callus on the medium supplemented with 0.5 mg/L of 2,4-D, and lots of teratoma shoots without any root formed on the hormone-free medium. Root development from the teratoma shoots was hardly obtained on the medium with IAA, GA and active carbon. However, teratoma shoots with roots, as normal shoots, were initiated occasionally on the hormone-free medium. These shoots also formed new genetic tumor on the stem, which leaves formed lots of teratoma shoot on the hormone-free medium in in vitro culture.

        • 표지유전자로 형질전환된 연초와 감자로부터 원형질제의 유리 및 융합

          양덕춘,박태은,민병훈,최경화,정해준 한국연초학회 1998 한국연초학회지 Vol.20 No.1

          Protoplasts were isolated from mesophyll of tobacco(Nicotiana glauca) transformed with kanamycin-resistant gene (NPT II gene) and potato hairy root callus containing Ri plasmid of Agrobacterium rhiEogenes, and protoplasm fusion was made between the isolated protoplasts. The transgenic tobacco leaf tissue could grow on the media containing high concentrations of kanamycin, but not on the phytohormone-free media. On the other hand, the potato hairy root calli could be cultured on the phytohormone-free media but not on media containing more than 40 ㎍/ml kanamycin. In these conditions, the viability of both protoplasts were above 90%, These selection markers were used for the selection of protoplasts fused between the two, i.e. protoplast fusion was detected using selection media containing 100㎍/ml kanamycin and with no phytohormone. The mixture of 1.0% cellulase, 0.3% macerozyme, and 0.7M mannitol was best for the maximum protoplast production for tobacco, and that of 2.0% cellulase, 2.0% macerozyme, 1.0% dricelase, and 0.5M mannitol for potato. Both tobacco mesophyll and potato callus protoplasts were fused by using PEG solution on the selectable medium. Cell walls were regenerated after 5 days in this medium, and colonies were alive until 4 weeks after cultural, but died after 6 weeks.

        • KCI등재

          딸기의 RAPD를 위한 PCR의 최적조건

          양덕춘,최성민,강태진,이미애,송남현,민병훈 한국자원식물학회 2001 한국자원식물학회지 Vol.14 No.1

          '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 7시까지 원문보기가 가능합니다.

          본 연구는 random primer를 이용하여 PCR을 수행하기 위한 딸기 DNA증폭의 최적조건을 구명하여 조직배양된 딸기 배양묘와 모본과의 유전적인 동일성의 여부 및 품종을 판별할 수 있는 marker를 개발하기 위하여 수행하였다. 추출한 딸기 커(\ulcorner)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, 10pmol의 primer, 37oC annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험결과로서 PCR적정조건을 확립한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다. Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.4%이었다. 그러나 band를 형성하지 못한 primer의 경우에는GC함량이 평균58%이었다. This study was performed to select marker which can identify genetic variation between mother plant and in vitro cultured plantlets of strawberry by PCR using random primer. When 'Yeobong' DNA extracted was treated with proteinase-K and RNase-H, clear DNA bands were shown. The optimal condition for RAPD in strawberry was to use 50ng of template DNA, 10pmol of primer,37oC of annealing temperature, and 45 cycles of PCR. After establishing above PCR optimal condition, RAPD pattern was investigated by using UBC primers. PCR was performed, and 46 of 90 primers produced PCR product showing 158 total bands. GC content was compared between the primers forming bands and no bands. The GC content showing bands was average 67.4%, whereas primers showing no bands 58%.

        • SCIESCOPUSKCI등재
        • KCI등재

          고생장 인삼 모상근의 선발

          양덕춘,김용해,양덕조,민병훈,신성련,최광태 한국식물생명공학회 1998 식물생명공학회지 Vol.25 No.6

          인삼의 뿌리절편, 줄기, 엽병에 Agrobacterium을 접종하여 고생장 모상근을 선발하고자 수행하였다. 인삼 뿌리 절편에서 A. rhizogenes R1000과 A. rhizogenes $A_4$에 의하여 모상근이 유도되었으며, 인삼의 줄기 및 엽병에서도 모상근이 유도되었다. 유도된 모상근은 rolC및 virC DNA절편의 확인으로 형질전환체임을 확인하였으며, 균이 제거된 모상근을 선발하였다. 선발된 모상근 300 세포주중 성장과 형태적 특징이 뚜렷한 11 모상근을 선발하였다. 이들 모상근은 주근이 비후된 것, 주근이 가는 것, 측근의 돌기가 많은 것, 측근의 생장이 높은 것 등의 특징을 나타내었다. 이들 11 모상근중 주근이 가늘고 측근의 생장이 왕성한 형태가 모상근의 생장이 좋았으며, 주근이 비후되고 측근의 돌기가 많은 형태는 생장이 낮았다. 본 연구에서 인삼 뿌리절편으로부터 고생장 모상근인 KGHR-1, KGHR-5, KGHR-8을 선발하였다. These studies were carried out to select the active grow hairy root lines induced from various ginseng(Panax ginseng C. A. Meyer) parts. Hairy roots were induced in root explants, stem and petiole in vitro by A. rhizogenes R1000 or A. rhizogenes $A_4$. These hairy roots could be grown on the phytohormone free medium, and PCR analysis of rol C and vir C gene fragments confirmed that hairy roots were transgenic tissues. We have selected 11 hairy root lines with active growing characters among 300 hairy root lines selected based on growth and morphological characteristics on 1/2MS solid media with 250 mg/L carbenicillin. Morphological characteristics of selected 11 hairy root lines were thickness and thiness of main roots, and many projection for lateral roots, active grow of lateral roots. Among selected 11 hair root lines prominent characteristics of hairy roots with active growing characters were thiness of main roots and active grow of lateral roots. But characteristics of low growing hairy roots were thickness of main roots and low grow of lateral roots. Finally we have selected actively growing hairy roots, KGHR-1, KGHR-5, KGHR-8 among 11 hairy root lines.

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