Haploinsufficiency of Kdm3b induced apoptosis of photoreceptors in old mouse retina

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Histone modification is one of the critical pathway in gene expression regulation. The examples of histone modifications are methylation, phosphorylation, ubiquitination and acetylation. Among the histone modifications, histone demethylation plays a role as “eraser” which is associated with diseases by reducing expression of homeostasis-associated genes. Histone lysine demethylase KDM3B (JMJD1B) is histone demethylase for mono- or dimethylated H3K9. Although KDM3B has been studied molecular and biochemical functions in disease, such as cancers and genetic diseases, it has not been fully studied in retina and retinal diseases. Here, I investigated functions of KDM3B in Kdm3b mutant (Kdm3b+/-) mouse retina. The mRNA of Kdm3b gene was expressed in various tissues and it was highly expressed in the retina. To confirm phenotypical changes in Kdm3b+/- mouse retina, number of photoreceptors was counted and its cellular compartment was investigated by using immunohistochemical analysis. The number of photoreceptors in Kdm3b+/- retina were reduced by apoptotic cell death that was induced by decreasing expression of KDM3B. Furthermore, the number of cone photoreceptors and area of cone synapses was decreased in Kdm3b+/- retina. C-terminal binding protein 2 (CtBP2), representing ribbon synapses in the photoreceptors, and area of CtBP2 were reduced in Kdm3b+/- retina. These results revealed that phenotypical alteration and cell death cone photoreceptors were due to the apoptosis. In addition, transcriptome analysis of Kdm3b+/- retina was performed compare to Kdm3b+/+ retina to reveal the changes of mRNA expression at the genome-wide level. RNA-seq data unraveled 585 differentially expressed genes (DEGs). Among DEGs, 326 genes were down-regulated, and 259 genes were up-regulated in Kdm3b+/- retina. From the down-regulated 326 genes, synaptogenesis and sustain of synapse homeostasis related genes were highly enriched by the gene ontology (GO) analysis in Kdm3b+/- compare to Kdm3b+/+ retina. The gene expression of synapse-associated genes, such as Kif3a, Rims1, Erc2, Ctbp1 and Ctbp2, was significantly reduced in Kdm3b+/- mouse retina. Taken together, these results suggest that haploinsufficiency of KDM3B expression causes cell death and imbalance of homeostasis in the cone photoreceptors through the down-regulation of synapse related gene expressions.

국문 초록 (Abstract)

히스톤 변형은 중요한 유전자 발현 기작 중 한 가지이다. 이러한 히스톤 변형의 예로는 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 아세틸화 등이 있다. 히스톤 변형 중, 히스톤 탈 메틸화는 히스톤 N-말단 수식 정보를 제거하여 항상성 관련 유전자 발현을 조절하여 전립선암이나 헌팅턴병 과 같은 다양한 질병의 발생과 관련되어 있다. 히스톤 라이신 탈 메틸화 효소 KDM3B (JMJD1B)는 H3K9의 모노-, 디- 메틸기를 제거하는 효소이다. KDM3B의 기능은 발암과정이나 헌팅턴과 같은 유전질환에서 기능이 보고 되었지만, 망막 발생과 망막에서 발생하는 질병에서는 아직 연구가 되어있지 않다. 본 연구자는 KDM3B의 망막 발생 및 생리적 기능을 Kdm3b 변이 생쥐를 이용하여 확인하고자 하였다. Kdm3b 유전자의 mRNA는 여러 조직에서 발현하고, 또한 망막에서도 과량 발현하고 있다. Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 표현형 변화를 확인하기 위해, 본 연구자는 Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 Immunohistochemistry (IHC) 실험을 통해 확인하였다. 그 결과, Kdm3b+/- 생쥐 망막의 광수용기 세포의 개수가 KDM3B 발현 감소에 의한 세포사멸에 의해 감소하였다. 또한 원추세포의 개수와 시냅스의 면적이 Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 정상 생쥐의 망막에 비해 감소되어 있었다. 원추세포의 광신호 전달자인, CtBP2와 CtBP2의 면적 또한 Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 감소되었다. 이러한 결과들을 통해 세포사멸에 의한 표현형 변화와 세포의 죽음을 확인하였다. 더 나아가, 본 연구자는 유전체의 변화를 확인하기 위해 Kdm3b+/+ 생쥐와 비교해서 Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 전사체 분석을 시행하였다. RNA-시퀀싱 결과, 585 개의 다르게 발현하는 유전자들이 발견되었다. 그 유전자들 중에서 Kdm3b+/+ 생쥐와 비교하여 Kdm3b+/- 생쥐 망막에서 감소한 시냅스 연관 단백질들을 찾을 수 있었다. 이를 통해, KDM3B 반수부족 현상이 원추세포의 시냅스 말단부위의 구조적 이상을 유도하여, 노화 생쥐의 원추세포 항상성 균형이 깨짐에 따라 원추세포 특이적인 세포사멸을 유도한다는 것을 밝혀내었다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1 Histone modifications 1
• 1.2 Jumonji domain contained histone demethylase KDM3B 6
• 1.3 Structure and functions of the retina 9
• 2. Materials and Methods 13
• 2.1 Animals 13
• 2.2 Immunohistochemistry 13
• 2.3 Western blot 14
• 2.4 Total RNA isolation and RT-qPCR 15
• 2.5 Library preparation and RNA sequencing 16
• 2.6 Bioinformatical analysis 17
• 2.7 Gene ontology and functional analysis 17
• 2.8 Image analysis 18
• 2.9 statistical analysis 18
• 3. Results 19
• 3.1 Generation of Kdm3b mutant (Kdm3b+/-) mouse 19
• 3.2 Phenotypical characteristics of Kdm3b+/- mouse retina 22
• 3.3 Phenotypical characteristics of rod and cone photoreceptors in Kdm3b+/- mouse retina 26
• 3.4 Haploinsufficiency of Kdm3b induced apoptosis in old mouse retina 32
• 3.5 Up-regulation and down-regulation of gene in Kdm3b+/- mouse retina 37
• 3.6 Clustering of genes-associated with synapse in Kdm3b+/- mouse retina 40
• 4. Discussion 42
• 5. References 44
• 국문초록 50