Studies on microscopic imaging of biomolecules in living organisms with organic fluorescent probes = 생체 내 표적물질의 효율적 영상화 및 유기 형광 프로브에 대한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Section I. Introduction to fluorescent probes and microscopy
Fluorescence methods are particularly useful owing to the widespread use and the development of new functional fluorescent reagents monitoring cellular events with high chemoselectivity. Also it has advantageous features such as high sensitivity, fast-responding time, non-invasiveness, and safe detection using readily available instruments at low costs.
The nature world is a complex collection of elements, ion and molecules that continuously drive a web of interacting chemical reactions. All chemical species undergo dynamic molecular transformations and/or changes in their local environment within the biological milieu; thus, an emerging bio-inspired strategy for fluorescence-based molecular imaging is a suitable methology to sort and identify species of interest within this complex mixture. Therefore, over the last several decades, there has been a remarkable growth in the use of small-molecule fluorescent probes in the biological sciences by tagging non-fluorescent molecules of interest with a fluorescent moiety to visualize the molecules. However, as the tagging strategy involves a large increase in size and the weight, it is not appropriate to apply in monitoring small bio-molecules such as adenosine phosphates, reactive oxygen/nitrogen species, and biothiols. Therefore, reaction based small-molecule fluorescent probes come into the spotlight since it can detect small molecules by minimizing the interference and biorthogonal to the endogenous chemical species.
Section II. Improving the reliability of fluorescence signal in microscopic imaging of cells and tissues
As fluorescence microscopy has been evolved and applied, many fluorescence instrumentations have been invented, improved, supplied, and generalized. Along with the development of instrumentations, fluorescent probes also have been developed to visualize bio-anayltes that researchers are willing to observe. By this time, numerous numbers of small biomolecules have been observed by fluorescent probes designed for each of target analytes with chemoselectivity.
In observing target analytes in living organisms, all the information comes out in the form of a fluorescence signaling (light). Therefore, observations such as tracking the analytes, changes in concentration, and/or changes the form of chemical species are happening by observing and analysing the light. In this aspect, reliability of fluorescence signal should be the number on priority to be ensured. However, even in this moment, many efforts are being made to observe and analyze the fluorescent signal coming out from cells or tissues based on in vitro assay results and/or standard curves obtained in solution; since the environment of cells and tissues are far different with that of solutions, it causes significant errors when it comes to the analysis.
In this section, it is introduced the systematic studies for evaluating reliability of fluorescence signal coming out from cells and tissues with confocal microscopy and two-photon microscopy, repectively. Eventually, the final goal of this section is to suggest the way to improve the reliability of fluorescence signal coming out from living organisms so it diminishes errors in the analysis.
Section III. Ratiometric imaging of biomolecules in intact living organism for quantitative analysis
Recently, spotlight on this research field has moved to the quantitative analysis beyond the observation. However, fluorescent signal itself is highly sensitive to the environment, use of intensity-based probes provides less reliable information on the target analyte. On the other hands, ratiometric probes based on the use of a ratio between two fluorescence intensities allow the correction of errors caused by bleaching, changes in focus, concentration, environmental difference, and variations in laser power. Instead of intensity-based fluorescent probes, therefore, ratiometric type of fluorescent probes are now on focus to develop.
In this section, by applying the ratiometric method with reliable fluorescent signal improved in section II, endogenous biomolcules such as ATP, HCHO, and HOCl are quantitativly imaged in living cells and tissues which imply many of un-revealed informations.

국문 초록 (Abstract)

제 1장. 형광 프로브와 형광 현미경
생체 내 현상을 관측하는 형광 영상화 기법은 생체 물질에 높은 화학적 선택성을 갖는 형광 프로브의 개발과 더불어 발전해 왔으며, 높은 선택성, 빠른 검출 시간, 외과적 수술의 불필요, 안전한 작용기작 등을 장점으로 빠르게 보편화 되었다.
자연계는 다양한 원소, 이온, 분자들이 끊임없이 화학반응을 이어가는 복잡한 계로, 계 내부의 화합물들은 역동적인 분자 구조 변화와 미세 환경 변화 속에 존재한다. 형광분자를 이용한 생체물질의 검출/관측 방식은 복잡한 계 속에서 대상 물질을 구분해 내는데 적합한 특성을 갖는다.
지난 수 십 년간 관측 대상 물질에 형광 물질을 직접 표지 하여 관측하는 실험 방식이 생명 과학 분야에서 괄목 할 만한 성장을 거뒀으나 해당 전략은 결합 고리를 이용한 형광체 표지 과정에서 상당량의 크기와 무게 증가를 동반하기 때문에 분자 단위 혹은 이온과 같은 작은 생체 분자를 검출하는 데 적합하지 않고 주로 단백질, 지질, 핵산 등 상대적으로 크고 무거운 거대분자의 관측 용도로 사용되고 있다.
화학 반응 기반의 형광 프로브는 분자 단위의 작은 크기를 갖고 생체 분자의 생체 내 역할에 대한 방해를 최소화하여 분자 단위나 이온 등의 작은 생체 분자를 검출하는데 적합하다. 해당 특성을 장점으로 각 생체 물질에 선택적인 화학반응을 이용한 형광 프로브들이 설계/개발 되어 오고 있으며, 생명과학분야의 주요 분석 법으로 자리매김 하고 있다.
제 2장. 세포와 조직단위의 형광 영상화 신호의 신뢰도 개선
형광 영상화 분석법이 개발되고 적용되기 시작하면서 여러 종류의 형광 현미경 기기들이 개발, 개선, 보편화 되어왔다. 이와 더불어 한편에서는 다양한 생체 내 생체 물질들을 관측 대상으로 형광 프로브의 발전이 이루어져 왔다. 그 결과, 현재 수많은 종류의 생체 물질들이 각 물질에 선택적으로 반응하는 형광 프로브들의 설계 및 개발을 통해 관측 되었고 검출 가능한 생체 물질의 종류와 검출 형광 특성이 각각의 실험 목적에 따라 다양화 되고 있다.
생체 내 대상 물질 관측에서 모든 정보는 형광 프로브가 방출하는 형광신호(빛)의 형태로 제공된다. 즉, 대상 물질의 추적, 농도의 변화, 화합물의 상 변이 등의 모든 관측은 형광 프로브의 형광 신호를 관측하고 분석하여 이루어진다. 해당 상황을 고려했을 때, 형광 영상화 분석법에서는 형광 신호의 신뢰도가 가장 먼저 확보 되야 한다. 형광체는 주변환경에 의존적인 형광 특성을 보이기 때문에 생체 내에서 나오는 형광 신호의 신뢰도를 확보하기 위해서는 형광 특성 분석 및 적정 곡선의 확보가 세포 내에서 이루어져야 한다. 그러나 지금 이 순간에도 생체 내에서 나오는 형광신호를 용액 상에서 확보 된 형광 특성과 표준 적정 곡선으로 분석하여 수반되고 있는 큰 오류들이 무시 되고 있다.
이 장에서는 세포와 조직에서 나오는 형광 신호를 생체 내에서 체계적으로 분석하여 용액상에서 확보 된 형광 특성 정보와의 오차를 평가해 현재의 분석 방식에 대한 문제점을 지적하고자 한다. 나아가 형광 신호 특성의 세포 내 분석법 및 대중적으로 사용하고 있는 형광체들의 생체 내 형광 특성을 제공하여 궁극적으로는 형광 영상화 분석법의 신뢰도를 개선하고자 한다.
제 3장. 생체 내 생체 분자의 비율기준 영상화와 정량적 분석
최근 연구 결과에서는 형광 영상화를 이용한 생체 물질 정량화 방법의 신뢰도가 인정받고 있다. 기존의 정량화 방법은 주변환경에 민감하게 변하는 형광세기를 기준으로 분석하기 때문에 신뢰도가 낮다는 단점을 갖기에 이를 극복하고자 두 개의 형광 신호 비율을 이용하여 대상 물질을 정량화 하는 비율 기준 감지 방법이 개발되었다. 해당 전략은 광 표백, 현미경 초점의 변화, 농도의 차이, 환경의 변화, 광원의 에너지 변화 등에서 야기되는 형광 세기의 변화를 자가 교정함으로써 신뢰도를 크게 개선했다.
이 장에서는 제 2장에서 개선 된 높은 신뢰도의 형광 신호를 바탕으로 비율기준 감지계를 개발하고 궁극적으로는 신뢰도 높은 정량적 정보를 제공하는 영상화 기술을 제공하고자 한다. 해당 영상화 기술은 아데노신 3인산, 포름알데히드, 하이포아 염소 산 등에 적용 될 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Contents
• Abstract v
• Contents viii
• Abbreviations x
• Section I. Introduction to fluorescent probes and microscopy
• I. Introduction 2
• II. Objective of the research 5
• III. References 6
• Section II. Improving the reliability of fluorescence signal in microscopic imaging of cells and tissues
• Section II-A. Evaluation of in cellulo fluorescent property of old and new dyes in cellular imaging.
• I. Introduction 8
• II. Results and discussion 9
• III. Conclusion 16
• IV. Experimental section 18
• Section II-B. Systematic study of autofluorescence in deep tissue imaging by two-photon microscopy
• I. Introduction 19
• II. Results and discussion 23
• III. Conclusion 36
• IV. Experimental section 37
• V. References 40
• Section III. Ratiometric imaging of biomolecules in intact living organism for quantitative analysis
• Section III-A. Real-time observation of vesicular membrane fusion processes by monitoring endogenous ATP
• I. Introduction 44
• II. Results and discussion 47
• III. Conclusion 60
• IV. Experimental section 62
• V. References 65
• Section III-B. Observation of HCHO distribution in small intestines and colons of mouse
• I. Introduction 67
• II. Results and discussion 70
• III. Conclusion 81
• IV. Experimental section 81
• V. References 85
• Section III-C. Ratiometric imaging of endogenous hypochlorous acid in live cells and tissues
• I. Introduction 88
• II. Results and discussion 91
• III. Conclusion 98
• IV. Experimental section 98
• V. References 101