성별에 따른 간기능 분석과 교차분화 간세포의 특성 규명

신유리안나,Imran Ullah,김영지,오건봉,황성수,김영임,이승훈,허태영,임기순,옥선아 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 Reproductive & Developmental Biology(Supplement) Vol.41 No.2

사람의 경우, 간은 성별에 의존적으로 다른 크기와 분비되는 생리 대사물질의 양이 다 른 것으로 알려져 있지만, 대부분의 연구는 성별의 영향이 고려되지 않고 있다. 따라서 이 연구에서는 성별에 따른 간의 기능을 규명하기 위해 같은 주령의 암수 마우스(11주령, C57BL/6J, 5쌍)의 간을 사용하여 생리대사 기능을 평가하고, 암수의 체세포유래 교차분 화 유도간세포(induced Hepatocyte)를 만들어 성별에 따른 생리 대사기능이 유지되는지를 확인하였다. 특히 마우스의 약물독성 대사에 주요한 공통발현유전자(Cyp3a11와 Cyp3a25) 와 성 특이적 CYP enzyme 유전자들(Cyp2d9, Cyp8b1, Cyp2a4, Cyp3a41)의 mRNA 발 현을 확인하였다. 비록 개체 간의 차이는 존재하였지만, 공통적으로 발현되는 Cyp3a11는 웅성에서 증가를 보였고, Cyp2d9, Cyp8b1는 웅성에서 Cyp2a4, Cyp3a41는 자성에서 증 가가 확인되었다. 추가적으로 같은 연령의 암놈의 태아들에서 10개의 mouse embryonic fibroblast을 분리배양하고 성별을 확인하였다. 이중 암수 각1개의 fibroblast를 선택하고 lentivirus를 이용하여 3개의 간 전사인자 (hHNF1A, hHNF4A, hFOXA3)가 각각 삽입된 벡 터를 감염시키고, 6주 동안 간 분화 배양액에서 분화를 유도하였다. Cyp 유전자 중 공통 발현 유전자인 Cyp3a11의 경우, 간의 결과와 동일하게 웅성에서 자성보다 증가됨이 확 인되었다. 이상의 결과들에서 볼 때, 성별 따른 간 특성은 교차분화된 암수 유도간세포에도 일부 유지됨을 확인할 수 있었다. 따라서 세포치료제나 신약개발을 위한 독성 평가용 세포주 도 성별 맞춤형 구축이 필요함을 시사한다.

마우스 모델에서 성별이 Induced Hepatocyte Like Cells(iHep)의 특성에 미치는 영향

신유리안나,Imran Ullah,김영임,오건봉,옥선아 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2017 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2017 No.10

간 약물 대사에 관여하는 CYP enzymes은 성별 의존적 분비량을 가지고 특히 성호르 몬의 영향을 많이 받는 것으로 알려져 있다. 최근 간 부전이나 노화 등의 원인으로 간 수요가 급증하고 있으나 공급 가능한 간의 수요는 제한적임으로 대안적인 연구로서 체세 포를 간세포로 전환시키는 direct conversion 연구가 시도되고 있고, 이 연구는 마우스 모 델에서 induced Hepatocyte like cells(miHep)의 구축 시 성별의 영향을 평가하였다. 세포 원으로는 동일 부모의 male과 female의 MEF(C57BL/6J)를 사용하고 간 전사인자(hHnf1α, hHnf4α, hFoxa3)들을 Lentiviral vectors로 감염시켜 miHep을 유도하고 특성을 비교하였 다. 성별에 상관없이 miHep은 한달 째 형성이 확인 되었다. Exogenic/endogenic genes의 발현은 모두 3달째 확인 되었고, 특히 male에서 hHnf1α, hHnf4α가 강한 발현을 보였다. 간세포 주요 발현 mRNA와 단백질의 발현을 miHep에서 분석하였다. mRNA발현에서는 Alb은 성별간 차이가 없지만 male에서는 Aat, Cyp3a13이 우세하였고, 반면 female에서는 Afp, Ecad, Cyp1a1, Cyp2a5, Cyp2d22, Cyp3a11가 우세하였다. 면역 형광 염색에 의한 단백질 발현은 성별에 상관없이 Alb, Trf, Aat, Ecad, Cyp3a11이 관찰되었고 Vim의 감소 가 확인되었다. 간의 기능 분석 결과로 지방은 male에서 Lpl, Pparγ가 강하였고, 글리코 겐은 female에서 Glut2의 발현이 강하게 나타났다. LDL의 축적은 male에서 면역 형광 염 색을 통해 강하게 나타났고, 약물의 흡수와 배출 기능을 확인한 ICG test는 male에서 흡 수 능력이 우수함이 밝혀졌다. 3일간의 CYP enzyme induction test에서는 3-Methylcholanthrene의 경우 male에서 Cyp1a1, Cyp3a11, Cyp3a13의 강한 증가가 확인 되었고, Rifampicin(Cyp2a5)과 Dexamethasone(Cyp2d22)의 경우도 역시 male에서 강한 증가를 보였다. 이상의 결과들을 종합하여 볼 때 Lentiviral vectors는 지속적으로 작용함이 규명 되었 고, 간 기능과 약물대사능에서 male이 female보다 우세한 hepatocyte like cells의 특성을 보였다. 이것은 성별보다는 exogenic genes의 발현 정도가 구축된 miHep의 특성에도 강 력한 영향을 미쳤다는 것을 시사한다.

Rat Primary Hepatocyte의 2차원 배양과 3차원 배양에 따른 생리 활성능과 대사능에 관한 연구

임맑음,김영지,신유리안나,오건봉,황성수,김영임,허태영,옥선아 한국수정란이식학회 2016 한국동물생명공학회지 Vol.31 No.3

There is a growing interest in the application of primary hepatocytes for treatment of liver diseases in humans and for drug development. Several studies have focused on long-term survival and di-differentiation blocking of primary hepatocytes in an in vitro culture system. Therefore, the present study also aimed to optimize an in vitro culture system using primary rat hepatocytes. Primary rat hepatocytes from 6-week-old male Crl:CD rats were isolated using a modified two-step collagenase perfusion. Healthy 3.5 × 106 primary rat hepatocytes were seeded into a 2 dimensional (2D) culture in a 25T culture flask coated with collagen type I or into a 3D culture in a 125-ml spinner flask for 7 days. Production of plasma protein (ALB and TF), apoptosis (BAX and BCL2), and CYP (CYP3A1) related genes were compared between the 2D and 3D culture systems. The 3D culture system had an advantage over the 2D system because of the relatively high expression of ALB and low expression of BAX in the 3D system. However, the level of CYP3A1 did not improve in the 3D culture with and without the presence of a dexamethasone inducer. Therefore, 3D culture has an advantage for albumin production and primary rat hepatocyte survivability, but a low expression of CYP3A1 indicated that primary rat hepatocytes require a high–density culture for stress reduction by continuous flow.

세포외 기질(External Cellular Metrics, ECM)에 따른 Endothelial Cell(EC)의 체외배양능 분석

임맑음,김영지,황성수,오건봉,신유리안나,김영임,이주영,옥선아 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2016 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2016 No.10

소분자 화합물(A83-01)의 처리에 따른 돼지 유도간세포(Porcine Induced Hepatocyte-like cells, piHep)의 교차분화효율 개선

김영지,오건봉,황성수,신유리안나,김영임,이주영,옥선아 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2016 발생공학 국제심포지엄 및 학술대회 Vol.2016 No.10

세포외 기질(External Cellular Metrics, ECM)에 따른 Endothelial Cell(EC)의 체외배양능 분석

임맑음,김영지,황성수,오건봉,신유리안나,김영임,이주영,옥선아 한국수정란이식학회 2016 한국수정란이식학회 학술대회 Vol.2016 No.10

최근 조직공학 기술의 발달로 재해와 질병으로 인한 손상된 조직과 장기의 대체연구들 이 진행되고 있다. 장기 대체 연구의 핵심 요소 중 하나는 재건된 조직이나 장기가 혈관 망을 형성하여 host tissue로부터 양분과 산소의 전달이다. 본 연구는 조직공학 기법을 이용하여 장기 재건에 필수적인 혈관 재건을 위해 혈관을 구성하는 주세포인 endothelial cell을 체외에서 배양하는 것이다. Endothelial cell(EC)배양을 위해서는 세포지지체인 세 포외 기질(External cellular metrics, ECM)을 필요로 하기 때문에 ECM중에 대표적인 collagen과 gelatin을 사용하여 지지체에 따른 체외배양능을 비교하였다. 실험 동물로는 돼지 대동맥을 채취하여, 대동맥 속에 collagenase type I을 주입하고, 혈관의 입·출구를 봉합한 상태로 10분 간 37℃에서 처리하였다. 관류된 용액은 10% FBS가 함유된 기본배 양액(EGM-2 media)을 사용하여 2번 수세한 후 회수된 세포를 각각의 ECM이 처리된 dish위에서 배양 하였다. EC세포인지를 확인하기 위해서 EC표지 인자인 CD31과 vWF 항체의 발현을 flow cytometry로 확인 하였고, 회수된 세포에서 두 단백질이 모두 발현 되었다. ECM에 따른 EC의 세포 형태를 비교하였을 때 형태학적 차이는 없었다. Basement Membrane Extract위에서 calcein-AM으로 염색된 EC는 ECM의 종류와 상관 없이 2-6시간 사이에 Tube Formation을 보였다. 또한 endothelial cell의 표지 마크인 CD31, Flk1, vWF의 mRNA 발현양과 IHC에 의한 단백질 발현을 조사한 결과 collagen 지지체 위에서 배양된 endothelial cells에서 발현양이 더 높았다. 결론적으로 두 가지 ECM에서 모두 성공적으로 endothelial cell의 배양이 가능하지만 collagen위에서 배양된 endothelial cell이 더 우수한 maintenance능력을 가짐을 확인 할 수 있었다.

소분자 화합물(A83-01)의 처리에 따른 돼지 유도간세포(Porcine Induced Hepatocyte-like cells, piHep)의 교차분화효율 개선

김영지,오건봉,황성수,신유리안나,김영임,이주영,옥선아 한국수정란이식학회 2016 한국수정란이식학회 학술대회 Vol.2016 No.10

노화와 재해 등으로 인한 인간의 치명적인 간 부전 문제를 해결하기 위한 대안 중의 한 축으로 교차분화 기법을 적용한 induced hepatocyte (iHep)연구가 진행되고 있지만, 분화효율은 극히 낮다. 본 연구에서는 돼지 섬유아세포에 교차분화기법을 사용하여 piHep을 만들고, 소분자 화합물(A83-01)의 첨가에 따른 교차분화의 효율개선을 시도 하 였다. piHep의 유도를 위해서 세가지 간 전사 인자를 [human hepatocyte nuclear factor 1 alpha (hHNF1A), human hepatocyte nuclear factor 4 alpha (hHNF4A), human forkhead box protein A3 (hFOXA3)]를 렌티바이러스를 이용하여 체세포에 도입하였다. 3가지 유전자가 도입된 세포는 기본 배양액으로 hepatocyte induction medium (HIM)을 사용하였고, 여기에 A83-01을 첨가군과 미 첨가군(대조군)으로 나누어 교차분화를 유도 하였다. 그 결과 대조군에서 4주 후에 불완전한 간세포의 형태가 낮은 빈도로 나타났지 만, A83-01 처리군은 도입 2주 후부터 epithelial-like cell의 형성을 통해 점점 다핵을 가 지는 성숙한 piHep(명확한 핵, 다각형의 세포질)의 특성이 확인되었다. 간세포로의 기능 적 분화를 검증하기 위해 albumin (ALB)과 transferrin (TF)의 mRNA의 발현을 real-time PCR을 통해 분석하였다. A83-01 처리군에서 ALB와 TF의 발현이 교차분화 4 주차까지 증가되었다. 섬유아세포 표지 인자인 vimentin의 발현은 A83-01의 처리와 상관 없이 모두 감소되었다. 대조군과 달리 A83-01처리군은 piHep의 유도를 위해 사용된 3가 지 간 전사인자들 중 HNF4Α와 FOXA3에서 교차분화 후 4주차까지 endogenic expression 을 보였다. 결론적으로 간세포 교차 분화의 효율 개선을 위해 사용된 A83-01은 돼지 섬 유아세포의 내재된 간 특이적 전사 인자들을 활성화시켜 간세포의 분화를 촉진함을 확인 할 수 있었다.

이종 장기이식 및 조직 공학을 위한 Alpha gal 유전자 결손돼지 (1, 3-galactosyltransferase-deficient pigs)에서 혈관내피세포(aortic endothelial cells)의 구축

옥선아,임맑음,김영지,ImranUllah,신유리안나,김영임,오건봉,황성수,허태영,이승훈,임기순 한국수정란이식학회 2017 한국동물생명공학회지 Vol.32 No.3

Tissue engineering (TE) has been developed to create functional organs and tissue by combining 3D matrix and cells in vitro. Vascularization and angiogenesis are utmost important for supply of nutrients and oxygen in tissue engineered organs. The present study was performed to isolate and characterize primary endothelial cells (EC) from aorta of alpha 1, 3-enzyme galactosyltransferase knock out (GalT KO) pig, to minimize immune rejection and analyze body immune system for future xenotransplantation studies. Isolation of primary EC from aorta were performed by incubation with dispase for 8-10 min at 37°C. Primary EC were cultured in EC growth medium on different extra cellular matrix (ECM), either collagen or gelation. Primary EC exhibits morphological characteristics and showed positive expressions of EC specific marker proteins i.e. PECAM1, KDR and VWF despite of their ECM surface; however, on collagen based surface they showed increase in mRNA level analyzed by qPCR. Primary EC cultured on collagen were sorted by flow cytometer using KDR marker and cultured as KDR positive cells and KDR negative cells, respectively. KDR positive cells showed dramatically increased in PECAM1 and VWF level as compared to KDR negative cells. Based on the above results, primary EC derived from GalT KO are successfully isolated and survived continuously in culture without becoming overgrown by fibroblast. Therefore, they can be utilize for xeno organ transfer, tissue engineering, and immune rejection study in future.