Functional study of Smug1 by transcriptome analysis of UV-irradiated mouse retina

국문 초록 (Abstract)

우리의 눈은 평생 낮 동안 햇빛에 노출 되지만 대부분의 햇빛은 지구의 대기권에서 반사되거나 눈의 수정체에서 흡수된다. 그러나 소량의 UVB와 UVA는 망막까지 도달한다. 본 연구자는 UVB에 노출된 생쥐 망막 조직에서 노출되지 않은 망막과 다르게 발현하는 mRNA정보를 얻기 위하여 RNA-시퀀싱을 수행하여 전사체 분석을 시도하였다. RNA-시퀀싱 결과, UVB가 조사된 망막에서 다르게 발현하는 623개의 유전자들을 새롭게 발견하였고, 그 중 DNA 손상의 복구 기능을 수행하는 다섯 개의 유전자들을 찾았다. 이들 중 UVB조사에 의해 Smug1 (Single-strand selective monofunctional uracil-DNA glycosylase1) 유전자는 발현이 감소하고 있음을 확인하였다. 또한 Smug1유전자의 mRNA는 다양한 조직에서 발현하지만 특히 망막에서 많이 발현하고 있었고, Smug1은 망막 초기 발생단계에서 mRNA와 단백질 모두 증가되는 양상을 보였지만, 생후 일 년 이후 생쥐의 노화가 진행되면서 발현 량이 감소하는 것을 확인하였다. 특이하게도 Smug1의 mRNA와 단백질 발현이 망막세포들 중 원추세포에서 집중적으로 발현하고 있는 것을 알 수 있었고, 이는 원추세포 손상에 따른 질병과 Smug1의 발현 양상이 서로 연관되어 있음을 보여준다. SMUG1의 기능 분석을 위하여 SMUG1이 많이 발현하는 세포주를 선별하였고, 이 유전자의 발현이 감소 되었을 때 세포 내에서 일어나는 현상을 관찰하기 위하여 인간 간암 세포인 HepG2와 인간배아 신장세포인 HEK293T 세포에서 SMUG1 유전자를 각각 녹아웃 그리고 녹다운 시켰다. 그 결과 SMUG1 유전자가 녹아웃 그리고 녹다운 되어있는 세포주에서 세포의 증식이 감소하였고, 이러한 현상은 세포주기의 변화에 의해 유사분열로 넘어가기 직전 단계인 G2와 M기에서 세포주기가 멈추어 있는 것을 알 수 있었다. 또한 SMUG1의 발현을 저해 시킨 세포에 자외선을 조사하였을 때 세포 내에서 일어나는 현상들을 관찰 한 결과, 세포사멸이 촉진되고 이와 관련된 다양한 단백질들의 발현 량이 증가하는 것을 관찰하였다. 자외선 조사에 의한 세포사멸이 SMUG1 유전자의 결핍에 의해 더욱 촉진된 것인지 확인하기 위하여 SMUG1 녹다운 세포주에 SMUG1 단백질을 과발현 시켰다. 그 결과 SMUG1 녹다운 세포주에서 자외선 조사에 의한 세포 사멸이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 SMUG1이 자외선 조사에 의한 세포 사멸을 저해하는 것을 확인하였고, 연구 결과를 활용하여 SMUG1 유전자의 발현복구를 통해 이 유전자와 관련된 눈 질환 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것이라 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Throughout entire life, the eye is exposed to solar radiation during the daytime but, the most of solar radiation filtered by earth’s atmosphere and lens of the eye. However, some UVB and UVA can reach to the retina. Here, I performed transcriptome analysis of UVB irradiated retina compare to UVB non-irradiated control to obtain the information of mRNA expression as a differentially expressed genes (DEGs). RNA-seq results revealed 623 differentially expressed genes, and five genes were identified as DNA damage repair genes. Among the DNA damage repair genes, I found that the expression of Smug1 (Single-strand selective monofunctional uracil-DNA glycosylase) was decreased by UVB irradiation. Smug1 was expressed in various mouse tissues and especially Smug1 was highly expressed in retina. The mRNA and protein expression of Smug1 was increased in developing mouse retina, but its expression level was decreased in aging mouse retina. Interestingly, the mRNA and protein expression of SMUG1 is highly expressed in cone photoreceptors in the retina, suggesting that Smug1 gene is closely related to the disease caused by damage of cones. First, in order to reveal the function of SMUG1 in the cell lines, SMUG1 gene was knocked out and knocked down in human liver cancer cell HepG2 and human embryonic kidney cell HEK293T cells. In these cell lines, the cellular proliferation rate was significantly decreased, their cell cycle was arrested at G2/M phase immediately before the transition to mitosis. Furthermore, the apoptosis was significantly increased in SMUG1 ablated cells when they exposed to the UV irradiation. The accelerated cell death in SMUG1 deficient cells was recovered by the ectopic expression of SMUG1. It showing that SMUG1 may possess protective roles for UV-mediated DNA damage, and it is possible that gene therapy of SMUG1 might useful treatment for UV damaged eye diseases.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 1.1 Structure of the eye 1
• 1.2 Malfunction of DNA repair and age-related macular degeneration (AMD) 4
• 1.3 The role of SMUG1 in the DNA repair process 8
• 2. MATERIALS AND METHODS 10
• 2.1 Animal use and UV light exposure 10
• 2.2 Retina electroporation 10
• 2.3 Cell culture and transfection 11
• 2.4 Generation of SMUG1 knockout (KO) and knockdown (KD) stable cell lines 13
• 2.5 MTT assay 14
• 2.6 DNA fragmentation assay 14
• 2.7 Immunohistochemistry 15
• 2.8 Immunocytochemistry 16
• 2.9 Western blotting 16
• 2.10 Histone purification 18
• 2.11 Flow cytometry 18
• 2.12 RNA preparation and RT-qPCR 19
• 2.13 Library preparation and RNA sequencing 20
• 2.14 Bioinformatical analysis 22
• 2.15 Gene ontology and functional analysis 22
• 3. RESULTS 24
• 3.1 Transcriptome analysis of UVB irradiated M. musculus retina 24
• 3.1.1 Low-energy UVB irradiation induced phototoxicity in mouse retina 24
• 3.1.2 UVB induces gene up regulation and down regulation in mouse retina 28
• 3.1.3 RT-qPCR validation of RNA-seq data 30
• 3.1.4 Clustering of the UVB-responsive genes 33
• 3.2 Smug1 expression was decreased in UVB irradiated mouse retina 38
• 3.3 Expression of Smug1 mRNA in various tissues 40
• 3.4 SMUG1 expression patterns in various cell lines 44
• 3.5 Generation of SMUG1 knockout (KO) and knockdown (KD) cell lines 46
• 3.6 Down regulation of SMUG1 inhibits cell proliferation and migration ability 50
• 3.7 Impairment of SMUG1 enhances UVC-induced apoptosis 52
• 3.8 SMUG1 expression in SMUG1 KD and KO cells recovers protective effects for UV induced cell death 57
• 4. DISCUSSION 59
• REFERENCES 62
• 국문초록 68