Expression of a Fusion Protein with Cry1Ac Protein and a Scorpion Insect Toxin in Acrystalliferous Bacillus thuringiensis Strain

노종열,부경생,제연호,최재영,Ming Shun Li,장진희,심희진,신상철 한국잠사학회 2004 International Journal of Industrial Entomology Vol.8 No.1

Expression of a fusion protein between B. thuringiensis crystal protein, Cry1Ac1 and a scorpion insect toxin (AaIT, Androctonus australis Hector insect toxin) in acrystalliferous B. thuringiensis strain (Cry-B strain) was examined. The cry1Ac1 gene was cloned in B. thuringiensis- E. coli shuttle vector, pHT3101, under the control of the native cry1Ac1 gene promoter (pProAc) and a gene encoding AaIT was inserted in XhoI site in the middle of the cry1Ac1 gene (pProAc-ScoR). B. thuringiensis Cry-B strain carrying pProAc-ScoR (ProAc- ScoR/CB) produced an inclusion body of irregular shape and the expressed fusion protein is approximately 65 kDa in size. Sporulated cells and spore-crystal mixtures of ProAc-ScoR/CB had insecticidal activity against Plutella xylostella larvae, showing LT50 of ProAc-ScoR/CB (22.59 hrs) lower than that of ProAc/CB (30.06 hrs) at 1 ´ 107 CFU/cm2. These results suggest that the fusion protein including a B. thuringiensis crystal protein and an AaIT may be functionally expressed in B. thuringiensis. Moreover, we verified the additive toxicity of AaIT, which is a new feasible candidate for insect control.

Expression of Bacillus thuringiensis mosquitocidal toxin in an antimicrobial Bacillus brevis strain

노종열,Yong Wang,Qin Liu,Xueying Tao,Hong Guang Xu,심희진,최재영,이광식,진병래,제연호,김양수 한국응용곤충학회 2010 Journal of Asia-Pacific Entomology Vol.13 No.1

Brown blotch is a common disease of many mushrooms, especially oyster mushrooms, in Korea. Recently, we isolated a promising Bacillus brevis strain which has antimicrobial activity against Pseudomonas tolaasii, a serious mushroom pathogen. In this study, in order to confer insecticidal activity, a recombinant B. brevis strain was constructed via the expression of Bacillus thuringiensis mosquitocidal crystal protein. A B. thuringiensis expression vector (pPro11A), which contained the cry11Aa gene under the control of cry1Ac promoter, was introduced into this B. brevis strain. The recombinant B. brevis strain successfully expressed and produced rhomboidal shaped Cry11A protein, although the initiation time of expression was slower than that of B. thuringiensis Cry-B transformant. The insecticidal and antimicrobial activities of the transformant were verified using two dipteran larvae, Aedes aegypti and Culex pipiens, and four bacteria, including P. tolaasii, respectively. These results demonstrate that the introduction of B. thuringiensis insecticidal activity to antimicrobial Bacillus strains might be a useful tool to construct dual functional Bacillus strains.

Spacing Effect of the Intervening Sequences between Ribosome Binding Site and the Initiation Codon on Expression of Bacillus thuringiensis d-Endotoxin

노종열,최재영,제연호,부경생,Ming Shun Li,장진희,심희진,우수동 한국잠사학회 2003 International Journal of Industrial Entomology Vol.6 No.1

Expression and Characterization of a Recombinant Cry1Ac Crystal Protein Fused with Cry11A in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Cry-B

노종열,Ming Shun Li,Jin Hee Chang,Sang Chul Shin,부경생,제연호 한국응용곤충학회 2004 Journal of Asia-Pacific Entomology Vol.7 No.1

The expression of a fusion protein comprised of two Bacillus thuringiensis crystal proteins, lepidopteran toxic Cry1Ac and dipteran toxic Cry11A, in B. thuringiensis Cry-B strain was examined. To construct a recombinant gene, the cry11A gene was inserted behind the XhoI site in the middle region of the cry1Ac gene, but the C-terminal fragment (structure fragment) of Cry1Ac was removed in fusion construction (pProAcN-11A). Also, the cry11A gene was singly cloned under the cry1Ac promoter (pPro11A). The B. thuringiensis Cry-B strain with pProAcN-11A (ProAcN-11A/CB) produced ovoid shaped parasporal inclusions of relatively small size, while Pro11A/CB produced rhomboid shaped ones. Unexpectedly, ProAcN-11A/CB produced a protein of approximately 60 kDa while Pro11A/CB and ProAc/CB produced typical 72 kDa and 130 kDa proteins, respectively. However, ProAcN-11A/CB exhibited significant dual toxicity on larvae from two insect orders, 72.7% on Plutella xylostella and 65.5% on Culex pipiens. The current results suggest that expression and crystallization of a fusion protein between toxic fragment of Cry1Ac and Cry11A was incomplete in the Cry-B strain though ProAcN-11A/ CB produced parasporal inclusions and had dual toxicity.Key words Bacillus thuringiensis, Cry1Ac, Cry11A, Cry-B, fusion protein

Expression of a Recombinant Bacillus thuringiensis d-Endotoxin Fused with Enhanced Green Fluorescent Protein in Escherichia coli

노종열,진병래,부경생,제연호,Ming Shun Li,장진희,심희진 한국잠사학회 2004 International Journal of Industrial Entomology Vol.8 No.2

The expression of a fusion protein comprised of the B. thuringiensis crystal protein, Cry1Ac, and enhanced green fluorescent protein (EGFP) in Escherichia coli XL1-blue was examined. Three recombinant plasmids were transformed into E. coli XL1-blue and named as ProAc/Ec, MuEGFP/Ec and ProMu-EGFP/Ec, respectively. All transformants were observed by light and fluorescence microscopy at mid-log phase. The expression in E. coli transformants, ProMu-EGFP/Ec and MuEGFP/Ec, exhibited bright enough fluorescence to be observed. Furthermore, ProMu-EGFP/Ec produced fluorescent inclusions, which may have been recombinant crystals between EGFP and Cry1Ac while MuEGFP/Ec expressed soluble EGFP in cell. In SDS-PAGE, ProAc/Ec had 130 kDa crystal protein band and MuEGFP/Ec had thick 27 kDa EGFP band. However, ProMu-EGFP/Ec had about 150 kDa fusion protein band. Accordingly, these results indicated that a fusion protein between the B. thuringiensis crystal protein and a foreign protein under the lacZ promoter was successfully expressed as granular structure in E. coli. It is suggested that the E. coli expression system by N-terminal fusion of B. thuringiensis crystal protein may be useful as excellent means for fusion expression and characterization of B. thuringiensis fusion crystal protein.

한국 토양으로부터 새로운 무독성 Bacillus thuringiensis 균주의 분리

노종열,박현우,김호산,진병래,강석권 한국응용곤충학회 1995 한국응용곤충학회지 Vol.34 No.4

전국의 토양시료로부터 3가지의 곤충목인, 나비목, 파리목, 딱정벌레목에 속하는 10종의 곤충에 대하여 독성을 보이지 않는 4종의 Bacillus thunngiensis 균주를 분리하였다. 이들 4종의 균주를 각각 NTB-1, NTB-2, NTB-3, NTB-4로 명명하였다. 취상차 현미경과 주사전자현미경을 통해 관찰된 이들 4종 균주의 내독소 단백질 형태는 모두 원형이었으며, 각 균주의 내독소 단백질과 plasmid DNA 특성을 규명하기 위해 단백질 전기영동과 제한효소 분석을 실시하였다. 그 결과 이들 균주의 내독소 단백질과 plasmid DNA pattern은 이미 알려져 있는 무독성 균주들과는 다른 양상을 보여, 기존의 무독성 균주와 다른 새로운 균주임을 알 수 있었다. Four Bacillus thuringiensis isolates obtained from soil samples in Korea produce parasporal inclusions non-toxic to 10 insect species of three orders, Lepidopera, Diptera and Coleoptera. These four isolates are named NTB-1, NTB-2, NTB-3 and NTB-4, respectively. The morphology of parasporal inclusions of four isolates observed by phase contrast- and scanning electron microscope was all ovoid. Characterization of four non-toxic B. thuringiensis isolates was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and restriction endonuclease analysis. The results showed that parasporal inclusion proteins and total plasmid DNA profiles of four isolates are different from other known non-toxic B. thuringiensis strains', suggesting that four isolates are novel.

국내 SFTS와 쯔쯔가무시증 매개진드기 감시현황

노종열 한국응용곤충학회 2017 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2017 No.10

국내에서 발생하는 진드기 매개질환 중에서 SFTS(중증열성혈소판감소증후군)는 법정감염병으로 지정된 2013년이후 지속적인 환자 증가뿐만 아니라 사망자가 늘고 있어 국민적 관심이 높은 질환이다. 또한 대표적인 가을철발열성 질환인 쯔쯔가무시증도 2013년 이후 1만 여명 내외의 환자가 지속적으로 발생하는 대표적인 질환의 하나이다.SFTS를 매개하는 참진드기(tick)는 우리나라 전역에 서식하고 있고, 모든 성장단계에서 숙주를 흡혈하여 병원체를감염시키고 있어 감염병 발생 차단을 위한 방제 전략수립에 어려움이 많은 매개체로 알려져 있다. 쯔쯔가무시증을매개하는 털진드기(chigger mite)도 야생 설치류와 사람 등 포유동물에 기생하며 흡혈을 통해 병원체를 전파하는것으로 알려져 있다. 질병관리본부에서는 이들 진드기의 국내 발생양상을 감시하기 위해 전국적인 감시망을 구축하여시기별 발생밀도 및 국내 분포조사를 실시하고 진드기의 병원체 보유여부 확인을 통해 분석한 자료를 대국민홍보자료를 제공하고 있어 이를 소개하고자 한다.

Expression of a Recombinant Cry1Ac Crystal Protein Fused with a Green Fluorescent Protein in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Cry-B

노종열,Jin Hee Chang,최재영,부경생,제연호,Ming Shun Li,In Hee Lee 한국미생물학회 2004 The journal of microbiology Vol.42 No.4

To investigate the co-expression and crystallization of a fusion gene between the Bacillus thuringiensis crystal protein and a foreign protein in B. thuringiensis, the expression of the Cry1Ac fused with green fluorescent protein (GFP) genes in a B. thuringiensis Cry-B strain was examined. The cry1Ac gene was cloned in the B. thuringiensis-E. coli shuttle vector, pHT3101, under the control of the native cry1Ac gene promoter, while the GFP gene was inserted into the XhoI site upstream of the proteolytic cleavage site, in the middle region of the cry1Ac gene (pProAc-GFP). The B. thuringiensis Cry-B strain carrying pProAc-GFP (ProAc-GFP/CB) did not produce any inclusion bodies. However, the transformed strain expressed fusion protein forms although the expression level was relatively low. Furthermore, an immunoblot analysis using GFP and Cry1Ac antibodies showed that the fusion protein was not a single species, but rather multiple forms. In addition, the N-terminal fragment of Cry1Ac and a non-fused GFP were also found in the B. thuringiensis Cry-B strain after autolysis. The sporulated cells before autolysis and the spore-crystal mixture after autolysis of ProAc-GFP/CB exhibited insecticidal activities against Plutella xylostella larvae. Accordingly, the current results suggest that a fusion crystal protein produced by the transfomant, ProAc-GFP/CB, can be functionally expressed but easily degraded in B. thuringiensis.

채집기를 이용한 쯔쯔가무시증의 매개체인 털진드기(Acarina: Trombiculidae)개체군의 환경 및 계절별 발생밀도 조사

박원일,노종열,신은희,박후남,이현주,박찬,신이현 한국응용곤충학회 2011 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2011 No.05

쯔쯔가무시증의 매개체인 털진드기의 채집을 위해 야생설치류를 포획하는 대체 방법으로 고안된 진드기 접착채집기를 이용하여 2010년 4월부터 2011년 3월까지 경상북도 고령군 및 경기도 화성시에서 계절적 발생밀도 조사를 실시하였다. 조사 기간 동안 고령군에서 1,354개체, 화성시에서 153개체, 총 1,507개체의 털진드기 가 채집되었으며, 개체군의 환경별 발생밀도는 각 조사 지역마다 다르게 나타났다. 고령군에서는 논두렁에서 581개체(42.8%)로 가장 많이 채집되었고, 그 다음으로 밭(356개체, 26.3%), 냇가(318개체, 23.5%), 산(99개체, 7.3%)순이었으며, 화성시 에서는 밭에서 135개체(88.2%)로 가장 많았고, 수로(11개체, 7.2%), 산(6개체, 3.9%), 밤나무숲(1개체, 0.7%)순이었다. 털진드기 개체군의 계절적 발생양상을 보면 연 중 2개의 정점(peak)을 보이는데 4월에 작은 정점을 보인 후 여름에는 채집되지 않 았다가 11월에 큰 정점을 나타냈다. 본 조사를 통해 주목할 만한 점으로 가을철 발 생 이후 털진드기가 겨울을 지나 봄까지 지속적으로 활동하는 것이 확인되었다. 이상의 채집기를 이용한 진드기 발생밀도조사는 설치류 채집을 통한 밀도조사와 유사한 양상을 보였으며, 보균율 검사와 종합하여 쯔쯔가무시증의 유행예측에 적 용할 수 있을 것이다.

국내 주요 말라리아 위험지역에서의 매개모기 밀도와 환자발생 양상(2009~2012)

김성윤,유대현,노종열,장규식,이욱교,신이현,박미연 한국응용곤충학회 2013 한국응용곤충학회 학술대회논문집 Vol.2013 No.10

말라리아 감염이 확인된 1993년 이래 DMZ 인근 지역을 중심으로 발생하였던 환자가 1997년 이후 강원 동․서부와 경기 남부에 이르기까지 점차 확대되었다. 현 재까지 강원, 경기, 인천 지역을 중심으로 매년 국내 말라리아환자 발생의 65% 이 상이 보고되고 있다. 얼룩날개모기에 의해 발생하는 말라리아는 국내의 경우 장기 잠복기(5~13개월)와 일부 단기잠복기(1~2개월)의 혼합된 특성을 나타내는 것으 로 알려져 있다. 본 연구는 국내 주요 말라리아 위험지역인 강원도, 경기북부, 인천 광역시 내 16개 시․군, 총 34개 지점에서 2009년부터 2012년 동안 주별 채집된 얼룩 날개모기의 밀도와 말라리아 환자의 발생 양상을 비교 분석하였다. 2009년 말라리아 위험지역에서 발생한 환자는 6월에 가장 높게 보고되어 8월에 최성기를 맞이한 매개모기와 차이를 나타냈다. 또한 2010년과 2011년에도 당해 연 도 매개모기의 최성기인 8월보다 시기적으로 앞선 6월에 환자발생이 최고조에 다 다랐다. 이는 매개모기의 밀도가 최성기에 이룬 후, 약 10개월이 지나 말라리아환 자의 보고가 정점을 보이는 장기잠복기의 특성을 나타냈다. 더불어 2011년 매개모 기의 최성기가 9월 중순에 나타나 그 다음해인 7월에 높은 환자 발생이 보고되었던 2012년에도 이러한 시기적 특성을 띄는 것으로 확인되었다. 향후 기후요소와 매개 모기 밀도 그리고 양성율과의 상관관계를 통해 환자발생 양상에 대한 보다 면밀한 분석이 필요할 것으로 사료된다.