Multiplex PCR과 Real-time PCR 방법을 이용한 Shigella species신속 검출법 고안

국문 초록 (Abstract)

Shigella species는 이질을 일으키는 주요 병원균으로 Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella flexneri와 Shigella sonnei 4종으로 구성되어 있다. 분자생물학적 방법을 이용해 Shigella species를 검출하기 위한 target gene에 대해서 여러 번 선행연구가 진행되어 왔다. 하지만 이러한 기존에 연구된 병원성 gene들은 Escherichia coli로부터 Shigella species를 특이적으로 구별해내지 못한다는 한계점이 있다. 본 연구에서는 Shigellae와 Shigella species 4종에 대해 특이적인 target gene을 선별하고자 Shigella species 4종에 대한 7개의 DNA sequence를 확보하여 사용하였다. Comparative genomics 결과를 기반으로 선별한 gene들을 이용하여 Shigella genus와 각 Shigella species 4종에 특이적인 Primer set들을 제작하였고, Shigella species 4종의 신속 동시 검출을 위해 Multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) 방법을 고안하였다. 제작한 Primer set들은 Shigella species, E. coli, 그리고 다른 균주들의 DNA를 이용하여 PCR을 통해 검증 완료하였다. 또한 본 연구에서는 Shigella species의 정량적인 PCR 분석을 위해 특이 Primer set과 Probe를 제작하여 Shigella species genomic DNA의 copy수를 기반으로 Real-time PCR을 수행하였다. 정량적으로 희석된 genomic DNA를 이용하여 standard curve를 도출하였으며, 이러한 Real-time PCR법은 식품시료에서 Shigella species를 정량적으로 검출하는데 이용가능 할 것으로 기대된다. 본 연구에서 고안한 Multiplex PCR과 Real-time PCR법은 임상미생물학 분야에서 EIEC나 여러 식중독균에 있어서 특이성을 갖는 Shigella species 검출법으로 유용하게 사용될 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Shigella species as major pathogen causing bacillary dysentery are consist of four species as Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella flexneri and Shigella sonnei. For the target gene in detection of Shigella species using molecular biological method, virulence factor genes were used in previous studies, but these virulence factor genes were not enough to distinguish between Shigella species and from enteroinvasive Escherichia coli (EIEC). In this study, specific primer sets of Shigella genus and each 4 species were designed by comparative genomics and a Multiplex PCR method was developed for the accurate detection of 4 Shigella species. Total 7 genomic DNA sequences of 4 Shigella species were usued for comparative genomics for screening specific target genes of Shigellae and 4 species. The Shigella genus and each 4 species-specific expected primer sets were designed from the genes, which screened based on the results of comparative genomics, and evaluated with various genomic DNAs of Shigella, E. coli and other bacterial strains by PCR. Also, in this present study, specific primer sets and probe were designed for quantitative PCR assay to Shigella species and a Real-time PCR was developed based on copy number of genomic DNAs of Shigella species. Quantitative standard curve of Real-time PCR was obtained with quantitatively diluted genomic DNA of Shigella species. This Real-time PCR method will be applicable to the detection and quantification of Shigella species in food sample. These multiplex PCR and real-time PCR for detection of generic Shigella and Shigella species could be a useful tool for accurate detection of Shigella species from EIEC or other closely related food-borne pathogens in the field of clinical microbiology.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서 론
• 1-1. 연구배경 7
• 1-2. 연구목적 10
• 제2장 Multiplex PCR을 이용하여 Shigella 균주를 신속하게 분리 검출하는 방법에 관한 연구
• 2-1. 재료 및 방법 12
• 2-1-1. 균주와 배양조건 12
• 2-1-2. Shigella species의 Genome sequences 12
• 2-1-3. 각 Shigella species에 특이적인 gene sequence를 screening을 위한 Comparative genomics 15
• 2-1-4. Shigellae에 특이적인 DNA frgment screening을 위한 Comparative genomics 16
• 2-1-5. 순수배양액에서의 Template DNA 추출 17
• 2-1-6. Primer 제작 및 PCR 조건 17
• 2-1-7. IAC (Internal amplification control)의 제작과 Multiplex PCR 반응 18
• 2-2. 결과 20
• 2-2-1. Shigellae와 각 Shigella species에 특이적인 Primer design과 gene screening 20
• 2-2-2. Shigellae와 각 Shigella species에 특이적으로 제작한 Primer sets 특이성 확인 21
• 2-2-3. Multiplex-PCR을 위한 Primer sets의 민감도와 특이성 22
• 2-3. 고찰 25
• 제3장 Real-time PCR을 이용하여 Shigella 균주를 신속하게 검출하는 방법에 관한 연구
• 3-1. 재료 및 방법 28
• 3-1-1. 균주와 배양조건 28
• 3-1-2. 순수배양액에서의 Template DNA 추출 28
• 3-1-3. Shigella species 검출과 정량을 위한 primer set과 probe 29
• 3-1-4. Real-time PCR을 이용하여 Shigella species의 standard curve 도출 29
• 3-1-5. Real-time PCR의 반응조건 30
• 3-2. 결과 30
• 3-2-1. Shigella species를 위한 primers와 probe의 특이성 확인 결과 30
• 3-2-2. Shigella species의 정량된 genomic DNA의 Real-time PCR 결과 32
• 3-3. 고찰 45
• 4. 참고문헌 46