멜라닌세포성 종양에서 Cathepsin D와 MMP-2의 발현에 관한 연구

백상호 전남대학교 대학원 2005 국내석사

흑색종은 피부암에서 악성도가 높은 종양으로서 사망률이 상당히 높으므로 예후 추정은 매우 중요하다. 종양의 성장과 침윤, 전이는 단백질 분해효소인 cathepsin D, matrix metalloproteinase(MMP), serine protease 및 urokina- seplaminogen activator 등과 밀접한 연관성이 있다. 본 연구에서는 기저막 및 세포외 버팀질 단백질을 분해하는 효소인 cathepsin D와 matrix metalloproteinase 2(MMP-2)로 면역조직화학적 염색을 통해 멜라닌세포성 종양의 유형에 따른 cathepsin D와 MMP-2 단백의 발현차이, 상호관련성, 악성화와 종양의 진행에 영향을 미치는 생물학적 표지자로서의 의의를 알아보았다. 따라서 조직학적으로 진단된 흑색종 49예와 멜라닌세포성 모반 49예를 대상으로 하여 cathepsin D와 MMP-2 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 파라핀 절편을 이용한 cathepsin D와 MMP-2의 면역조직화학염색의 결과 cathepsin D는 흑색종 49예 중 38예(77.6%)에서 발현을 보였고 멜라닌세포성 모반에서는 49중 37예(75.5%)에서 발현을 보였지만 통계학적으로 유의한 상관성이 없었다(p=0.812). 전이성 흑색종 18예 중 15예(83.3%)에서 발현을 보였고 원발성 흑색종 31예중 23예(74.2%)에서 발현을 보여 전이성 흑색종에서 높은 발현을 보였으나 통계학적으로 의미있는 차이는 없었다(p=0.724). MMP-2는 흑색종 49예 중 12예(24.5%)에서 발현을 보였고 모반 49예중 3예(6.1%)에서 발현을 보여 흑색종에서 높은 발현을 보였고 통계적으로 유의하였다(p=0.012). 원발성 흑색종은 31예 중 8예(25.8%)로 전이성 흑색종 14예 중 4예 (22.2%)보다 높았으나 통계학적인 유의성이 없었다(p=1.000). 결론적으로 cathepsin D의 발현은 멜라닌세포성 종양에서 MMP-2보다 높게 출현하며 이들 종양의 발생과 진행은 cathepsin D의 발현과 밀접한 연관관계가 있을 것으로 생각하며 흑색종의 전이 과정에도 작용할 것으로 추정되었다. One of the most important steps in neoplastic progression is represen- ted by the invasion of surrounding normal tissues. Enzymes such as cathepsin D and matrix metalloproteinases (MMPs) are thought to be involved in the process of destruction of basement membranes and stromal invasion by tumor cells. We investigated the expression patterns of cathepsin D and MMP-2 in melanocytic nevi and malignant melanomas by immunohistochemistry. Formalin-fixed and paraffin-embedded section from 25 compound nevi, 24 dermal nevi, and 49 malignant melanomas were immunolabelled with antibodies directed against cathepsin D and MMP-2. The ratio for cathepsin D expression was 77.6% in malignant melanoma and 75.5% in benign melanocytic nevi. The ratio for MMP-2 expression was 24.5% in malignant melanoma and 6.1% in benign melanocytic nevi. The benign melanocytic nevi and malignant melanoma showed low grade expression for MMP-2. But benign melanocytic nevi and malignant melanoma were similar in the high expression of cathepsin D. These findings disclose that the expression of cathepsin D was stronger than MMP-2, and suggest cathepsin D may be related to tumorigenesis of melanocytic tumors or important a role in the development of malignant melanoma.

Structural geology of metasedimentary rocks in Daecheon area, Chungnam coalfield : 忠南炭田 大川地域 變成堆積岩의 地質構造

백상호 서울대학교 1982 국내석사

맥동관냉동기의 이차유동과 엔탈피손실

백상호 홍익대학교 1999 국내석사

구한말 신교육제도 도입에 관한 연구

백상호 전주대학교 2000 국내석사

In 1876 Chosun agreed to the "Treaty of Kanghwado" with Japan under the threat of Japanese army. It was the result of the battle caused by that Japanese ship, "Unyangho", which intrude into the territory of Chosun with no information. Japan threatened Chosun to have a conference with itself and Chosun, too weak, couldn't help agreeing to the "Byongjasuho Treaty". From then Japan set about the conquer of Chosun. Hongjang Lee, who worried about the expansion of Japan, wanted to arbitrate between Chosun and America. Once a treaty was formed between both nations, Choun agreed to the treaties with many European powers. The immediate future of Korea is certainly a riddly ; but whatever it is to be, it must be a complete severance from her past. Already has the beginning of the end appeared. For not only is Russia acting magnetically upon her north, but the Japanese have at length "dared", in spite of the "majestic terror" of the manchus, the inaugurate a new system, which, for the sake of the Korean people and civilization, impart the blessings of a just government, and introduce the religion of righteousness and peace. Chosun had to introduce science and industry of the West so rapidly that it might achieve an autonomous modernization. The best way toward such modernization was to raise those minds who could realize and make the most of the western knowledges. Okgyun Kim, Younghyo Park and other intellects suggested the establishment of modern education system for the national enlightenment. Kojong, considering the situation like the above, proclaimed an edit for education in 1895. By the edict everyone had to enter an elementary school and was able to get a higher education. Since then a modern education system was provided in Chosun. I will study the process in which that education system was established.

判別函數에 의한 鎭海灣 赤潮發生의 豫測手法

백상호 여수수산대학교 1998 국내석사

요약 : 요약 : 하계를 중심으로 한 진해만 적조의 근본원인을 규명하고 그 예측수법을 확립하기 위하여 1981년부터 1995년까지 진해만내 4개 해역에 대한 현장관측자료와 기상자료를 통계처리하여 판별함수를 구하고 이를 해석한 결과이다. 1. 마산만과 행암만, 그리고 당동만과 원문만은 각각 서로 다른 요인에 의해 적조가 발생하고 적조발생패턴도 차이가 있었다. 마산만과 행암만의 경우, 적조는 주로 6월에서 9월 사이의 하계에 집중적으로 발생하였다. 또한, 6월에는 성충에 관여하는 물리요소와 플랑크톤의 증식에 관여하는 기상요소에 의해 적조가 발생하지만, 8월에는 이들 조건에 의해 형성된 수질환경에 의해 적조가 발생하며, 9월에는 기상요소와 수질환경요소간의 평형관계에 의해 적조가 발생하는 것으로 판단되었다. (중략)

초등과학영재를 위한 원격천문대의 구축 및 활용

백상호 경인교육대학교 교육전문대학원 2015 국내석사

본 연구는 초등과학영재교육에서 활용할 수 있는 원격천문대 환경을 구축한 후, 원격천문대 시스템을 활용한 천체관측 프로그램을 개발하고, 이를 초등과학영재에게 적용하여 과학탐구능력 및 과학적 태도에 미치는 영향을 알아보는 것이 목적이다. 이를 위해 양벌초등학교 과학영재와 백사초등학교 과학영재를 대상으로 원격천문대 시스템을 활용한 천체관측 프로그램을 적용한 후 과학탐구능력과 과학적 태도 검사를 하였다. 본 논문의 결과를 요약하면 다음과 같다. 첫째, 스마트 기술을 적용하여 초등과학영재의 과학적 호기심과 탐구능력 향상을 위한 시스템 환경을 구성하기 위해 실제 관측 영상을 실시간으로 전송이 가능하도록 원격 제어가 가능한 천체망원경을 제작하였다. 또한 초등과학영재와 교사가 쉽게 배우고 사용할 수 있는 사용자 중심의 조작환경을 구성하여 달 관측뿐만 아니라 지구 주위의 다른 행성과 별자리 관측도 가능하도록 확장 설계하였다. 이때 원격천문대는 기상상황에 대응할 수 있는 장치를 탑재하고 자료가 원활히 작동되도록 성능이 검증된 부품을 사용하였으며 자료의 일반화를 위해 제작 및 정비가 용이하도록 설계하였다. 둘째, 원격천문대 시스템을 활용하기 위한 천체관측 프로그램은 교육과정을 분석하여 프로그램의 목표와 학습내용을 선정하였으며 1-3차시 원격천문대 설치ㆍ조작하기, 4-6차시 달의표면 관찰ㆍ달의 위치변화 관찰하기, 7-9차시 여러 날 같은 시각 달 관찰, 10-11차시는 선택과정으로 목성ㆍ토성ㆍ금성 관찰하기, 마지막 12차시는 천체사진 전시회로 3차시씩 총 4회 12차시 프로그램을 개발하였다. 셋째, 원격천문대 시스템을 활용한 천체관측 프로그램이 초등과학영재의 과학탐구능력 및 과학적 태도에 미치는 영향을 분석한 결과를 정리하면 다음과 같다. 과학탐구능력의 하위 요소 중 기초탐구능력과 통합탐구능력 모두에서 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났으며, 기초탐구능력과 통합탐구능력을 종합한 과학탐구능력에서도 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 원격천문대 시스템을 활용한 천체관측 프로그램이 초등과학영재의 과학적 태도에 미치는 영향 역시 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났으며, 하위요소로는 개방성, 협동성, 끈기성, 창의성에서는 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났으나 호기심, 비판성, 자진성에서는 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다.

소금을 활용한 프로젝트 학습이 전통 음악 인식 변화에 끼친 영향 연구 : 고등학교 1학년을 대상으로

백상호 중앙대학교 국악교육대학원 2019 국내석사

서양 음악의 유입과 여러 장르의 인기 있는 대중음악 등으로 인해 학생들이 국악에 대해 가지는 관심과 인식이 약화되고 있다. 이러한 시대에 연구자는 학생들이 국악에 대한 인식을 긍정적으로 변화할 수 있도록 소금을 활용한 프로젝트 학습을 연구하였다. 이를 통해 얻어진 결과는 다음과 같다. 첫째, 소금을 활용한 프로젝트 학습을 통해 국악의 생활화 정도가 상승하였다. 둘째, 전통악기에 대한 관심이 프로젝트 수업을 통해 증가하였다. 셋째, 프로젝트 수업을 통해 국악 수업에 대한 관심과 학교에서 국악교육의 필요성이 증가하였다. 이상의 결과를 살펴보았을 때, 소금을 활용한 프로젝트 학습은 학생들에게 우리 전통 음악, 국악에 대해 긍정적인 영향을 끼쳤음을 확인할 수 있다. 21세기 소통의 시대이다. 학생과 소통이 있는 수업은 학생으로 하여금 학업 역량과 더불어 삶의 영역을 변화시킬 수 있다. 이에 다음과 같은 제언을 하고자 한다. 첫째, 수업 방법의 변화가 필요하다. 일방향이 아닌 양방향 수업을 해야한다. 둘째, 콘텐츠 개발이 필요하다. 학생들에게 흥미가 될 만한 것이 무엇인지 늘 연구하고, 조사하고, 자료화하는 과정이 필요하다. 셋째, 국악 연주회 관람의 기회를 많이 주어야 한다. 종합적으로 볼 때, 교사 인식 전환이 필요하다. 교사는 국악 수업을 할 때, 다양한 정보와 자료 및 자원을 제공하고, 그것을 학생들이 선택하게 하고, 직접 조사하고, 익히게 해야 한다. 그 때, 그 수업은 학생으로 하여금 국악에 대해 긍정적인 인식과 국악 애호심을 가지게 할 수 있을 것이다. The influx of Western music and popular pop music of various genres have weakened students' interest and perception of Korean Traditional Music. In these times, researcher studied project learning using Sogeum so that students could positively change their perception of Korean Traditional Music. The results obtained from this are as follows: First, the level of everyday life of Korean Traditional Music increased through project learning using Sogeum. Second, interest in traditional musical instruments increased through project learning. Third, interest in Korean Traditional Music classes and the need for Korean Traditional Music education in schools increased through project learning. Looking at the above results, it is possible to verify that the study of the project learning using Sogeum has had a positive impact on Korean traditional music and Korean Traditional Music to students. It is an era of communication in the 21st century. Classes that communicate with students can change the field of life as well as academic ability. I would like to make the following suggestions. First, a change in teaching methods is needed. You should have two-way classes, not one-way. Second, it is necessary to develop contents. It is always necessary to research, investigate, and document what is interesting to students. Third, you should give many opportunities to watch Korean Traditional Music concert. Overall, there is a need for a change in teacher perception. When teaching Korean Traditional Music, teachers should provide a variety of information, materials, and resources, and let students choose, investigate, and learn them. At that time, the class will give students a positive sense of Korean Traditional Music and a fondness for it.

텅스텐광 개발을 위한 선광공정 설계 및 경제성 분석

백상호 과학기술연합대학원대학교 2018 국내박사

In the recent years, due to rising price of minerals and control of resource-rich countries, securing long-term perspective mineral resources is expected to be difficult. For these reasons, development of overseas resources and redevelopment of exhausted mines are becoming important issues. Tungsten is one of the ten rare earth metals, as recognized by the government of Republic of Korea in 2009, essential to the domestic industry. Tungsten is at a high risk because they are processed only in a number of countries. In particular, China accounts for more than 50% of world reserves and 80% of production. On top of that, various export regulations and high value-added policies are implemented to protect their domestic tungsten industry. Therefore, tungsten industry is highly dependent on production of China, regardless of price fluctuations. In this work, for the development of tungsten ore in Korea, the development potential of the proposed mine was examined through the optimization of the unit separation technique, the process design, and the feasibility study. Optimization study of unit separation technique was performed using design of experiments (DOE) based on response surface method (RSM). First, the key factors and levels of each separation technique were determined through literature reviews and preparatory experiments. Based on this, each separation technique was optimized through the central composite design (CCD), and the results of applying the level derived from the optimization were verified at the 95% confidence interval. As a result, the goodness of fit on a regression model of each separation technique was high. In the verification test for each separation technique, it was confirmed that the actual value and the predicted value exist between the 95% confidence interval. Therefore, it proved that the regression model of the unit separation technique obtained through RSM is fit. A separation process for tungsten ore was developed by combining unit separation techniques optimized through RSM. Combinations of jig concentration, shaking table (Process A), jig concentration and flotation (Process B) were developed. The WO3 grade and recovery of the concentrates were 65.0% and 51.1% for the Process A and 65.3% and 74.0% for the Process B. And for the feasibility study, a beneficiation process capacity of 1,000 t/day for two processes was designed to estimate the scale of the processing equipment. Based on the developed process, the cost required for mining development was calculated and the feasibility study was conducted. Investment costs are divided into capital expenditures and operating expenditure. For the capital expenditures, Process A was estimated at about 110 billion won and Process B was estimated at about 111.5 billion won. Operating costs were calculated at 40.32 and 40.99 won per ton of ore for Process A and B, respectively. Based on the estimated investment cost, net present value (NPV) and internal rate of return (IRR) analysis were conducted. In the case of Process A, it confirmed that it has exceeded break-even point in about eight years since the start of business (NPV) and IRR is estimated to be about 9% over 10 years, which is higher than the current interest rates. However, with the potential risks related to the longevity of mine for the 10-year project period should be taken into consideration. Process B is expected to turn profitable in 4 years, with profits of about 128.3 billion won after 10-year operation (NPV) and IRR was estimated at 28% in the final year. This high profit indicates the efficiency and competence of the developed beneficiation process. Thus suggesting that the development value of Process B to be high. 최근 광물 가격의 상승과 자원보유국의 자원통제로 장기적인 관점에서 광물 자원의 확보에 어려움이 따를 것으로 예상된다. 이에 활발한 해외자원개발 및 폐 광산의 재개발이 중요한 문제로 대두되고 있다. 텅스텐은 2009년 정부 지정 10대 희유금속의 하나로, 국내 산업에 필수적인 금속이다. 이러한 텅스텐은 특정 국가에 자원이 편중되어 있어 공급 위험도가 높다. 특히, 중국은 세계 매장량의 50% 이상, 생산량 또한 80% 이상을 차지하고 있다. 여기에 자국 텅스텐 산업 보호를 위해 각종 수출규제 및 고부가가치화 정책을 시행하고 있어, 텅스텐은 가격 등락에 관계없이 중국 의존도가 높은 금속이다. 본 연구에서는 국내부존 텅스텐광을 대상으로, 단위 선별기술의 최적화, 최적화된 단위 선별기술을 조합한 선광공정 설계 그리고 설계된 공정의 경제성 평가를 통해 해당 광산의 개발 가능성을 검토하였다. 실험계획법 기반 반응표면법을 통해 단위 선별기술 (비중선별, 부유선별)의 최적화 연구를 수행하였다. 먼저 문헌 조사와 예비 실험을 통해 각 선별기술에 대한 핵심 인자와 수준을 결정하였다. 이를 토대로 중심합성설계를 통해 단위 선별기술을 최적화하였으며, 최적화로 도출된 제원을 적용하여 95% 신뢰구간에서 검증을 수행하였다. 연구결과, 각각의 선별기술에 대한 적합도가 높은 회귀모델을 추정하였다. 또한 각 선별기술에 대한 검증 실험에서는 실측치와 예측치가 95% 신뢰구간 사이에 존재하는 것을 확인하여, 반응표면법을 통해 얻은 단위 선별기술의 회귀모델이 적합하다는 것을 증명하였다. 반응표면법을 통해 최적화된 단위 선별기술이 조합된 선별공정을 개발하였다. 지그선별과 요동 테이블이 조합된 선별공정 (Process A)과 지그선별과 부유선별이 조합된 선별공정 (Process B)을 개발하였으며, Process A는 정광의 WO3 품위와 회수율이 각각 65.0%와 51.1%, Process B는 각각 65.3%와 74.0%인 결과를 얻었다. 또한 경제성 분석을 위하여, 두 공정에 대한 1,000 t/day 규모의 선광공정을 설계하여 선광 장비의 규모를 추정하였다. 개발된 선광공정을 바탕으로 사업에 필요한 비용을 산정하고 사업 타당성 평가를 수행하였다. 비용은 투자비용과 운영비용으로 대별하였다. 투자비용의 경우, Process A는 약 1,100억 원, Process B는 약 1,115억 원으로 추산되었다. 운영비용은 Process A가 광석 톤당 40,320원, Process B가 40,990원 이었다. 추산된 사업비용을 바탕으로 NPV, IRR 분석을 수행하였다. Process A의 경우, 사업 시작 이후 8년 정도에 이르러 손익 분기점을 돌파한다는 것을 확인하였다. IRR은 10년간의 추정 수익률이 약 9% 정도로, 현재의 금리를 고려하면 높은 수치이다. 그러나 10년이라는 사업기간 동안 상주하는 광산의 위험을 고려한다면 신중하게 결정해야 한다고 판단된다. Process B의 경우, 4년 이후로는 흑자 전환으로, 10년 사업시점에서 수익이 약 1,283억 원 이었으며, IRR은 최종적으로 28%로 수렴하였다. 이러한 높은 수익은 개발된 선광공정이 효율적이고 체계적임을 의미하며, 개발 가치가 높은 것으로 판단된다.

국내 해양생물 유전체정보의 체계적 관리를 위한 프로세스 모델 및 데이터베이스 구축

백상호 숭실대학교 대학원 2017 국내석사

나고야의정서의 발효는 전 세계적으로 유전자원에 이용 및 이익 공유에 대한 관심을 높이게 되었다. 따라서 자국의 실물자원뿐만 아니라 유전정보의 관리가 필요하다. 국내의 경우 해양생물 유전체 연구가 초기단계로서 활발히 진행되고 있으나 체계적인 유전체정보관리를 못하고 있는 것이 현실이다. 본 연구에서는 SOP(Standard Operating Procedure)를 이용하여 해양생물 유전체정보의 등록 및 검증 프로세스를 정의하였고 국외 선진사례를 분석하여 원천데이터를 구분하고 메타데이터 모델을 설계하였다. 또한 등록자의 편의를 고려한 웹기반의 원천데이터 등록시스템을 구축하여 정보를 체계적으로 관리 할 수 있도록 하였다. 시스템의 파일공유는 유전체정보의 빠른 분석과 동시 접속이 가능하도록 GPFS(General Parallel File System) 방식을 사용하여 네트워크 및 로컬시스템 방식보다 나은 성능을 구현하였다. The effectuation of the Nagoya protocol has increased worldwide interest in using and sharing of genetic resources. Therefore, It is necessary to manage genetic information as well as domestic resources. In the case of Korea, Marine genomic research is early stage. but it has not systemic management about genomic information. In this study, The Standard Operating Procedure(SOP) was used to define the registration and verification process of marine genome information. We divided hierarchy of NGS Raw-data and designed metadata models through analysis of advanced cases. It also developed a Web-based data registration system to systematically manage marine genome information. Network system is equipped with a General Parallel File System (GPFS) for faster sharing of data between multiple servers.

Raffinose Synthesis by α-Galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 : Absidia corymbifera IFO 8084由來α-ガラクトシダ─ゼによるラフィノ─スの合成

백상호 Hokkaido University 2000 해외박사

라피노스(Raffinose)는 비소화성 올리고당으로서 지금까지 알려져 있는 올리고당 중에서도 특히 장내유용세균인 비피더스균에 의해서 선택적으로 자화되기 쉬우며, 이 들 세균을 현저하게 증식시키는 효과를 가진 갈락토 올리고당의 일종으로 알려져있다. 본 연구에서는 효소적인 방법에 의하여 고가의 올리고당의 합성공정을 확립하기위하여 새로운 효소를 생산하는 미생물을 검색하고 이를 분자레벨에서 규명함으로써 산업적으로 유용하게 응용하기 위한 기초적 연구를 행하였다. 미생물의 검색결과, 본 연구에서는 사상균인Absidia corymbifera IFO 8084에서 단리한 α-galactosidase가 약10%의 축합전이율로 목적하는 라피노스당을 생산하는것을 확인하였다. 본 연구에서는Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 천연α-galactosidase효소를 정제하여 아미노산의 부분배열을 결정하였다. 또한, mRNA를 단리시 이를 주형으로 cDNA를 합성하여 cDNA library를 구축하였다. 아미노산의 부분배열을 이용하여 제작한Probe를 이용하여 cDNA libaray를 검색한 결과 목적한 효소유전자의 80%에 해당하는 유전자를 획득하였다. 최종적으로 RT-PCR을 실시하여 전유전자를 취득시 염기배열을 결정하였다. 취득한α-galactosidase의cDNA는 2,190염기로 구성되어 이들 염기배열은 730개의 아미노산을 코드하고 있으며, 예측되는 단백질 분자량은 82,712Da임이 밝혀졌다. 이러한 결과를 분석비교한 결과Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase효소는 테트라머(tetramer)로 구성되는 올리고머(Oligomer)임이 밝혀졌다. 또한 기존의α-galactosidase유전자배열과 비교분석한 결과 박테리아계의 family36과 높은 상동성을 보였다. 본 연구에서는 취득한 곰팡이 유래의α-galactosidase유전자의 대장균에서의 대량발현을 시도하였다. 즉, 취득한α-galactosidase의 cDNA를 파아지 유래의 강력한 T7프로모터의 하류에 삽입하여 얻어진α-galactosidase의 cDNA클론을 숙주대장균인 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환시킴으로써 단백질의 합성을 유도하였다. 그러나, 본 발현계 (pET21(b+)/galα)에 의해서 얻어진 단백질은 총 단백질의 20%만이 활성을 소유하고 있으며 나머지의 80%는 세포질 내에서 불용성의 봉입체를 형성함으로써 비활성체 단백질로 발현되었다. 따라서 본 연구에서는 활성단백질을 얻기위하여α-galactosidase의 cDNA를pET32Trx벡터의Thioredoxin배열의 하류에 삽입하여 얻어진pET32Trx /galα를 대장균에 형질전환시킨 결과 가용성 퓨전단백질의 대량발현에 성공하였다. 얻어진 퓨전단백질의 His-tag를 이용하여 일단계로 단일효소를 정제할 수 있었다. 정제된 효소는 온도, pH, 라피노스합성능 등에 있어서Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase천연효소와 동일한 결과를 얻었다. 본 연구에서 얻어진 결과를 기초로Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase효소의 활성부위의 해명과 또한 유전자조작을 통한 변이체를 작성하여 목적하는 올리고당 라피노스의 합성능을 더욱 고조시킨 새로운 효소의 개발이 기대되어 진다. 糖質, 特に砂糖は從來1次機能のエネルギ-源および2次機能の甘味料として他の糖質に比べ非常に優れた味質と物性を用い, 多用されてきた. しかし, 近年になり糖質の過剩攝取による肥滿や成人病の問題の原因物質として認識され, 砂糖の消費は減少傾向が續いている. その流れから, 健康の維持や回復に寄與する, 卽ち, 生理調節機能を有する3次機能としての機能性糖質の要求とそれに應した新たな機能性糖質の開發が重要視されている. ラフィノ-スは難消化性オリゴ糖の一種類であり, 特にビフィズス菌に選擇的に資化されやすく, これを顯著に增殖される作用があり, 腸內フロ-ラの改善に有效であることが明らかになってきた. また, 最新の硏究報告によるとアトピ-皮膚炎への影響が疑われるカンジダ菌を有意に減少させ, ラフィノ-スの經口投與が有效な治療手段になりうることが明らかになった. その他, ラットをモデルとした一連の硏究によって肝障害(B型肝炎)を抑制することが報告されているし, 齒周病と腸內フロ-ラによる免疫賦活との關連を硏究した例ではラフィノ-ス投與が多型核白血球(好中球)の貪食作用や, マイトジェン(PHA)の刺激による非特異的Tリンパ球幼若化反應を亢進する事などが報告されている. また, 臟器移植の際, 保存液として有效で有り, 卽ち, 生理調節機能性糖質としての役割だかじゃなく多方面のラフィノ-スの利用價値が增加し續けている. ラフィノ-スは現在, 工業的には砂糖の原料であるビ-トの糖蜜から抽出工程により製造されている(日本甛菜製糖株式會社). しかし, ビ-トの中に含まれているラフィノ-スの含量は0.1%程度と極めて微量であり, 比較的高價なオリゴ糖である. そこで, 酵素合成法によって有用なラフィノ-スをより簡單かつ低コストで生産することが望まれている. ラフィノ-スの酵素合成は糖轉移酵素であるガラクトシルトランスフェラ-ゼによって特異的の合成することが旣に可能であるが, 基質であるUDP-galactoseが非常の高價であり, またこの酵素自體が不安定な性質を持っているためこの方法によるラフィノ-スの合成は現實的に不可能である. 一方, 加水分解酵素であるα-カラクトシダ-ゼ(EC3.2.1.22)は砂糖の結晶化に惡影響を與える有害物質としてのラフィノ-スを除去するため使われてきたが, この酵素の縮合反應, 卽ちラフィノ-スの分解産物である砂糖とガラクトスを基質とした逆反應を利用し, ラフィノ-スを合成出來る可能性がある. さらに, 最近消費が減少し續いている安價の砂糖を利用し, 經濟的に附加價値が高いラフィノ-スを創出できるという有望な方法である. しかし, 一般的に逆反應でオリゴ糖を合成する場合, 轉移反應を利用して合成する時に比べて反應速度が遲いため, 大量の酵素で長時間反應させる必要性が豫想される. また, 特異性が低下し, 生成物は種種の結合樣式のオリゴ糖の混合物になる可能性がある. 從って, オリゴ糖の合成に逆反應を行うためにはより高い特異性を持っている加水分解酵素の利用とその酵素を大量に得る必要が當面課題になってくる. 我我はこのような觀點から有用なラフィノ-スをより經濟的かつ高特異的に生産するためには, Absidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼ(EC3.2.1.22)がこのような目的に適したことを確認した. 卽ち, 逆反應を引き起こすため受容體として高濃度の砂糖(70%)と特異性を高めるために供與體として低い濃度のα-D-ガラクトス(10%)を採用した反應系を構築し, ラフィノ-スの合成を試み, 10%程度の轉換率を得た. この轉換率はAjisakaらによって報告された轉換率よりやや少ないものであるが, 本酵素の方が高い特異性を持ち, より立體選擇的にラフィノ-スを合成することが分かった. しかし,絲狀菌であるAbisidia corymbifera IFO 8084が生産するα-ガラクトシダ-ゼの分泌量は非常に少ないため, 安定したラフィノ-スの大量生産を實用化させるためにはより簡單, 且つ大量にこの酵素を得ることが必要である. さらに, 分子レベルでの解析と改變を通して一層逆反應の機能を强化した新しい酵素の開發が期待される. この樣な目的は, 我我はAbsidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子をcDNAクロ-ニングよって取得し, その鹽基配列を決定した. 取得したcDNAは2,190bpからなり, 730アミノ酸殘基をコ-ドし, そのタンパク質の分子質量は82,712Daと決定された. 推定アミノ酸配列の分析結果, Abisidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼの構造が4量體であることが明らかになった. このα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子の推定アミノ酸配列を旣知のα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子と比較したところ, family36と高い相同性を示した. 近年, 遺傳子組換え技術の目覺ましい進展により, 種種の宿主-ベクタ-系を利用し, 組換えタンパク質を大量に生産させることが可能になっている. その中でも, 大腸菌を宿主とする發現系は菌體の增殖速度が早く, 大量培養が簡單であり, 何よりも組換えタンパク質を大量に生産するため, 工業的にみても非常に魅力的なタンパク質生産システムである. 從って, 我我は大腸菌を宿主として選び, Abisidai corymbifera IFO 8084から取得したα-ガラクトシダ-ゼcDNAの大量發現を試みた. α-ガラクトシダ-ゼcDNAを大腸菌用發現ベクタ-pET21b(+)のファ-ジ由來の强力なT7プロモ-タ下流に揷入し宿主大腸菌BL21(DE3)株より供給されるT7RNAポリメラ-ゼにより轉寫させた. しかし, この發現プラスミドpET21(b+)/galαによるα-ガラクトシダ-ゼの菌體タンパク質の20%にも及ぶ大量發現が見られたが全ての發現タンパク質は細胞內で不溶性の封入體を形成し酵素活性は見られなかった. そこで不溶性の封入體を回收し, 8Mの尿素で可溶化後, 段階的に透析の尿素濃度を低下させ, 可溶化の再生を試みたが, α-ガラクトシダ-ゼの活性は見られなっかた. そこで我我は可溶性發現タンパク質を得るためにcDNAを大腸菌用發現ベクタ-pET32-EK/LICのthioredoxin配列の下流の揷入し, 融合タンパク質發現系を構築した. 構築した發現ベクタ-pET32Trx/galαを大腸菌に形質轉換したところ, 融合タンパク質の大量發現が確認された. さらにベクタ-由來のhistidine tagを利用したアフィニテイ-クロマトグラフィ-により一段階で單一酵素として精製された. 精製酵素の融合タンパク質をenterokinaseによって切斷し, 本酵素のN末端配列を決定したところ, native酵素のN末端配列と同じであった. 精製した融合タンパク質のpHと溫度に對する擧動は, Absidia corymbifera IFO 8084からの精製酵素とほぼ同じであった. さらにこれらの知見を基に, 活性部位の解明と變異株の作成によるラフィノ-スの合成をさらに效率よく行う優れた新しい酵素の開發が期待できる.