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- 저자 : Nguyen Dinh Phuong (검색결과 1 건)
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Nguyen Dinh Phuong The Graduate School Sunchon Nation Universty 2006 국내박사
B. subtilis는 생산된 단백질의 세포 외분비 능력 때문에 산업적으로 많이 이용되고 있다. 최근에 이들의 특성을 향상시키기 위해서 분자생물학적 방법이 도입되어 많은 연구가 진행되어져 있으며 특히, B. subtilis 내의 단백질분해효소를 제거 하는 연구도 많이 진행되고 있다. 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis를 이용하여 Clostridium thermocellum 유래의 섬유소분해효소나 xylan분해효소의 발현에 대한 연구도 많이 되어져 있다. 본 논문은 Clostridium thermocellum 유래의 내열성 XynX를 E. coli 숙주세포와 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis 숙주세포에 형질전환 시킨 후 생산되는 단백질의 특성에 대하여 비교 하였다. XynX는 Clostridium thermocellum ATCC 27405로부터 높은 열안정성을 가진 xylan분해효소로 이미 클로닝 되어졌고, 염기서열 분석 결과 multidomain의 구조를 가지고 있다. 본 논문은 E. coli 숙주세포와 protease를 불활성화 시킨 Bacillus subtilis 숙주세포에 형질전환 후 발현되는 XynX에 관하여 연구하였다. XynX 유전자 중에서 CD domain을 갖는 플라즈미드 pKM10을 E. coli에서 발현시켜4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside를 기질로 사용하여 활성 염색한 결과, 약 40 kDa에서 활성 밴드를 볼 수 있었다. 이 xylan분해효소의 정제는 CHT-Ⅱ 컬럼으로 수행하였다. XynX 전체 유전자를 갖는 E. coli (pCX33)에서 발현된 XynX는 활성염색 결과 4개의 활성 밴드(120, 110, 85, 60 kDa)를 볼 수 있었으며, 비활성 밴드의 제거는 High-Q와 CHT-Ⅱ 컬럼을 사용하였다. 단백질분해효소를 불활성화 시킨 B. subtilis에서 발현된 XynX는 배양액의 활성염색 결과 잘려진 활성 밴드를 보였으며, 이는 숙주세포로 사용된 B. subtilis의 단백질분해효소에 의해 잘려진 것으로 판단된다. B. subtilis WB600 (pJX33)과 WB700 (pJX33) 의 활성밴드는 40 kDa, 50 kDa 으로 같았다. 그러나 WB600보다 wprA 유전자(단백질분해효소생산)가 하나 더 제거된 WB700이 더 많은 xylan분해효소를 생산하는 것으로 나타났다. WB700보다 vpr 유전자(단백질분해효소)가 하나 더 제거된 WB800은 120, 85 kDa 의 크기가 증가된 활성밴드를 보였고 활성은 비슷하였다. 이로부터 완전한 전체효소를 얻을 수 있었다. 이런 숙주 시스템과 발현 시스템을 활용하면 외래단백질 생산의 효율을 증가시킬 수 있을 것이다. XynX, a highly thermostable xylanase from Clostridium thermocellum ATCC 27405, was previously cloned, sequenced and characterized to have a multi-domain structure [22]. In this study, the expression of XynX was investigated in Escherichia coli and protease-deficient Bacillus subtilis. When expressed in E. coli, the CD domain of XynX, previously cloned in plasmid pKM10, showed single active band of 40 kDa on SDS-PAGE gel containing 4-methylumbelliferyl- -D-cellobioside as the substrate. The xylanase active peptide was purified by hydroxyapatite chromatography. When the entire ORF of the XynX was expressed in E. coli (pCX33), four distinctive active bands corresponding to 120, 110, 85, and 60 kDa were observed due to the cleavage of the full length XynX. These cleaved bands were separated by ion exchange and hydroxyapatite chromatography. Due to its ability to secrete a large amount of protein directly into the culture medium, B. subtilis has become an organism of industrial interest. Recently, extensive research on this bacterium helped to improve genetics and molecular cloning techniques in the field of expression of heterologous gene products. The deletion of protease genes has been investigated to decrease the cleavage of foreign proteins in B. subtilis. Protease-deficient B. subtilis has been used for the expression of cellulase and xylanase genes from the thermophilic anaerobic bacterium C. thermocellum. In this study, XynX, a highly thermostable xylanase from C. thermocellum was expressed in protease-deficient B. subtilis and the cleavage pattern in the B. subtilis was compared to that in E. coli. When XynX was expressed in protease-deficient B. subtilis, truncated active bands were found from the extracellular medium. The cleavage phenomenon was minimized by the deletion of some proteases in the B. subtilis host cell. Two distinct bands, 40 and 50 kDa, were detected when XynX was expressed both in B. subtilis WB600 (pJX33) and WB 700 (pJX33). However, deletion of the wprA protease in B. subtilis WB700 resulted in higher yield of xylanase in the culture supernatant than in WB 600. One more deletion of the vpr protease in WB800 produced two bands with higher molecular weight, 120 and 85 kDa. This demonstrated that the cleavage phenomenon of XynX when expressed in B. subtilis was caused by the presence of the protease genes of the host cell. Overall, this engineered expression systems are potentially applicable for production foreign proteins.
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