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효모단백질내의 셀레늄 분포 및특정단백질내의 셀레노메티오닌 분석
심희영,안상욱,안용현,Shim Heeyoung Shim,Sangwook Ahn,Yonghyun Ahn 대한화학회 2003 대한화학회지 Vol.47 No.4
효모를 최적 배양조건에서 키운후 $1.14{\times}10_-3 M$의 셀레늄을 배양액에 가하여 24시간 배양한 후 효모를 얻는다. 효모의 건조중량에 대하여 약 $0.1{\%}$(w/w)이상의 셀레늄을 함유하는 고농도의 셀레늄-효모를 얻었고 세포벽에 부착된 무기셀레늄은 세척후 MBRT과정으로 확인하였다. MBRT에서 15분 이상 푸른색이 지속되는 결과로 무기이온의 세포벽 흡착이 거의 없음을 확인하였다. 셀레늄이 함유된 효모를 초음파로 분해한 후 $80{\%}(NH_4)_2SO_4$ 용액을 이용하여 단백질을 부분 정제하였고 ICP-AES로 측정된 효모내의 셀레늄 농도와 비교하였을 때 약 $60.6{\%}$의 셀레늄이 단백질 내에 존재함을 확인하였다. 전기이동으로 단백질을 분리하여 확인한 결과 많은 양이 발현된 단백질 띠에서는 상대적으로 셀레늄의 농도가 높았다. 그중 47 kDa 단백질의 경우 69.5 ${\mu}$g Se/g의 농도로 가장 많은 함량을 보였다. 이 단백질을 PVDF 막에 electroblotting하여 분리하였고 이를 산으로 가수분해하여 얻어진 아미노산들을 PITC와 반응시켜 유도체를 얻었다. 아미노산유도체들을 HPLC로 분리 확인한 결과 셀레노메티오닌의 상대적인 비율이 총아미노산의 $2{\%}$로 얻어졌다. 이러한 셀레늄은 단백질과 킬레이트의 형태로 존재하는 것이 아니고 대부분이 셀레늄의 유기체인 셀레노메티오닌으로 효모 내에서 생합성 된다고 볼 수 있다. Selenized yeast (Se yeast) containing $0.1{\%}$(w/w) of selenium was obtained when the yeast was incubated at a selenium concentration of 1$1.14{\times}10_-3 M$ in rich medium. After washing several times, the inorganic selenium on the cell wall was confirmed with MBRT. There was no indication of inorganic selenium on the cell wall when the blue color in MBRT was stayed for 15 minutes. The selenized yeast was sonicated, then the selenium contained protein was obtained after salting out by ammonium sulfate at the concentration $80{\%}$ saturation. The seven protein bands were seperated by SDS-PAGE and the selenium concentration in protein was measured by ICP-AES. Analytical data showed that the large expressed protein band contained a relatively large amount of selenium. The proteins of the 47kDa was contained the concentrations of 69.5 ${\mu}$ Se/g of most many content. The protein (47 kDa) was seperated from PVDF membrane by tank-electroblotting. The isolated protein was hydrolyzed under acid condition and reacted with PITC. The derivatives of amino acids were analyzed by HPLC and compared with the data obtained from regular yeast. The resulting selenium-yeast was analyzed with the selenomethionine concentration of $2{\%}$ comparaed with general amino acids. The goal of this study is to analyze the selenium concentration in protein bands and measure the degree of biotransformation of selenomethionine in a specific protein.
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