Enhanced Production of Cellobiase by a Marine Bacterium, Cellulophaga lytica LBH-14, in Pilot-Scaled Bioreactor Using Rice Bran

Wa Cao(고와),Hung-Woo Kim(김형우),Jianhong Li(이잔홍),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2013 생명과학회지 Vol.23 No.4

본 연구의 목적은 통계학적 방법을 사용하여 해양미생물 Cellulophaga lytica LBH-14가 생산하는 cellobiase의 생산조건을 확립하는 것이었다. 이 균주의 생육에 최적인 미강, ammonium chloride 및 배지의 초기 pH는 100.0 g/l, 5.00 g/l 및 7.0이었으나, 이 균주가 생산하는 cellobiase의 생산에 최적인 조건은 각각 91.1 g/l, 9.02 g/l 및 6.6이었다. 이 균주의 생육에 최적인 K₂HPO₄, NaCl, MgSO₄?7H₂O 및 (NH₄)₂SO₄ 등과 같은 배지의 염농도는 각각 6.25, 0.62, 0.28 및 0.73 g/l이었으나, cellobiase 생산에 최적인 염들의 농도는 각각 4.46, 0.36, 0.27 및 0.73 g/l이었다. 또한, 균체의 생육 및 cellobiase의 생산에 최적인 온도는 각각 35 및 25℃이었다. 플라스크 규모에서 최적화한 조건으로 파이롯트 규모의 생물배양기에서 cellobiase를 생산한 결과, 이 균주가 생산하는 cellobiase의 생산성은 92.3 U/ml이었으며, 이는 최적화하기 전에 비하여 5.4배 향상된 것 이었다. 본 연구를 통하여 쌀 도정공정의 부산물인 미강 및 ammonium chloride를 cellobiase를 생산하는 기질로 개발하였으며 해양 미생물을 사용하여 cellobiase의 생산기간을 7일에서 3일로 단축시켰다. 또한, 본 연구를 통하여 C. lytica LBH-14가 생산하는 cellobiase의 최적 생산조건은 이 균주가 생산하는 CMCase의 최적 생산조건과 다르다는 사실을 확인하였다. The aim of this work was to establish the optimal conditions for the production of cellobiase by a marine bacterium, Cellulophaga lytica LBH-14, using response-surface methodology (RSM). The optimal conditions of rice bran, ammonium chloride, and the initial pH of the medium for cell growth were 100.0 g/l, 5.00 g/l, and 7.0, respectively, whereas those for the production of cellobiase were 91.1 g/l, 9.02 g/l, and 6.6, respectively. The optimal concentrations of K₂HPO₄, NaCl, MgSO₄·7H2O, and (NH₄)₂SO₄ for cell growth were 6.25, 0.62, 0.28, and 0.42 g/l, respectively, whereas those for the production of cellobiase were 4.46, 0.36, 0.27, and 0.73 g/l, respectively. The optimal temperatures for cell growth and for the production of cellobiase by C. lytica LBH-14 were 35 and 25℃, respectively. The maximal production of cellobiase in a 100 L bioreactor under optimized conditions in this study was 92.3 U/ml, which was 5.4 times higher than that before optimization. In this study, rice bran and ammonium chloride were developed as carbon and nitrogen sources for the production of cellobiase by C. lytica LBH-14. The time for the production of cellobiase by the marine bacterium with submerged fermentations was reduced from 7 to 3 days, which resulted in enhanced productivity of cellobiase and a decrease in its production cost. This study found that the optimal conditions for the production of cellobiase were different from those of CMCase by C. lytica LBH-14.

Pilot-scale Optimization of Parameters Related to Dissolved Oxygen for Mass Production of Pullulan by Aureobasidium pullulans HP-2001

Wa Gao(고와),Yi-Joon Kim(김이준),Chung-Han Chung(정정한),Jianhong Li(이잔홍),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.10

Aureobasidium pullulans HP-2001 균주를 사용하여 풀루란을 대량 생산을 위하여 7 l 및 100 l 생물배양기를 사용하여 용존산소와 관련된 조건을 최적화하였다. 풀루란의 생산에 최적인 탄소원과 질소원은 각각 50.0 g/l 포도당 및 2.5 g/l 효모추출물이었으며 플라스크 규모에서의 풀루란 변환율은 37%이었다. 풀루란 생산 균주의 생장에 최적인 배지의 초기 pH 및 배양온도는 7.5 및 30℃이었으나 풀루란의 생산에 최적인 배지의 초기 pH 및 배양 온도는 각각 6.0 및 25℃이었다. 7 l 생물배양기에서 Aureobasidium pullulans HP-2001 균주의 생육에 최적인 교반속도 및 통기량은 각각 600 rpm 및 2.0 vvm이었으나 풀루란 생산에 최적인 조건은 각각 500 rpm 및 1.0 vvm이었으며 최적 조건에서 풀루란의 생산농도는 18.13 g/l이었다. 100 l 생물배양기에서 풀루란 생산 균주의 생장에 최적인 내압은 0.0 ㎏f/㎠이었으나, 풀루란 생산에 최적인 내압은 0.4 ㎏f/㎠이었으며 최적 조건에서 풀루란의 생산 농도는 22.89 g/l이었다. 이는 내압이 없는 상태에 비하여 풀루란의 생산 농도가 1.38배 증가한 것이다. Parameters related to dissolved oxygen for the production of pullulan by Aureobasidium pullulans HP-2001 were optimized in 7 l and 100 l bioreactors. The optimal concentrations of glucose and yeast extract for the production of pullulan were 50.0 and 2.5 g/l, respectively, and its conversion rate from glucose was 37% at a flask scale. The optimal initial pH of the medium and temperature for cell growth were 7.5 and 30℃, whereas those for the production of pullulan were 6.0 and 25℃. The optimal agitation speed and aeration rate for cell growth were 600 rpm and 2.0 vvm in a 7 l bioreactor, whereas those for the production of pullulan were 500 rpm and 1.0 vvm. The production of pullulan with an optimized agitation speed of 500 rpm and aeration rate of 1.0 vvm was 18.13 g/l in a 7 l bioreactor. Maximal cell growth occurred without inner pressure, whereas the optimal inner pressure for the production of pullulan was 0.4 ㎏f/㎠ in a 100 l bioreactor. The production of pullulan under optimized conditions in this study was 22.89 g/l in a 100 l bioreactor, which was 1.38 times higher than that without inner pressure.

Statistical Optimization for Production of Carboxymethylcellulase from Rice Hulls by a Newly Isolated Marine Microorganism Bacillus licheniformis LBH-52 Using Response Surface Method

Hye-Jin Kim(김혜진),Wa Gao(고와),Chung-Han Chung(정정한),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.8

왕겨를 기질로 사용하여 carboxymethylcellualse (CMCase)를 생산하는 미생물을 해수에서 분리하였으며 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 동정한 결과, Bacillus lichemiformis로 확인되었다. CMCase를 생산하기 위한 최적의 탄소원과 질소원은 왕겨와 암모니움 나이트레이트이었다. 통계학적인 방법인 response surface method (RSM)을 사용하여 CMCase를 생산하기 위한 조건을 최적화하였다. 통계학적인 분석 결과, 왕겨가 균체의 생육에 미치는 영향이 가장 높았으며, 왕겨와 배지의 초기 pH가 CMCase 생산에 미치는 영향이 높았다. Design Expert Software를 사용하여 결과를 분석한 결과, 균체의 생장에 최적인 조건은 48.7 g/ℓ 왕겨, 1.8 g/ℓ 암모니움 나이트레이트, 배지의 초기 pH 6.8 및 배양온도 35.7℃이었으나, CMCase의 생산에 최적인 조건은 43.2 g/ℓ 왕겨, 1.1 g/ℓ 암모니움 나이트레이트, 배지의 초기 pH 6.8 및 배양온도 35.7℃이었다. 최적화된 조건에서 왕겨를 기질로 사용하여 B. lincheniformis LBH-52가 생산하는 CMCase는 79.6 U/㎖이었다. 본 연구를 통하여 왕겨와 암모니움 나이트레이트를 CMCase를 생산하는 기질로 개발하였으며, 해수에서 분리한 미생물을 사용하여 생산기간을 3일로 단축하였다. A microorganism utilizing rice hulls as a substrate for the production of carboxymethylcellulase (CMCase) was isolated from seawater and identified as Bacillus lincheniformis by analyses of its 16S rDNA sequences. The optimal carbon and nitrogen sources for production of CMCase were found to be rice hulls and ammonium nitrate. The optimal conditions for cell growth and the production of CMCase by B. lincheniformis LBH-52 were investigated using the response surface method (RSM). The analysis of variance (ANOVA) of results from central composite design (CCD) indicated that a highly significant factor (“probe>F” less than 0.0001) for cell growth was rice hulls, whereas those for production of CMCase were rice hulls and initial pH of the medium. The optimal conditions of rice hulls, ammonium nitrate, initial pH, and temperature for cell growth extracted by Design Expert Software were 48.7 g/ℓ, 1.8 g/ℓ, 6.6, and 35.7℃, respectively, whereas those for the production of CMCase were 43.2 g/ℓ, 1.1 g/ℓ, 6.8, and 35.7℃. The maximal production of CMCase by B. lincheniformis LBH-52 from rice hulls under optimized conditions was 79.6 U/㎖ in a 7 ℓ bioreactor. In this study, rice hulls and ammonium nitrate were developed to be substrates for the production of CMCase by a newly isolated marine microorganism, and the time for production of CMCase was reduced to 3 days using a bacterial strain with submerged fermentation.

Enhanced Production of Carboxymethylcellulase by a Newly Isolated Marine Microorganism Bacillus atrophaeus LBH-18 Using Rice Bran, a Byproduct from the Rice Processing Industry

Yi-Joon Kim(김이준),Wa Cao(고와),이유정,Sang-Un Lee(이상운),정정한,Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.10

Carboxymethylcellulase를 생산하는 미생물을 해수에서 분리하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하고 계통 발생학 방법으로 비교한 결과, Bacillus atrophaeus로 확인되었다. 이 해양 미생물을 B. atrophaeus LBH-18로 명명하였으며 response surface method (RSM)를 사용하여 carboxymethylcellulase의 생산 조건을 최적화하였다. 이 균주의 생육에 최적인 미강, 펩톤 및 배지의 초기 pH는 68.1 g/l, 9.1 g/l 및 7.0이었으나, carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 조건은 각각 55.2 g/l, 6.6 g/l 및 7.1이었다. 이 균주의 생육과 carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 온도는 30℃이었다. 이 균주의 생육에 최적인 생물배양기의 교반속도 및 통기량은 324 rpm 및 0.9 vvm이었으나, carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 조건은 각각 343 rpm 및 0.6 vvm이었다. 파이롯트 규모의 생물배양기를 사용하여 실험한 결과, 이 균주의 생육과 carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 내압은 0.06 MPa이었다. 최적 조건의 내압으로 배양한 결과, 이 균주의 carboxymethylcellulase의 생산성은 127.5 U/ml이었으며, 이 결과는 내압을 가하지 않고 배양한 경우에 비하여 1.32배 향상된 것이다. 본 연구를 통하여 쌀 도정 공정의 부산 물인 미강을 기질로 개발하였으며 해양 미생물을 사용하여 carboxymethylcellulase의 생산기간을 7~10일에서 3일로 단축시켰다. A microorganism producing carboxymethylcellulase (CMCase) was isolated from seawater and identified as Bacillus atrophaeus. This species was designated as B. atrophaeus LBH-18 based on its evolutionary distance and the phylogenetic tree resulting from 16S rDNA sequencing and the neighbor-joining method. The optimal conditions for rice bran (68.1 g/l), peptone (9.1 g/l), and initial pH (7.0) of the medium for cell growth was determined by Design Expert Software based on the response surface method; conditions for production of CMCase were 55.2 g/l, 6.6 g/l, and 7.1, respectively. The optimal temperature for cell growth and the production of CMCase by B. atrophaeus LBH-18 was 30℃. The optimal conditions of agitation speed and aeration rate for cell growth in a 7-l bioreactor were 324 rpm and 0.9 vvm, respectively, whereas those for production of CMCase were 343 rpm and 0.6 vvm, respectively. The optimal inner pressure for cell growth and production of CMCase in a 100-l bioreactor was 0.06 MPa. Maximal production of CMCase under optimal conditions in a 100-l bioreactor was 127.5 U/ml, which was 1.32 times higher than that without an inner pressure. In this study, rice bran was developed as a carbon source for industrial scale production of CMCase by B. atrophaeus LBH-18. Reduced time for the production of CMCase from 7 to 10 days to 3 days by using a bacterial strain with submerged fermentation also resulted in increased productivity of CMCase and a decrease in its production cost.

Characterization of Acidic Carboxymethylcellulase Produced by a Marine Microorganism, Psychrobacter equimeris LBH-10

Hye-Jin Kim(김혜진),Wa Gao(고와),You-Jung Lee(이유정),Chung-Han Chung(정정한),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.4

Carboxymethylcellulose (CMC)를 분해하는 미생물을 해수에서 분리하였으며, 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 동정한 결과, Psychrobacter aquinaris로 학인 되어 P. aquinaris LBH-10로 명명하였다. 이 균주는 CMC, 셀로바이오스, 커드란, 여과지, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG), 풀루란 및 자일란을 분해하였으나, avicel 및 섬유소는 분해하지 못하였다. P. aquinaris LBH-10이 생산하는 carboxymethylcellulase (CMCase)의 최적 반응온도는 50℃이었으며, 20℃에서 50℃의 온도 범위에서 24시간이 경과한 후에도 90% 이상의 활성을 유지하였다. 또한, 이 균주가 생산하는 CMCase의 최적 반응 pH는 3.5이었으며 pH 2.5에서 pH 7.0 사이의 산성 조건하에서 24 시간이 경과한 후에도 70% 이상의 활성을 유지하였다. P. aquinaris LBH-10이 생산하는 CMCase의 최적 반응 pH는 지금까지 발견된 섬유소 분해효소 중에서 가장 낮은 pH로 판단된다. 제한된 농도의 CoCl₂, EDTA, 및 PbCl₂은 P. aquinaris LBH-10가 생산하는 CMCase의 활성을 증가시켰으나, HgCl₂, KCl, MnCl₂, NiCl₂ 및 SrCl₂는 이 균주가 생산하는 CMCase의 활성을 감소시켰다. A microorganism hydrolyzing carboxymethylcellulose (CMC) was isolated from seawater, identified as Psychrobacter aquimaris by analysis of 16S rDNA sequences, and named P. aquimari LBH-10. This strain produced an acidic carboxymethylcellulase (CMCase), which hydrolyzed carboxymethylcellulose (CMC), cellobiose, curdlan, filter paper, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG), pullulan, and xylan, but there was no detectable activity on avicel and cellulose. The optimal temperature for CMCase produced by P. aquimari LBH-10 was 50℃ and more than 90% of its original activity was maintained at broad temperatures ranging from 20 to 50℃ after 24 hr. The optimal pH of the CMCase was 3.5, and more than 70% of its original activity was maintained under acidic conditions between pH 2.5 and 7.0 at 50℃ after 24 hr. The optimal pH of CMCase produced by P. aquimaris LBH-10 seems to be lower than those produced by any other bacterial and fungal strain. CoCl₂, EDTA, and PbCl₂ at a concentration of 0.1 M enhanced CMCase-produced P. aquimaris LBH-10, whereas HgCl₂, KCl, MnCl₂, NiCl₂, and SrCl₂ inhibited it.

Comparison of Statistical Methods for Optimization of Salts in Medium for Production of Carboxymethylcellulase of Bacillus amyloliquefaciens DL-3 by a Recombinant E. coli JM109/DL-3

You-Jung Lee(이유정),Hye-Jin Kim(김혜진),Wa Gao(고와),Chung-Han Chung(정정한),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.9

재조합 균주인 E. coli JM109/DL-3를 사용하여 carboxymethylcellulase를 생산하기 위한 배지의 최적 염 농도를 orthogonal array method(OAM)과 response surface method (RSM) 등과 같은 통계학적인 방법으로 확립하고 그 결과를 비교하였다. OAM에 기초를 한 Qualitek-4 Software를 사용하여 실험을 계획하고, 그 결과를 분석한 결과는 K2HPO4가 균체의 생장 및 carboxymethylcellulase의 생산에 미치는 영향이 가장 크다는 사실을 확인 하였다. 균체의 생육에 최적인 K2HPO4, NaCl, MgSO4?7H2O 및 (NH4)2SO4의 농도는 10.0, 1.0, 0.2 및 0.6 g/l이었으나, carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 각 염들의 농도는 각각 5.0, 1.0, 0.4 및 0.6 g/l이었다. RSM에 기초를 한 Design-Expert Software를 사용하여 실험을 계획하고, 그 결과를 분석한 결과는 K2HPO4가 균체의 생장 및 carboxymethylcellulase의 생산에 가장 중요한 인자라는 사실을 확인하였다. 균체의 생장에 최적인 K2HPO4, NaCl, MgSO4?7H2O 및(NH4)2SO4의 농도는 7.44, 1.08, 0.22 및 0.88 g/l이었으나, carboxymethylcellulase의 생산에 최적인 각 염들의 농도는 각각 5.84, 0.69, 0.28 및 0.54 g/l이었다. 기본적으로 OAM에 기초한 software를 사용하여 얻은 결과는 RSM에 기초한 software를 사용하여 얻은 결과와 유사하였다. 최적 조건에서 재조합 균주 E. coli JM109/DL-3이 생산하는 carboxymethylcellulase의 생산은 B. amyloliquifacience DL-에 비하여 1.92배 증가하였다. The optimal concentrations of salts in medium for cell growth and the production of carboxymethylcellulase (CMCase) by a recombinant E. coli JM109/DL-3 were established using two statistical methods: orthogonal array method (OAM) and response surface method (RSM). The analysis of variance (ANOVA) of data based on OAM indicated that K2HPO4 gave maximum sum of square (S) and percentage contribution (P) for cell growth as well as production of CMCase. The optimal concentrations of K2HPO4, NaCl, MgSO4?7H2O, and (NH4)2SO4 in medium for cell growth extracted by Qualitek-4 (W32b) Software were 10.0, 1.0, 0.2, and 0.6 g/l, respectively, whereas those for the production of CMCase by E. coli JM109/DL-3 were 5.0, 1.0, 0.4, and 0.6 g/l. The analysis of variance (ANOVA) resulting from RSM indicated that a highly significant salt for cell growth was K2HPO4 ("probe>F" less than 0.0001), whereas K2HPO4 and MgSO4?7H2O were significant for the production of CMCase. The optimal concentrations of K2HPO4, NaCl, MgSO4?7H2O, and (NH4)2SO4 for cell growth extracted by Design Expert Software were 7.44, 1.08, 0.22, and 0.88 g/l, respectively, whereas those for production of CMCase were 5.84, 0.69, 0.28, and 0.54 g/l. The optimal concentrations of salts and their influences on cell growth and production of CMCase extracted by OAM were almost the same as those by RSM. Production of CMCase by a recombinant E. coli JM109/DL-3 under optimized concentration of salts was 1.93 times higher than that by Bacillus amyloliquifaciens DL-3.

Enhanced Production of Gellan by Sphingomonas paucibilis NK-2000 with Shifts in Agitation Speed and Aeration Rate after Glucose Feeding into the Medium

Nam-Kyu Lee(이남규),Hyung-Phil Seo(서형필),Young-Bai Cho(조영배),Chang-Woo Son(손창우),Wa Gao(고와),Jin-Woo Lee(이진우) 한국생명과학회 2010 생명과학회지 Vol.20 No.6

Sphingomnas paucibilis NK2000 균주를 사용한 젤란의 최적 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 1.0 vvm이었다. 이 균주를 사용하여 젤란의 생산성을 향상시키기 위한 포도당의 최적 첨가시기는 배양을 시작한 36시간이었다. 젤란의 생산성을 향상시키기 위한 5가지 방법, 1) 포도당을 첨가하지 않는 방법, 2) 배양 36시간 후에 포도당을 첨가하지만 교반속도 및 통기량을 변화시키지 않는 방법, 3) 배양 36 시간 후에 포도당을 첨가하고 교반속도를 400 rpm에서 600 rpm으로 변화시키는 방법, 4) 배양 36 시간 후에 포도당을 첨가하고 교반속도를 400 rpm에서 600 rpm으로 증가시키고 통기량을 1.0 vvm에서 1.5 vvm으로 증가시키는 방법 및 5) 배양 36 시간 후에 포도당을 첨가하고 교반속도를 400 rpm에서 600 rpm으로 증가시키고 통기량을 1.0 vvm에서 2.0 vvm으로 증가시키는 방법 등을 실험한 결과, 젤란의 생산성은 각각 5.19, 5.74, 6.73, 7.93, 및 9.40 g/l이었으며, 변환률은 각각 26.0, 19.1, 22.4, 26.4, and 31.3%이었다. 최적의 방법으로 생산한 젤란의 생산농도 및 포도당 전환율은 포도당을 첨가하지 않은 방법으로 생산한 젤란의 생산농도 및 포도당 전환율에 비하여 각각 1.81 및 1.20 배 증가하였다. Optimal agitation speed and aeration rate for the production of gellan by Sphingomnas paucibilis NK2000 in a 7 l bioreactor were found to be 400 rpm and 1.0 vvm. The best time for glucose feeding into the medium for enhanced production of gellan by S. paucibilis NK2000 was 36 hr after cultivation. The concentrations of gellan produced by S. paucibilis NK2000 from 1) 20.0 g/l glucose without additional feeding, 2) 20.0 g/l glucose with feeding of 200.0 g/l glucose at 36 hr, in which the final concentration in the medium was 10.0 g/l, 3) 20 g/l glucose with feeding of 200.0 g/l glucose and a shift in an agitation speed from 400 to 600 rpm, 4) 20.0 g/l glucose with feeding of 200.0 g/l glucose at 36 hr and shifts in an agitation speed from 400 to 600 rpm and an aeration rate from 1.0 to 1.5 vvm, 5) and 20.0 g/l glucose with feeding of 200.0 g/l glucose at 36 hr and shifts in an agitation speed from 400 to 600 rpm and an aeration rate from 1.0 to 2.0 vvm, were 5.19, 5.74, 6.73, 7.93, and 9.40 g/l, respectively, and their conversion rates from glucose were 26.0, 19.1, 22.4, 26.4, and 31.3%, respectively. Compared to those developed using a normal process, production of gellan by S. paucibilis NK2000 from 20.0 g/l glucose was 1.81 times higher, and and its conversion rate was 1.20 times higher when the optimized process developed in this study was used.