Lamin subfamily differentially regulates the gene expression through the organization of 3D genome structure and splicing machinery

국문 초록 (Abstract)

핵 단백질인 Lamin은 척추동물에서 두가지 유형으로 나눌 수 있는데, Lamin A와 Lamin C를 포함하는 A-타입 라민과 Lamin B1과 Lamin B2를 포함하는 B-타입 라민이 있다. Lamin은 미세 섬유 그물 구조로 이루어진 lamina 층을 이루는 구조 단백질이고, lamina 연관 도메인 (LADs)이 위치하고 있는 부분이다. 핵질 (nucleoplasm)에 분포하는 lamin은 염색사 (chromatin)의 조직화와 유전자 발현 조절에서 역할을 하지만, 구체적인 분자생물학적 기작은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 각각 Lamin A/C, Lamin B1 및 Lamin B2 단백질을 생성하지 않는 LMNA, LMNB1 및 LMNB2 녹아웃 (KO) H1299 세포주를 제작하였다. 하나의 lamin 단백질을 제거하면 세포 주기가 정지하고, 세포 사멸의 유도, 세포 생존력 및 증식의 감소를 포함한 세포 생리학적 변화가 관찰되었다. Lamin subfamily는 상호 보상 작용을 보여 하나의 lamin 단백질이 제거된 상황에서도 세포가 생존할 수 있었다. RNA-sequencing 방법을 이용한 전사체 분석을 통해 LMNA, LMNB1 및 LMNB2 KO 세포에서 각각 1,512개, 2,004개 및 2,676개의 차별 발현 전사체 (DETs)를 확인하였다. DET 중 RNA 스플라이싱 및 RNA 가공 관련 유전자 세트의 발현은 광범위하게 감소되어 있었다. 이러한 유전자 발현 조절 이상에 의해 불완전한 mRNA 가공이 일어났고, 이는 곧 선택적 스플라이싱의 비정상적 증가로 발생했다. 특히 lamin이 각각 제거된 모든 세포주에서 통계적으로 유의미하게 retained-intron (RIs)이 생성됨을 발견했고, 이러한 비정상적인 전사체를 생성하는 유전자들은 핵 내에서 nuclear speckle 근처에 밀집하고 있음을 확인했다. 또한, 3가지 lamin KO 세포에서 speckle의 과립화 이상 (dysgranulation)이 관찰되었고, lamin subfamily가 speckle의 형성에 직접적인 영향을 줄 수 있다는 것을 확인했다. 종합적으로, lamin subfamily는 전사체 및 후성전사체 수준에서 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행할 뿐 아니라, 스플라이싱 복합체를 speckle과 같은 공간에 위치시키는 구조적 기능도 함께 가지고 있음을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The nuclear lamins are subdivided into two types in vertebrate, A-type (Lamin A and Lamin C) and B-type lamins (Lamin B1 and Lamin B2). Lamins are major structural components of the nuclear lamina, a filamentous meshwork, which is known as the anchoring point for Lamina associated domains (LADs). Although nucleoplasmic lamins have a role in chromatin organization and gene regulation, their specific molecular mechanisms have not been fully elucidated. In this study, we generated LMNA, LMNB1, and LMNB2 knock-out (KO) H1299 cell lines, which lack Lamin A/C, Lamin B1, and Lamin B2 respectively, by using the CRISPR-Cas9 system. The single ablation of lamin protein induces several physiological changes, including cell cycle arrest, apoptosis induction, and reduction of cell viability and proliferation. Nevertheless, cells could survive without one type of lamin, because of their mutual compensation. In transcriptome analysis using RNA-seq, we identified 1,512, and 2,004, and 2,676 differentially expressed transcripts (DETs) in LMNA, LMNB1, and LMNB2 KO cells, respectively. Among DETs, RNA-splicing and mRNA processing-related gene sets were extensively down-regulated. These deregulations resulted in imperfect processing of pre-mRNA, followed by significant increase of abnormal alternative splicing events. Especially hundreds of retained introns (RIs) were detected in all lamin null cells, and the genomic locus with abnormal splicing transcripts are remarkably enriched near the nuclear speckles. Furthermore, we revealed that the lamin subfamilies directly affect the formation of nuclear speckles, by observing dysgranulation in all lamin KO cells. Altogether, these data show that lamin subfamilies have regulatory roles in transcriptional and epi-transcriptional levels, as well as structural roles in organizing nuclear domains to appropriate nuclear locations.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1 Overview of Lamins 1
• 1.2 Lamin associated disease: Laminopathy 5
• 1.3 Lamin and chromatin organization 9
• 1.4 Lamins in transcription and DNA replication 12
• 1.5 Alternative splicing 14
• 1.6 Next Generation Sequencing 20
• 1.7 View of study 22
• 2. Materials and Methods 24
• 2.1 Oncomine database analysis 24
• 2.2 Kaplan-Meier analysis 24
• 2.3 Human tissue microarray and Immunohistochemistry (IHC) 24
• 2.4 Cell cultures 25
• 2.5 Western Blot 26
• 2.6 Immunostaining for FACS analysis 26
• 2.7 Immunocytochemistry 27
• 2.8 Generation of lamin knockout (KO) stable cell lines 28
• 2.9 Total RNA isolation and RT-qPCR 28
• 2.10 MTT assay and Cell migration assay 29
• 2.11 Live/dead cell assay 30
• 2.12 Annexin VFITC/propidium iodide (PI) apoptosis assay 30
• 2.13 Cell cycle analysis 31
• 2.14 RNA sequencing and bioinformatical analysis 31
• 2.15 Statistical analysis 32
• 2.16 Gene ontology and Gene Set Enrichment Analysis 32
• 2.17 Image analysis 33
• 3. Results 36
• 3.1 Up-regulation of lamin subfamilies in various lung cancers 36
• 3.2 Up-regulation of lamin families in lung cancer cells 41
• 3.3 Generation and validation of LMNA, LMNB1, and LMNB2 knockout cell lines 43
• 3.4 Mutual compensations between A- and B-type lamins in lamin deficient cells 45
• 3.5 Lamin deficit affects cell viability in lamin KO cells 48
• 3.6 Absence of lamin inhibits cell proliferation and migration ability 50
• 3.7 Lamin loss causes cell cycle arrest at G2/M contributing to growth inhibition in H1299 cells 52
• 3.8 Induction of apoptosis in lamin KO cells 54
• 3.9 Dynamic transcriptome profiling of lamin KO cells using RNA-seq 56
• 3.10 Extensive downregulation of lamin A tail domain binding partners 70
• 3.11 Remarkable increase of alternative splicing events in lamin KO H1299 cells 78
• 3.12 Exceptionally deterministic clustering of alternative splicing events at nuclear speckles 83
• 3.13 Lamin loss affects the granulation of nuclear speckles 86
• 4. Discussion 89
• 5. References 98
• 국문초록 109